Summary
DROSOPHILA MELANOGASTER является генетически и поведенчески послушный модели системы, которая была использована, чтобы понять молекулярные и клеточные основы многих важнейших биологических процессов на протяжении более века 1. Дрозофилы было хорошо использовали, чтобы получить понимание генетической основы лету поведения.
Abstract
DROSOPHILA MELANOGASTER, дрозофилы, была использована для изучения молекулярных механизмов широкого спектра заболеваний человека, таких как рак, сердечно-сосудистых заболеваний и различных неврологических заболеваний 1. Мы оптимизировали простой и надежной поведенческие тесты для определения личиночных передвижения, взрослым возможность восхождения (RING анализа), и ухаживания поведения дрозофилы. Эти поведенческие тесты широко применяются для изучения роли генетических и средовых факторов на лету поведение. Личинок возможность сканирования могут быть надежно использованы для определения ранней стадии изменения в обход способности личинок дрозофилы, а также для изучения влияния лекарств или генов человека заболевания (у трансгенных мух) на их передвижение. Личиночной анализ сканирования становится все более применима, если выражение или отмены ген вызывает летальность в куколки или взрослой стадии, так как эти мухи не доживают до взрослого, где они в противном случае могут быть оценены. Это основнойssay также может быть использован в сочетании с ярким светом или стресс изучить дополнительные поведенческие реакции у личинок дрозофилы. Ухаживание поведение широко используется для исследования генетических основ сексуального поведения, а также может быть использована для изучения деятельности и координации, а также обучения и памяти. Drosophila брачного поведения включает в себя обмен различных сенсорных стимулов, включая визуальные, слуховые и хемосенсорной сигналы между мужчинами и женщинами, которые приводят к сложной серии хорошо характеризует поведение двигателя кульминацией успешного спаривания. Традиционное восхождение взрослых анализы (отрицательный geotaxis) являются утомительным, трудоемким и занимает много времени, со значительным изменением различных испытаний 2-4. Быстрый итеративный отрицательный geotaxis (RING) анализ 5 имеет множество преимуществ перед более широко используются протоколы, обеспечивающие воспроизводимое, чувствительный, и высокая пропускная способность подхода к количественному опорно-двигательного взрослых и отрицательные geotaxis бehaviors. В кольце анализа, несколько генотипов или медикаментозного лечения может быть проверена одновременно с использованием большого количества животных, с высокой пропускной способностью подход делает его более сговорчивым для скрининга экспериментов.
Protocol
А. Анализ личинок Crawling
1. Личинки коллекции
- Установка 8 унций бутылку мух (10-15 мужчин + 10-15 женщин).
- Давайте мухи откладывают яйца в течение 24 часов, затем снимите бутылку мух. (Передача взрослых в новую бутылку и повторять по мере необходимости).
- Инкубируйте бутылку в течение 3-4 дней, или до третьего возраста личинки видны.
- Добавить 50 - 100 мл 20% сахарозы в бутылку с личинками и оставьте на 20 минут. Личинки всплывают наверх.
- Сбор личинок помощью 25 мл пипетки серологические кончиком отрезаны, и место в сетку корзины.
- Вымойте личинок в сетку корзины в два раза деионизированной H 2 O. Личинки готов к экспериментам.
2. Для лечения личинок с наркотиками
- Используйте щетку для транспортировки нужное количество личинок 5 мл стакан, содержащий раствор 5% сахарозы + наркотиков.
- Давайте личинки питаются в течение 15 минут.
- Налейте наркотиков обработанных личинок в сетку корзины и полоскания. Теперь они готовы к использованию.
3. Опорно-двигательного анализ (измерение общее расстояние, пройденное или сокращениями стенки тела)
- Используйте щетку для перевозки отдельных личинки:
- 15 см, чашки Петри, содержащие 2% агарозном (ранее налил и позволили, чтобы укрепиться) на миллиметровой бумаге с 0,2 см 2 сетки.
