Summary
キイロショウジョウバエでは、世紀の1以上にわたり、多くの重要な生物学的過程の分子および細胞基盤を理解するために使用されている遺伝的に行動的に扱いやすいモデル系である。 ショウジョウバエがよく飛ぶ行動の遺伝的洞察を得るために利用されてきた。
Abstract
キイロショウジョウバエ 、ショウジョウバエは、例えば癌、心血管疾患や様々な神経疾患1などのヒト疾患の広い範囲の分子機構を研究するために使用されています。私たちは、幼虫の移動、大人のクライミング能力（リングアッセイ）、 ショウジョウバエの求愛行動を決定するためのシンプルかつ堅牢な行動アッセイを最適化した。これらの行動のアッセイは、ハエの行動に関する遺伝的要因と環境要因の役割を研究するために広く適用されます。幼虫のクロール能力は確実にショウジョウバエの幼虫のクロール能力の早期の変化を決定するため、また、それらの運動に薬やヒト疾患遺伝子の効果を（トランスジェニックハエの）を調べるために使用することができます。彼らがそうでなければ評価することができたところこれらのハエが大人に生きていけないように遺伝子の発現または廃止は、蛹の大人の段階で致死性が発生した場合に幼虫のクロールアッセイは、より適切になります。この基本的なssayは、 ショウジョウバエの幼虫で追加行動反応を調べるために、明るい光やストレスと組み合わせて使用することもできます。求愛行動は広く性的行動の遺伝的基礎を調査するために使用されており、また同様に学習や記憶など、活動との調整を調べるために使用することができます。 ショウジョウバエの求愛行動は、視覚、聴覚、および嗅覚信号を含む様々な感覚刺激の交換を伴う成功した交尾で絶頂に達する十分に特徴付けられ、モータの動作の複雑な一連につながる男女の間に。伝統的な成人登山のアッセイは、（負の走地性）は、異なる試験2月4日の間には有意な変化で、退屈な、労働集約的で、時間がかかります。急速（RING）負の走地性を反復アッセイ図5に示すように 、再現性に敏感な、高スループットのアプローチ大人の運動を定量化すると負の走地性bを提供し、より広く用いられてプロトコルを介して多くの利点がありますehaviors。リングアッセイでは、いくつかの遺伝子または薬物治療は、ハイスループットスクリーニングのアプローチは、実験のほうが従順することで、同時に動物の多数を使用してテストすることができます。
Protocol
A.幼虫クロールアッセイ
1。幼虫コレクション
- ハエの8オンスボトル（10-15男性+女性10月15日）を設定します。
- ハエの明確な瓶その後、ハエは24時間の卵を産むしましょう。 （新しいボトルに大人を転送し、必要に応じて繰り返します）。
- 3-4日のためにボトルをインキュベートし、または3齢幼虫になるまで表示されます。
- 幼虫のボトルに20％ショ糖の100 mlを、20分間放置 - 50を追加します。幼虫は上にフロートします。
- チップと25ミリリットル血清ピペットを用いて収集した幼虫は、カットオフ、およびメッシュバスケットに場所。
- 2倍の脱イオンH 2 Oでメッシュバスケットに幼虫を洗う幼虫は現在の実験の準備が整いました。
2。薬で幼虫を治療する
- 溶液5％スクロース+薬剤を含む5 mlのビーカーに幼虫の希望数を輸送するためにブラシを使用しています。
- 少なくとも15分間幼虫してみましょう。
- メッシュバスケットに薬剤処理した幼虫を入れ、すすいでください。彼らは今、使用する準備が整いました。
3。運動アッセイ（測定総走行距離や体壁の収縮）
- に個々の幼虫を輸送するためにブラシを使用します。
- 0.2センチメートル2グリッドとグラフ用紙の上に、2％アガロース（以前に注ぎ、硬化さ）を含む15センチメートルペトリ皿。
- 1分で交差するグリッド線の数をカウントします。
- 希薄酵母糊液を含有するガラス解剖皿のよく。
- 解剖顕微鏡下で観察しながら1分で蠕動収縮を（後方移動= 1収縮への完全な前方）カウントされます。
- 0.2センチメートル2グリッドとグラフ用紙の上に、2％アガロース（以前に注ぎ、硬化さ）を含む15センチメートルペトリ皿。
- 幼虫の希望する番号がカウントされるまで繰り返します。
B.ラピッド負の走地性（RING）プロトコルを反復
このアッセイは、もともとドでしたガルガーノら 5によってスクライブ。
- 食品（または食品+薬）を含む標準バイアルに光CO 2麻酔と場所の下に新たに浮上して成人男性のハエを収集します。
- CO 2（定常状態薬物濃度の蓄積が適切であれば）からの回復を可能にするために2〜3日室温（ベンチの上に。〜22°C）でハエを維持しています。
- 準備されたポリスチレンバイアルに麻酔なしで 25ハエについて転送します。
- リング装置（図1）にハエのバイアルを組み立てる。
- ハエは15〜20分間、邪魔されず、環境に順応することができます。
- この時間の場所にデジタルカメラの間に装置の前に〜1メートル（プラットフォームバイアルの中間の高さでレンズの中心を揃えるために必要な場合に）、フォーカス、装置の上にカメラをズームし、タイマーを設定する3.0秒。
- 慎重にdistにならないように左手でリング装置のホールドを取るURBは、ハエ、そして右手でタイマーを保持します。
- 急激にタップが難しいバイアルの底にすべてのハエをノックダウンするのに十分であることを保証する、ベンチの表面に三回に装置をシャットダウン]をタップします。
