Summary
果蝇是一种基因和行为听话的模型系统已用于了解一个多世纪1的基础上的许多重要的生物过程的分子和细胞， 果蝇已经得到了很好的利用获得到飞行为的遗传基础的见解。
Abstract
果蝇 ，果蝇，已用于研究的范围广泛的人类疾病，如癌症，心血管疾病及各种神经系统疾病的分子机制。我们已经优化了简单和强大的行为分析，确定幼虫的运动，成年的爬坡能力（环法），对果蝇的求偶行为。这些行为的分析是研究遗传和环境因素对飞行为的作用，广泛适用。幼虫爬行能力，能可靠地用于确定在果蝇幼虫爬行能力的早期阶段的变化，并检查他们的运动，药物或人类疾病基因的影响（转基因果蝇）。幼虫爬行检测变得更适用，如果一个基因的表达或取消导致蛹或成人阶段的杀伤力，因为这些苍蝇不活到成年，他们可以评估。这基本也可用于ssay配合明亮的光线或应力研究果蝇幼虫额外的行为反应。求偶行为已被广泛用于研究遗传基础的性行为，也可用于检查活动和协调，以及学习和记忆。 果蝇求偶行为涉及的各种感官刺激，包括视觉，听觉和化学感应信号交换之间的男性和女性，导致一系列复杂的特点以及电机最终成功交配行为。传统的成人攀岩检测（负geotaxis），单调乏味，劳动密集，耗时2-4不同试验之间的显着变化，。快速迭代5负geotaxis（环）法有许多优势，更广泛采用的协议，提供了一个重复性好，灵敏度高，高通量的方法来量化成人运动和消极geotaxis behaviors。在环法，几个基因型或药物治疗，可以同时使用大量的动物测试，高通量的方法筛选试验更适合。
Protocol
A.幼虫爬行法
1。幼虫收集
- 成立8盎司一瓶苍蝇（10-15男性10-15女性）。
- 让苍蝇奠定24小时的卵子，然后明确瓶苍蝇。 （转移到一个新瓶的成年人，并在必要时重复）。
- 孵育瓶为3-4天，或直至三龄幼虫均可见。
- 添加50 - 100毫升20％的蔗糖与幼虫的瓶子，让坐了20分钟。幼虫会浮到顶端。
- 收集的幼虫用25毫升血清吸管尖端切断，成网状篮子的地方。
- 洗两次去离子H 2 O幼虫在网篮幼虫为实验做好准备。
2。治疗药物的幼虫
- 用刷子刷到5毫升的烧杯中含有一种解决方案蔗糖5％+药物输送所需数量的幼虫。
- 让至少15分钟的幼虫饲料。
- 网状筐倒入药物治疗的幼虫和冲洗。他们现在已经准备好使用。
3。运动检测（测量总距离行驶或体壁收缩）
- 用刷子个别运输幼虫到：
- 15厘米的培养皿中含有超过0.2厘米2格方格纸，2％琼脂糖（以前浇，并允许变硬）。
- 计数在1分钟内越过网格线的数目。
- 良好的玻璃夹层菜含有稀释的酵母膏溶液。
- 解剖显微镜下观察，计数在一分钟内蠕动收缩（全前后运动= 1收缩）。
- 15厘米的培养皿中含有超过0.2厘米2格方格纸，2％琼脂糖（以前浇，并允许变硬）。
- 重复，直到幼虫所需的数字已经算。
B.快速迭代负geotaxis（环）协议
此法德scribed由加尔加诺等 5。
- 收集到一个标准的小瓶含食品（或食物+药物）新出现的光CO 2麻醉和地方的成年男性苍蝇。
- 在室温下保持苍蝇（台式〜22°）为2-3天，以便从CO 2回收（稳态药物浓度的积累，如果适当）。
- 无需麻醉准备聚苯乙烯瓶约25苍蝇转让。
- 苍蝇瓶组装成环装置（图1）。
- 让苍蝇的环境，不受干扰15-20分钟，以适应新环境。
- 在此期间，地方的数码相机〜1米（在一个平台上，如果有必要的镜头对准中旬高度小瓶中心）在前面的仪器，集中和放大到仪器的摄像头，并设置一个计时器3.0秒。
- 仔细举行的环器具用你的左手，以免区URB的苍蝇，并保持用右手的计时器。
- 大幅挖掘设备上的三次替补的表面，确保水龙头击倒所有的苍蝇瓶的底部是很难足够。
- 同时完成第三自来水，开始倒数计时3秒。
- 在三秒钟拍摄一张照片。
- 1分钟复位定时器和启动。在此期间，重置设备上的摄像头和重点，并另设三秒钟的定时器通道。
- 1分钟后，重复步骤1.7-1.10