- Подсчитать количество линий сетки пересекаются в 1 минуту.
- Ну стеклянной посуде рассечение содержащий разбавленный раствор пасты дрожжей.
- Граф перистальтику сокращений (полного переднего до заднего движения = 1 сжатие) в течение одной минуты, соблюдая при вскрытии микроскопом.
- 15 см, чашки Петри, содержащие 2% агарозном (ранее налил и позволили, чтобы укрепиться) на миллиметровой бумаге с 0,2 см 2 сетки.
- Повторяйте, пока желаемое количество личинок были подсчитаны.
Б. Быстрое итеративный отрицательный geotaxis (RING) протокола
Этот анализ был первоначально де-описывается Гаргано и др. 5.
- Соберите вновь появился взрослый самец мухи под свет CO 2 обезболивания и поместить в стандартный флакон с пищей (или питание + лекарство).
- Поддерживать мух при комнатной температуре (от настольных. ~ 22 ° C) в течение 2-3 дней, чтобы обеспечить восстановление CO 2 (и накопление стационарного уровня препарата в случае необходимости).
- Передача около 25 мух без обезболивающего, чтобы подготовленные ампулы из полистирола.
- Соберите флаконах с мухами в кольцо аппарата (рис. 1).
- Позвольте мух, чтобы акклиматизироваться к окружающей среде, спокойно, в течение 15-20 минут.
- За это время камера место цифровой ~ 1 м в передней части аппарата (на платформе, если это необходимо для выравнивания центра линзы на середине высоты ампулы), фокусировки и масштабирования камеры на аппарате, а также установить таймер 3,0 секунды.
- Осторожно возьмитесь за кольцо аппарат левой рукой, чтобы не расстояниеУрО мух, и удерживайте таймер с правой рукой.
- Резко нажмите на аппарате вниз на поверхность скамьи в три раза, убедившись, что кран достаточно сильно, чтобы сбить все мухи на дно флакона.
- Одновременно с завершением третьего крана, начать 3 секунды таймер обратного отсчета.
- В три секунды сфотографировать.
- Сброс таймера в течение 1 минуты и начать. За это время сбросить камеру и сосредоточиться на аппарат, и установить еще один канал таймера в течение трех секунд.
- Через 1 минуту, повторите шаги 1.7-1.10
- После всего 5-6 исследования, загружать изображения на компьютер и использовать ваш любимый просмотрщик изображений, чтобы открыть и набрать среднюю высоту поднялись для каждого флакона.
- Выполнить статистический анализ на различных группах сравнения средняя высота поднялся.
С. ухаживания и спаривания Пробирной
- Первое, что утром, ясно и производству бутылок FLIх годов, которые будут использоваться.
- В течение дня (каждые 3-4 часа), собирать вновь появилась сексуально наивных мужчин и женщин:
- Место мужчины индивидуально во флаконах или пробирках со средой.
- Поместите 5-6 женщин вместе в одном флаконе / трубы.
- Изолировать собранных мух при 25 ° С до 12 часов свет / темнота в течение 5 дней.
- Передача одной женщины в камеру спаривание колес.
- Передача одного мужчину в камеру спаривание колес.
- Соблюдайте пара при вскрытии микроскоп для следующего поведения:
- Ориентация (мужчина ориентируется на женщин)
- Нажатие (мужчина стучит женщина)
- Крыло песня (мужской расширяется и вибрирует одно крыло)
- Лизание (мужчина лижет женские гениталии)
- Керлинг (мужчины кудри его живот под себя)
- Спаривание попытка (Свернувшись деятельности при попытке установить женщин)
- Соблюдайте 10 минут или до успешного спаривания, отметив, что время, в которое происходит каждый (задержки), общее время занимался в брачном поведении до совокупления (для расчета индекса ухаживания), а также число пар, которые успешно выполняют данное поведение ( частота). 100% диких пар типа обычно спариваются в течение 5 минут.