- 第三タップの完成と同時に、3秒のカウントダウンタイマーを起動します。
- 3秒で写真を撮る。
- 1分間タイマーをリセットして起動します。この時間の間にカメラの電源をリセットして装置に焦点を当て、3秒のタイマーの別のチャネルを設定します。
- 1分は、手順1.7から1.10の後に
- 5月6日の試験の合計した後、コンピュータに画像をアップロードして開くようにお気に入りの画像ビューアを使用して、平均身長のスコアは各バイアルのため登った。
- 登った高さの平均を比較して、異なるグループの統計分析を実行します。
Cの求愛と交尾アッセイ
- 午前中にまず最初に、FLIの明確なだけでなく生産のボトルESは、使用することができます。
- 一日のコース（3〜4時間毎）を介して、新たに浮上して性的にナイーブな雄と雌を収集します。
- 媒体とバイアルまたはチューブ内で個別に男性を配置します。
- バイアル/チューブあたり一緒に行われ5-6の女性。
- 5日間暗12時間の明/下25°Cで収集されたハエを分離します。
- 交配ホイールの室に一人の女性を転送します。
- 交配ホイールのチャンバーに1男性を転送します。
- 次の動作のために解剖顕微鏡下でペアを守ってください。
- オリエンテーション（女性に向かって男性向き）
- （男性が女性をタップする）をタップ
- 翼の歌（男性が拡張し、片翼を振動させる）
- （男性が女性の性器を舐める）ブーツ
- カーリング（オス自体は下で腹部をカール）
- 交尾の試み（女性をマウントしようとしたときに、アクティビティをカーリング）
- 1の観察0分または成功した交尾まで、交尾（求愛指数を計算するための）と同様に、首尾よく与えられた動作を実行ペアの数になるまで求愛行動に従事し、それぞれの現象が発生した時刻（待ち時間）、合計時間を記録（周波数）。野生型のペアの100％が一般的に5分以内に交尾します。
- 計算する 交尾までの合計時間で割った求愛で費やされた時間を割って求愛指数（CI）。野生型のペアの場合、これは通常0.6から0.8の間の範囲。
D.描写結果
アッセイをクロール
通常の野生型幼虫は約3センチメートル/分、展示〜1分間に40から50体壁の収縮をさまよいます。我々は最近、障害6を登る幼虫のクロール欠陥の減少寿命と成人を示しています。FUS / TLS関連の筋萎縮性側索硬化症のショウジョウバエモデルを開発した。我々は表現oを対象とし運動ニューロン（OK-371-GAL4ドライバー）へとf野生型とFUS / TLSの変異体は、幼虫のクロールアッセイを行った。以下に示すように、野生型のFUSの発現が約6cmの幼虫のクロール能力が低下し、一方、野生型幼虫は、最大12 cmまでクロールします。 FUS / TLSのALSの原因となる変異R521Cを発現している動物は約1 cm /分をクロールし、それらのクロールの動き（図1）は非常に重度の障害を示しています。
負の走地性リングアッセイ
若い野生型の成虫は、3秒の時間で〜4,5センチ（時間が与えられたために与えられた平均の高さを定義するには、異なる株または活性レベルに対応するために3秒から調整することができ、平均登山高さを持つべきひずみ/処理）。下部に残っているハエは、0の値が割り当てられています。それがその後の高さを測定するために、個々のフライの位置を決定することが困難になるので、バイアルあたり25以上のハエを使用することをお勧めされていません。 NOの脱感作は、我々が採用していることを離れて1分間隔で6つの連続した試験までに観察されている。それは、使用されるバイアルに入れ、新しいハエは新鮮なバイアルと同程度に上昇しないので、収集されたデータの初期セットの後に、このアッセイにおけるポリスチレンのテストバイアルを再使用しないことが重要です。
図1。リングアッセイのセットアップ。デジタルカメラは、ポリスチレンバイアル中にハエを含む装置の前に〜1メートルに配置されています。装置の上にカメラをフォーカスとズーム、および3.0秒にタイマーを設定します。
図2。を使用して幼虫のクロールアッセイからの代表的なデータは、異所性運動ニューロンドライバ（OK371-GAL4）の制御下にUAS-FUS WTと、UAS-FUS R521Cを表現飛ぶ。
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Discussion
ショウジョウバエの行動は密接に遺伝的要因と環境要因によって調節される。我々は、他のものは、以前の行動やショウジョウバエ 5-19にモデル化する人間の神経変性疾患への飛行に関連する遺伝子を調べるためにデータを収集するためにここで説明するアッセイを使用しています。クロールアッセイのために、第3齢幼虫の慎重な選択が重要なステップです。薬で治療する場合、それは良好な溶解性を持っている場合、最大の効果を得るために（またはそれ以上の薬物の種類や性質に応じて）10〜15分かかります。したがって、我々は定期的に餌を15分間薬剤を飛ぶし、テストする前に、さらに15分待ちます。それは、溶液中の薬物濃度を維持するために、しかし、重要であり、治療群間の露光時間、正確な比較のために同じです。 CNS活性薬剤は、通常、持続的な最大の効果〜45分を持ちます。幼虫はフライ食品を除去するために選択（または授乳を掘った）の後によく洗浄しなければならないと許可され、クロールアッセイを開始する前に1分間馴化。低い温度は幼虫のクロール能力に影響を与えることができるように寒天プレートは、1時間室温（〜22℃）に保たれるべきである。幼虫のクロールアッセイは活動レベルに関する重要な情報を提供することができますが、微妙な調整赤字の分析には適していません。したがって、スクリーニングのプラットフォームとして、それは総活動の赤字を調べる最初のパスに最も適しています。
