Summary
Drosophila melanogaster es un sistema de genética y de comportamiento modelo manejable que se ha utilizado para entender las bases moleculares y celulares de muchos procesos biológicos importantes para más de un siglo 1. Drosophila ha sido bien aprovechado para hacerse una idea de la base genética del comportamiento de las moscas.
Abstract
Drosophila melanogaster, la mosca de la fruta, se ha utilizado para estudiar los mecanismos moleculares de una amplia gama de enfermedades humanas tales como cáncer, enfermedades cardiovasculares y diversas enfermedades neurológicas 1. Hemos optimizado los ensayos de comportamiento simples y robustos para determinar la locomoción de larvas, la capacidad de escalada para adultos (ensayo anillo), y comportamientos de cortejo de Drosophila. Estos ensayos de comportamiento son ampliamente aplicables para el estudio del papel de los factores genéticos y ambientales en el comportamiento de la mosca. Capacidad de rastreo de las larvas puede utilizarse de manera fiable para determinar los cambios en las primeras etapas de las habilidades que se arrastran de las larvas de Drosophila y también para examinar el efecto de las drogas o los genes de enfermedades humanas (en moscas transgénicas) en su locomoción. El ensayo de rastreo de las larvas es más aplicable si la expresión o la supresión de un gen que causa la letalidad de la pupa o adulto, ya que estas moscas no sobreviven a la edad adulta que de otro modo podría ser evaluada. Este básico de unssay también puede ser utilizado en conjunción con la luz brillante o estrés adicionales para examinar las respuestas de comportamiento en larvas de Drosophila. El comportamiento de cortejo ha sido ampliamente utilizado para investigar las bases genéticas de la conducta sexual, y también se puede utilizar para examinar la actividad y la coordinación, así como el aprendizaje y la memoria. El comportamiento de cortejo de Drosophila implica el intercambio de diferentes estímulos sensoriales como visuales, auditivas, y las señales de quimiosensoriales entre hombres y mujeres que llevan a una compleja serie de conductas motoras bien caracterizados que culminaron en la cópula exitosa. Los ensayos tradicionales para adultos de escalada (geotaxis negativas) son el trabajo tedioso, intensiva, y requiere mucho tiempo, con una variación significativa entre los diferentes ensayos 2-4. El rápido iterativo geotaxis negativos (RING) ensayo de 5 tiene muchas ventajas sobre los protocolos más ampliamente utilizados, proporcionando un enfoque de rendimiento reproducible, sensible y de alta para cuantificar la locomotora de adultos y negativos b geotaxisehaviors. En el ensayo de ANILLO, varios genotipos o tratamientos de drogas se puede probar de forma simultánea con gran número de animales, con el enfoque de alto rendimiento por lo que es más susceptible para los experimentos de detección.
Protocol
A. Ensayo de larvas Crawling
1. Las larvas Colección
- Establecer una botella de 8 onzas de moscas (machos + 10-15 10-15 hembras).
- Que las moscas ponen sus huevos durante 24 horas, luego de botella clara de las moscas. (Transferencia de los adultos en una nueva botella y repita si es necesario).
- Incubar la botella durante 3-4 días, o hasta que las larvas son visibles.
- Agregar 50 a 100 ml de sacarosa al 20% de la botella con las larvas y deje reposar durante 20 minutos. Las larvas flotan en la parte superior.
- Recoger las larvas con una pipeta serológica de 25 ml con la punta cortada, y el lugar en una cesta de malla.
- Lávese las larvas en la cesta de malla dos veces con agua desionizada H 2 O. Las larvas están listas para los experimentos.
2. Para el tratamiento de las larvas con las drogas
- Utilizar un pincel para transportar el número deseado de las larvas a un vaso de precipitados de 5 ml que contiene una solución de sacarosa al 5% + fármaco.
- Que las larvas se alimentan por lo menos 15 minutos.
- Vierta tratados con el fármaco larvas en una cesta de malla y enjuague. Ahora están listos para usar.
3. Ensayo de locomotora (medida de la distancia total recorrida o las contracciones de la pared corporal)
- Use un cepillo para el transporte de larvas de individuo a un:
- 15 cm de placa de Petri que contenía 2% de agarosa (previamente vertió y se deja endurecer) sobre papel milimetrado con un 0,2 cm 2 cuadrícula.
- Contar el número de líneas de la cuadrícula cruzado en 1 minuto.
- Bien de un plato de vidrio que contiene una disección solución de levadura pasta diluida.
- Cuente las contracciones peristalsis (anterior pleno movimiento posterior contracción = 1) en un minuto mientras se observa bajo un microscopio de disección.
- 15 cm de placa de Petri que contenía 2% de agarosa (previamente vertió y se deja endurecer) sobre papel milimetrado con un 0,2 cm 2 cuadrícula.
- Repita hasta que los números deseados de las larvas han sido contados.
B. rápido iterativo geotaxis negativos (ARO) del Protocolo
Este ensayo fue De originalmentedescrito por Gargano et al 5.
- Recoger las moscas recién emergidas adultos de sexo masculino menores de CO 2 anestesia ligera y el lugar en un alimento vial estándar que contiene (o comida + drogas).
- Mantener a las moscas a temperatura ambiente (en la parte superior del banco. ~ 22 ° C) durante 2-3 días para permitir la recuperación de CO 2 (y la acumulación de los niveles del fármaco en estado estacionario en su caso).