- Вычислять ухаживание индекс (СИ), разделив время, проведенное в ухаживании, деленное на общее время до совокупления. Для диких пар типа это обычно колеблется в пределах 0,6-0,8.
D. Результаты представитель
Сканирование анализа
Нормальный дикий тип личинка будет блуждать ~ 3 см / мин, и выставки ~ 40-50 стенки тела сокращений в минуту. Недавно мы разработали модель Drosophila ФУЗ / TLS связанных бокового амиотрофического склероза, который показывает личиночной сканирование дефектов, снижение продолжительности жизни и взрослых восхождение нарушения 6. Мы планировали выражение ое дикого типа и мутантных форм FUS / TLS для моторных нейронов (ОК-371-GAL4 водителем) и выполнил личиночной анализ сканирования. Как будет показано ниже, диких личинок типа сканирования до 12 см, в то время как выражение дикого типа FUS снизилась личиночной ползать способность примерно 6 см. Животные выражения ALS вызывающие мутации R521C в FUS / TLS обладают очень тяжелыми нарушениями в обход движения (рис. 1), ползание лишь около 1 см / мин.
Отрицательный анализ RING geotaxis
Молодые дикого типа мухи взрослых должны иметь среднее восхождение высотой ~ 4-5 см в 3 секунды времени (время может быть в диапазоне от 3-х секунд для размещения различных штаммов или уровни активности для определения заданной средней высоты для данного напряжение / лечение). Мухи, которые остаются на дне присваивается значение 0. Не рекомендуется использовать более 25 мух в одном флаконе, потому что становится трудно определить место каждого лету для измерения высоты. Nо десенсибилизация наблюдалась со скоростью до 6 последовательных испытаний расстоянии 1 минуты друг от друга, у нас работает. Очень важно не для повторного использования полистирола тестирования флаконов в этом тесте после первого набора данных собраны, потому что новые мухи помещается использовать флаконы не вырастет в той же степени, как в свежем ампул.
Рисунок 1. Установки для RING анализа. Цифровая камера помещается ~ 1 м в передней части устройства, содержащие мух в полистирола флаконах; фокус и зум камеры на аппарате, а также установить таймер до 3,0 секунд.
Рисунок 2. Представителю данные из личиночной анализ сканирования использовании мух эктопически выражения UAS-FUS WT, и UAS-FUS R521C под контролем водителя двигательных нейронов (OK371-GAL4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila поведение жестко регулируется генетическими и экологическими факторами. Мы и другие, которые ранее использовались тесты, описанные здесь, чтобы собрать данные для изучения генов, связанных с поведением летать и нейродегенеративных заболеваний человека моделируется в Drosophila 5-19. Для обхода анализа, тщательного отбора из 3-го возраста личинки очень важный шаг. Если лечение с наркотиками, это займет 10-15 минут (или больше в зависимости от типа и характера наркотиками), чтобы достичь максимального эффекта, если он имеет хорошую растворимость. Поэтому мы регулярно кормить мух препарата в течение 15 минут, а затем ждать еще 15 минут до тестирования. Важно, однако, сохранить концентрации препарата в растворе, а также экспозиции, между группами лечения одинаковы для точного сравнения. ЦНС активных препаратов, как правило, имеют максимальный эффект прочного ~ 45 минут. Личинки должны быть вымыты и после выбора (или выкопанный питание), чтобы удалить лету питания ипозволило акклиматизировались в течение 1 минуты до начала обхода теста. Агар пластины должны храниться при комнатной температуре (~ 22 ° C) в течение часа, а низкая температура может повлиять на личиночной возможность сканирования. Несмотря на личиночной анализ сканирования могут предоставить важную информацию относительно уровня активности, он не подходит для анализа тонких дефицит координации. Таким образом, в качестве скринингового платформе является наиболее подходящим для первого прохода изучения валовой дефицит деятельности.