微細運動の調整を伴う成人の動作は、求愛と交尾です。この動作は、ヒト疾患に関連する行動の側面を調べるために使用され、微細なモータ制御18に加えて、感覚処理（音響、視覚、嗅覚）が含まれています。男性が女性に気づいたとき、彼は方向の動作（に向かって回し、メスを追いかけて）を持つステレオタイプのパターンの先頭で進行求愛の儀式を開始します。これはwingsong、なめるが続いているgであり、女性に向かって腹部のカール、女性genetaliaのタッピング、分20から22までの数十続くことができる交尾、で最高潮に達します。求愛の側面の多くは視覚的な手がかりを含んでいるので、暗い場所では、交配性能の劣化につながる、とハエが互いに参照できるように、アッセイは、十分な光で行う必要があります。したがって、白い目のショウジョウバエは、通常、私たちの記載のアッセイで非常にパフォーマンスの低下を持っている読者は、このプロトコルでそれらを利用した実験を計画しないことをお勧めします。薬でハエを治療する、培地中に薬を置く場合はハエで隔離されている（例えば、1％アガロース+ 10％ショ糖+薬の代わりに、標準的な食品中の微生物によって薬剤のいずれかの可能性の劣化を避けるために、薬で治療する食品）。一般に、ハエは綿と差し込まれ、その中に食品の300〜500ミリリットルを持っている5mlの試験管に分離されています。交配ホイールへの転送のためにハエを麻酔しないでください。それは私sは非常によく間で交配ホイールを洗うのが絶対的に重要残留フェロモンを（その後、振とうしながら脱イオン水で最小の48時間洗浄し、振とうしながら一晩alconox石鹸少量の温水、水の多数の変更）を削除するために使用。我々が記述するアッセイを行う別の考慮事項は、天気です。我々の経験では雨が降ったり、雨が降るように見えるときは、裁判所はありません飛ぶ。彼らは研究室では、ウィンドウを持っているかどうかにかかわらず、明るい晴れた日にベストを実行します。我々の現在の理論は、この現象は大気圧に関連していることですが、私たちはこれを検討していません。
伝統的な負の走地性アッセイは、10秒（に記載されに所定の高さの上に登るどのように多くのハエの測定に依存していますhttp://www.jove.com/details.php?id=2504 ）。我々は、リングアッセイは、従来のアッセイ上の特定の利点があると信じています。一つはtであるhroughput、6のように独立した標準的なアッセイのいずれかと比較して同時に測定することができます複製され、システムは、一般的にスケーラブルです。定義された時間内に登って平均身長が定量化されているため、別のではなく、絶対的な高さのパス/フェイル番号感度である。このアプローチを使用して、より微妙な赤字が観察されることがあります。ため、スループットのレベルの、アッセイは、より多くの退屈な伝統的な負の走地性アッセイよりも画面に適しています。さらに、Garagano ら （2005）は、さらにスループットを増加させる採用の場合、コンピューター採点方法について説明します。このアッセイの主要な考慮事項は、それはハエがテストの前に麻酔をかけていないことが肝要であることと、ハエの新しいバッチがテストされる前に、新鮮なバイアルは試験の与えられたセットの後に使用されている。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、幼虫のクロールデータを生成するためAstha Maltareに感謝します。私たちは、原稿上の彼のコメントを与えるために博士はニコラス·ランソン·ジュニアに感謝します。この作品は、ジョンズホプキンス大学でALSのためにロバートパッカードセンター（UBP）および筋萎縮性側索硬化症協会（UBP）がサポートされていました。と国立精神衛生研究所（CDN）からR01MH083689。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 6 oz Drosophila bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Paint Brush (#1) | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Cornmeal | Fisher Scientific | NC9109741 | |
| Agar | Genesee Scientific | 66-104 | |
| Molasses | Fisher Scientific | NC9349176 | |
| Propionic acid | Acros Organics | 14930-0010 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Yeast | Genesee Scientific | 62-107 |
References
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