- 共5-6次试验后，上传到电脑的图像，并使用您最喜爱的图像浏览器打开，并得分的平均身高为每个小瓶攀升。
- 进行统计分析，对不同群体比较，平均身高增长。
C.求爱和交配实验
- 在早晨的第一件事，明确生产FLI瓶要使用的ES。
- 在一天的课程（每3-4小时），收集新出现的性幼稚的男性和女性：
- 介质的小瓶或管分别放置男性。
- 每瓶/管放置5-6女性。
- 在25°C下12小时的光/暗为5天的隔离收集苍蝇。
- 转移到交配轮室的一名女性。
- 传送一个男性的交配轮腔。
- 解剖显微镜下观察，对有下列行为：
- 取向（男性对女性的定向）
- 攻丝（男性水龙头女性的）
- 永歌（男延伸和振动一翼）
- 舔（男舔女性生殖器）
- 冰壶（男性卷发下腹部）
- 交配尝试（冰壶活动，而试图装入女）
- 观察10分钟或直至成功交配，注意到每个行为发生的时间（潜伏期），从事直到交配求偶行为（计算的求偶指数），以及对数，成功地执行一个给定的行为的总时间（频率）。 100％的野生型对一般会在5分钟内交配。
- 计算 求爱指数（CI）的时间除以花求爱除以直到交配的总时间。对于野生型对这个范围通常在0.6-0.8之间。
D.代表结果
爬行法
正常野生型幼虫会徘徊〜3厘米/分钟，和展览〜40-50体壁收缩，在一分钟内。最近，我们已经制定了相关的FUS / TLS-肌萎缩性侧索硬化症，幼虫爬行缺陷，减少寿命和成人攀岩减值6果蝇模型。我们有针对性的表达Øf野生型和突变形式的FUS / TLS的运动神经元（OK-371-GAL4驱动器），并进行了幼虫爬行检测。如下图所示，野生型幼虫爬至12厘米，而野生型的FUS的表达下降约6厘米的幼虫爬行能力。表达的FUS / TLS的ALS的致病突变R521C的动物展示在他们的爬行运动非常严重受损（图1），爬行大约只有1厘米/分钟。
负geotaxis环法
年轻的野生型成蝇，应该有一个3秒的时间在4-5厘米（3秒的时间可以从调整，以适应不同品系或活动水平定义为一个给定的一个给定的平均身高平均爬升高度应变/处理）。保持在底部的苍蝇，被分配一个0值。不建议使用超过25％小瓶苍蝇，因为它然后变得难以确定每一个人的苍蝇来衡量高度的位置。 ñØ脱敏已被观察到，在间隔1分钟，除了我们已经聘请了连续6个试验。关键是不重用初始数据集后，在本实验聚苯乙烯测试小瓶收集，因为到用小瓶放在新苍蝇不会爬新鲜小瓶到相同的程度。
图1。安装环检测。数码相机被放置在含有聚苯乙烯瓶苍蝇的仪器前约1米;对焦和变焦相机到设备，并设置一个计时器，以3.0秒。
图2。代表数据果蝇幼虫爬行使用检测异位表达的UAS-Fu的野生和UAS-Fu的控制下运动神经元驱动（OK371-GAL4）R521C。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
果蝇的行为是严格受遗传和环境因素。我们和其他人，以前使用这里描述的实验，收集数据，检查飞的行为，并在果蝇 5-19仿照人类神经退行性疾病相关的基因。 第三龄幼虫爬行分析，慎重选择是关键的一步。如果用药物治疗，它会采取10-15分钟（或更取决于药物的类型和性质），以达到最大的效果，如果有良好的溶解性。因此，我们经常喂药物飞行15分钟，然后等待一个额外的15分钟前测试。然而，重要的是，保持在溶液中的药物浓度，治疗组之间的曝光时间，准确的比较。中枢神经系统活性药物通常都会有一个最大的效果持久〜45分钟。应洗好后，选择（或挖喂养）消除苍蝇食品和幼虫1分钟前开始爬行法允许水土不服。琼脂平板应保持在室温（〜22℃），一个小时，低温可以影响幼虫爬行能力。虽然幼虫爬行检测，可以提供重要的信息，有关活动水平，这是不适合的微妙协调财政赤字的分析。因此，作为一个筛选平台，它是最适当的检查活动的赤字总额的第一个通。