Поведение взрослых, которая включает тонкой координации двигатель ухаживания и спаривания. Такое поведение было использовано для изучения аспектов поведения человека, имеющие отношение к болезни, и включает в себя сенсорную обработку (обонятельные, зрительные, акустический) в дополнение к тонкой управления двигателем 18. Когда самец замечает самку, он начинает ритуал ухаживания, которая прогрессирует в начале стереотипа модель с ориентацией поведения (поворот в сторону и в погоне за женщин). Это сопровождается wingsong, Lickinг и нажав женского genetalia, щипцы для живота к женщине, и завершается в совокупление, которое может длиться несколько десятков минут 20-22. Поскольку многие аспекты ухаживания включают визуальные подсказки, темно условия приводят к ухудшению производительности спаривания, и анализы должны проводиться при достаточном освещении, так что мухи могут видеть друг друга. Таким образом, белые глаза мухи, как правило, очень низкая производительность в нашем тесте описаны и читателей высказались против планирования экспериментов их использования с этим протоколом. Если лечение мух с наркотиками, положите наркотиков в среде мухи, изолированные на (например, 1% агарозном + 10% сахарозы + наркотиков вместо стандартной пищи при лечении с наркотиками, чтобы избежать любого возможного ухудшения препарата микроорганизмами в питание). Как правило, мух изолированы в 5 мл пробирки, которые имеют 300-500 мл питания в них, подключены с хлопком. НЕ обезболить мух для передачи спаривание колес. Это яабсолютно критической для мытья колес спаривания очень хорошо между используется, чтобы удалить остатки феромонов (теплой водой с небольшим количеством Алконокс мылом в течение ночи при встряхивании, затем промывают в течение как минимум 48 часов в дистиллированной воде при встряхивании, а также многочисленные изменения воды) . Еще одно соображение при проведении анализа мы описываем это погода. В нашем опыте мух не будет суд, если идет дождь или выглядит она будет дождь. Они наиболее эффективны яркие солнечные дни, независимо от того, лаборатория имеет окна или нет. Наша современная теория, что это явление связано с атмосферным давлением, но мы еще не исследовали это.
Традиционный анализ отрицательный geotaxis опирается на измерения, сколько мух подниматься выше заданной высоты в 10 секунд (описано в http://www.jove.com/details.php?id=2504 ). Мы считаем, что кольцо анализ имеет определенные преимущества по сравнению с традиционным анализом. Одним из них является тhroughput, а шесть независимых повторяет могут быть измерены одновременно по сравнению с одним из стандартных тест, и система в целом масштабируемость. Другим примером является чувствительность, потому что средний рост поднялся в определенный период времени количественно, а не прошел / не прошел номер абсолютной высоты. Используя этот подход, более тонкие дефициты могут быть соблюдены. Потому что от уровня пропускной способности, анализ больше подходит для экранов, чем более традиционные утомительные отрицательный анализ geotaxis. Кроме того, Garagano и соавт. (2005) описывает компьютеризированный метод скоринга, что если занято будет способствовать дальнейшему росту производительности. Первичная соображения этого анализа является то, что крайне важно, чтобы мухи не наркоз перед тестированием, и свежий флаконы используются после заданного набора испытаний, прежде чем новая партия мухи испытания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Astha Maltare для создания личиночной данных сканирования. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Николая Lanson младшего за то, что его замечания по рукописи. Эта работа была поддержана Роберт Packard Центр ALS Джона Хопкинса (в ОБП) и бокового амиотрофического склероза ассоциации (ОБП) и R01MH083689 из Национального института психического здоровья (CDN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 6 oz Drosophila bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Paint Brush (#1) | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Cornmeal | Fisher Scientific | NC9109741 | |
| Agar | Genesee Scientific | 66-104 | |
| Molasses | Fisher Scientific | NC9349176 | |
| Propionic acid | Acros Organics | 14930-0010 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Yeast | Genesee Scientific | 62-107 |
References
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature Mar. 23 (6776), 394-398 (2000).
- Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nat. Med. 8 (11), 1185-1186 (2000).
- Whitworth, A. J., Theodore, D. A., Greene, J. C., Benes, H., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Increased glutathione Stransferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (22), 8024-8029 (2005).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Lanson, N. A., Maltare, A., King, H., Smith, R., Kim, J. H., Taylor, J. P., Lloyd, T. E., Pandey, U. B. A Drosophila model of FUS-related neurodegeneration reveals genetic interaction between FUS and TDP-43. Hum. Mol. Genet. 20 (13), 2510-2523 (2011).
- Batlevi, Y., Martin, D. N., Pandey, U. B., Simon, C. R., Powers, C. M., Taylor, J. P., Baehrecke, E. H. Dynein light chain 1 is required for autophagy, protein clearance, and cell death in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (2), 742-747 (2010).
- Sang, T. K., Chang, H. Y., Lawless, G. M., Ratnaparkhi, A., Mee, L., Ackerson, L. C., Maidment, N. T., Krantz, D. E., Jackson, G. R. A Drosophila model of mutant human parkin-induced toxicity demonstrates selective loss of dopaminergic neurons and dependence on cellular dopamine. J. Neurosci. 27 (5), 981-992 (2007).
- Stacey, S. M., Muraro, N. I., Peco, E., Labbé, A., Thomas, G. B., Baines, R. A., van Meyel, D. J. Drosophila glial glutamate transporter Eaat1 is regulated by fringe-mediated notch signaling and is essential for larval locomotion. J. Neurosci. 30 (43), 14446-14457 (2010).
- Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
- Repnikova, E., Koles, K., Nakamura, M., Pitts, J., Li, H., Ambavane, A., Zoran, M. J., Panin, V. M. Sialyltransferase regulates nervous system function in Drosophila. J. Neurosci. 30 (18), 6466-6476 (2010).
- Nedelsky, N. B., Pennuto, M., Smith, R. B., Palazzolo, I., Moore, J., Nie, Z., Neale, G., Taylor, J. P. Native functions of the androgen receptor are essential to pathogenesis in a Drosophila model of spinobulbar muscular atrophy. Neuron. 67 (6), 936-952 (2010).
- Lorenzo, D. N., Li, M. G., Mische, S. E., Armbrust, K. R., Ranum, L. P., Hays, T. S. Spectrin mutations that cause spinocerebellar ataxia type 5 impair axonal transport and induce neurodegeneration in Drosophila. J. Cell Biol. 189 (1), 143-158 (2010).
- Wang, J. W., Brent, J. R., Tomlinson, A., Shneider, N. A., McCabe, B. D. The ALS-associated proteins FUS and TDP-43 function together to affect Drosophila locomotion and life span. J. Clin. Invest. , (2011).
- Choi, J. K., Jeon, Y. C., Lee, D. W., Oh, J. M., Lee, H. P., Jeong, B. H., Carp, R. I., Koh, Y. H., Kim, Y. S. A Drosophila model of GSS syndrome suggests defects in active zones are responsible for pathogenesis of GSS syndrome. Hum. Mol. Genet. 19 (22), 4474-4489 (2010).
- Ruan, H., Wu, C. F. Social interaction-mediated lifespan extension of Drosophila Cu/Zn superoxide dismutase mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (21), (2008).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (24), (2009).
- Becnel, J., Johnson, O., Luo, J., Nässel, D. R., Nichols, C. D. The serotonin 5-HT7 Dro receptor is expressed in the brain of Drosophila, and is essential for normal courtship and mating. PLoS One. 6 (6), e20800 (2011).
- Johnson, O., Becnel, J., Nichols, C. D. Serotonin 5-HT(2) and 5-HT(1A)-like receptors differentially modulate aggressive behaviors in Drosophila melanoga- ster. Neuroscience. 158 (2), 1292-1300 (2009).
- Bastock, M., Manning, A.
- Greenspan, R. J., Ferveur, J. F.
- Villella, A., Hall, J. C. Neurogenetics of courtship and mating in Drosophila. Adv. Genet. 62, 67-184 (2008).