一个成年人的行为，涉及精细动作的协调是求偶和交配。这种行为已被用于研究人类疾病有关的行为的各个方面，涉及处理感官（嗅觉，视觉，听觉），除了罚款电机控制18。当一个男性发现女性，他发起了求爱仪式，在与取向的行为（转向和追逐女性）的刻板模式开始进展。这是其次，lickin wingsongg和攻牙女性genetalia，对女性的腹部卷曲，并在交配，它可以持续几十分钟20-22高潮。因为求爱的许多方面涉及的视觉线索，黑暗条件下导致了交配性能的退化，并应具有足够的光线进行检测，使苍蝇可以看到彼此。因此，白色眼睛的苍蝇通常我们描述实验中的表现极差，读者对规划的实验，他们利用这个协议的建议。如果用药物治疗的苍蝇，放入培养基药物苍蝇被隔离（如1％琼脂糖+蔗糖10％+的药物，而不是标准的食品与药物治疗时，以避免任何可能降解的药物中的微生物食品）。一般苍蝇被隔离到5毫升的试管中有300-500毫升的食品，在他们与棉花堵塞。 不要麻醉转移到交配轮的苍蝇。它，我绝对关键洗交配很好轮之间使用，以消除任何残留的费洛蒙（少量过夜alconox肥皂温水，用颤抖的，最低的48个小时去离子水冲洗，然后用颤抖的，无数的变化和水） 。执行我们所描述的实验时，另一个需要考虑的是天气。在我们的经验，苍蝇不会告上法庭，如果下雨或看起来会下雨。他们的表现最好在阳光明媚的日子，无论是实验室有窗户或没有。目前，我们的理论是，这种现象与大气压力，但我们还没有研究这个。
传统的的的负面geotaxis检测依赖于测量有多少苍蝇爬预定在10秒（中所述的高度http://www.jove.com/details.php?id=2504 ）以上。我们相信，环法有一定的优势超过了传统的检测。一个是throughput，为六个独立的复制可以同时测量标准检测相比，该系统一般可伸缩。另一个是灵敏度，因为平均身高被量化，而不是一个合格/不合格的绝对高度数，在规定的时间内攀升。使用这种方法，可以观察到更微妙的赤字。由于吞吐量的水平，该法更适合屏幕比传统的负面geotaxis检测更繁琐。此外，Garagano 等。（2005）描述了电脑计分法，如果将进一步增加吞吐量。此法的主要考虑是，它是必要的，苍蝇不麻醉测试前，新鲜瓶是用于给定的试验后，一批新的苍蝇测试之前。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们要感谢Astha Maltare产生的幼虫爬行数据。我们要感谢博士尼古拉斯·兰森小的手稿给他的意见。为ALS在约翰霍普金斯大学的罗伯特·帕卡德中心（百联）和肌萎缩性侧索硬化症协会（百联）;和支持这项工作是从国家精神卫生研究院（CDN），R01MH083689。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 6 oz Drosophila bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Paint Brush (#1) | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Cornmeal | Fisher Scientific | NC9109741 | |
| Agar | Genesee Scientific | 66-104 | |
| Molasses | Fisher Scientific | NC9349176 | |
| Propionic acid | Acros Organics | 14930-0010 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Yeast | Genesee Scientific | 62-107 |
References
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature Mar. 23 (6776), 394-398 (2000).
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nat. Med. 8 (11), 1185-1186 (2000).
- Whitworth, A. J., Theodore, D. A., Greene, J. C., Benes, H., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Increased glutathione Stransferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Lanson, N. A., Maltare, A., King, H., Smith, R., Kim, J. H., Taylor, J. P., Lloyd, T. E., Pandey, U. B. A Drosophila model of FUS-related neurodegeneration reveals genetic interaction between FUS and TDP-43. Hum. Mol. Genet. 20 (13), 2510-2523 (2011).
- Batlevi, Y., Martin, D. N., Pandey, U. B., Simon, C. R., Powers, C. M., Taylor, J. P., Baehrecke, E. H. Dynein light chain 1 is required for autophagy, protein clearance, and cell death in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (2), 742-747 (2010).
- Sang, T. K., Chang, H. Y., Lawless, G. M., Ratnaparkhi, A., Mee, L., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Krantz, D. E., Jackson, G. R. A Drosophila model of mutant human parkin-induced toxicity demonstrates selective loss of dopaminergic neurons and dependence on cellular dopamine. J. Neurosci. 27 (5), 981-992 (2007).
- Stacey, S. M., Muraro, N. I., Peco, E., Labbé, A., Thomas, G. B., Baines, R. A., van Meyel, D. J. Drosophila glial glutamate transporter Eaat1 is regulated by fringe-mediated notch signaling and is essential for larval locomotion. J. Neurosci. 30 (43), 14446-14457 (2010).
- Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
- Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
- Nedelsky, N. B., Pennuto, M., Smith, R. B., Palazzolo, I., Moore, J., Nie, Z., Neale, G., Taylor, J. P. Native functions of the androgen receptor are essential to pathogenesis in a Drosophila model of spinobulbar muscular atrophy. Neuron. 67 (6), 936-952 (2010).
- Lorenzo, D. N., Li, M. G., Mische, S. E., Armbrust, K. R., Ranum, L. P., Hays, T. S. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell Biol. 189 (1), 143-158 (2010).
- Wang, J. W., Brent, J. R., Tomlinson, A., Shneider, N. A., McCabe, B. D. The ALS-associated proteins FUS and TDP-43 function together to affect Drosophila locomotion and life span. J. Clin. Invest. , (2011).
- Choi, J. K., Jeon, Y. C., Lee, D. W., Oh, J. M., Lee, H. P., Jeong, B. H., Carp, R. I., Koh, Y. H., Kim, Y. S. A Drosophila model of GSS syndrome suggests defects in active zones are responsible for pathogenesis of GSS syndrome. Hum. Mol. Genet. 19 (22), 4474-4489 (2010).
- Ruan, H., Wu, C. F. Social interaction-mediated lifespan extension of Drosophila Cu/Zn superoxide dismutase mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (21), (2008).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Becnel, J., Johnson, O., Luo, J., Nässel, D. R., Nichols, C. D. The serotonin 5-HT7 Dro receptor is expressed in the brain of Drosophila, and is essential for normal courtship and mating. PLoS One. 6 (6), e20800 (2011).
- Johnson, O., Becnel, J., Nichols, C. D. Serotonin 5-HT(2) and 5-HT(1A)-like receptors differentially modulate aggressive behaviors in Drosophila melanoga- ster. Neuroscience. 158 (2), 1292-1300 (2009).
- Bastock, M., Manning, A.
- Greenspan, R. J., Ferveur, J. F.
- Villella, A., Hall, J. C. Neurogenetics of courtship and mating in Drosophila. Adv. Genet. 62, 67-184 (2008).