- Transferir aproximadamente 25 moscas sin anestesiar a viales de poliestireno preparadas.
- Montar viales con moscas en el aparato de anillo (Figura 1).
- Permita que las moscas se adapte al medio ambiente, sin ser molestado, durante 15-20 minutos.
- En este lugar la cámara digital de tiempo ~ 1 m por delante del aparato (en una plataforma, si es necesario para alinear el centro de la lente a media altura de los viales), el enfoque y zoom con la cámara en el aparato, y establecer un temporizador para 3,0 segundos.
- Con cuidado, sujete el aparato de anillo de modo que no con la mano izquierda a la disturb las moscas, y sostienen que el temporizador con la mano derecha.
- Fuertemente toque el aparato hacia abajo sobre la superficie del banco de tres veces, asegurándose de que el grifo es lo suficientemente duro para tumbar todas las moscas a la parte inferior de los viales.
- Simultáneamente con la terminación de la llave en tercer lugar, iniciar el temporizador de cuenta atrás de 3 segundos.
- En tres segundos, tomar una fotografía.
- Restablecer el temporizador de 1 minuto y comenzar. Durante este tiempo, reajustar la cámara y se centran en el aparato, y establecer otro canal del temporizador durante tres segundos.
- Después de 1 minuto, repita los pasos 1.7-1.10
- Después de un total de 5-6 ensayos, subir imágenes a un ordenador y usar el visor de imágenes preferida para abrir y marcar la altura promedio subió para cada vial.
- Realizar análisis estadístico de los diferentes grupos que comparan la altura media subió.
C. El cortejo y apareamiento de ensayo
- A primera hora de la mañana, claros y productoras de botellas de FLIes para ser utilizado.
- En el transcurso del día (cada 3-4 horas), recoger recién emergidas machos sexualmente ingenuos y mujeres:
- Coloque los hombres individualmente en frascos o tubos con el medio.
- Coloque 5-6 hembras juntos por vial / tubo.
- Aislar las moscas recolectadas a 25 ° C en 12 h luz / oscuridad durante 5 días.
- Transferencia de una mujer dentro de la cámara de una rueda de apareamiento.
- Transferencia de un macho en la cámara de una rueda de apareamiento.
- Observar par bajo un microscopio de disección de los siguientes comportamientos:
- Orientación (los varones se orienta hacia la mujer)
- Al tocar (el macho golpea a la hembra)
- Canción del ala (el macho se extiende y hace vibrar un ala)
- Licking (lame los varones los genitales femeninos)
- Curling (el macho se curva su abdomen debajo de sí mismo)
- Intento de cópula (Curling la actividad al intentar montar a la hembra)
- Observe si hay una0 minutos o hasta que la copulación con éxito, teniendo en cuenta el momento en que cada comportamiento se produce (latencia), el tiempo total involucrado en el comportamiento de cortejo hasta la copulación (para calcular el índice de noviazgo), así como el número de pares que realizar con éxito un determinado comportamiento ( frecuencia). 100% de pares de tipo salvaje generalmente se aparean dentro de los 5 minutos.
- Calcular un índice de cortejo (IC) al dividir el tiempo en el cortejo, dividido por el tiempo total hasta la cópula. Para los pares de tipo salvaje esto por lo general oscila entre 0.6-0.8.
D. Representante Resultados
Rastreo de ensayo
Larva normal de tipo salvaje vagará ~ 3 cm / minuto, y exhibición del ~ 40-50 contracciones de la pared del cuerpo en un minuto. Recientemente hemos desarrollado un modelo de Drosophila FUS / TLS relacionada con la esclerosis lateral amiotrófica que muestra defecto de larvas arrastrándose, esperanza de vida reducida y adultos escalada deterioro 6. Nos centramos en la expresión of de tipo salvaje y formas mutantes de FUS / TLS para las neuronas motoras (OK-371-GAL4 conductor) y realizó un ensayo de rastreo de las larvas. Como se muestra a continuación, las larvas de tipo salvaje arrastran hasta 12 cm, mientras que la expresión de la FUS de tipo salvaje disminución de la capacidad de las larvas arrastrándose de unos 6 cm. Los animales que expresan la mutación R521C ALS causando en FUS / TLS demostrar un deterioro muy grave en su movimiento de rastreo (Figura 1), el rastreo sólo aproximadamente 1 cm por minuto.
Geotaxis negativo del ensayo ANILLO
Jóvenes de tipo salvaje moscas adultas deben tener una altura media de subida de ~ 4-5 cm en un período de tiempo de 3 segundos (el tiempo se puede ajustar de 3 segundos para dar cabida a diferentes cepas o los niveles de actividad para definir una altura promedio determinado para una determinada cepa / tratamiento). Las moscas que se mantienen en la parte inferior se le asigna un valor de 0. No se recomienda usar más de 25 moscas por vial, ya que entonces se hace difícil determinar la ubicación de cada individuo mosca para medir la altura. Ndesensibilización o se ha observado menos hasta los 6 ensayos consecutivos espaciados 1 minuto, aparte de que hemos empleado. Es crítico no reutilizar los viales de ensayo de poliestireno en este ensayo después de los conjuntos iniciales de datos son recogidos por moscas nuevas colocadas en viales utilizados no subirá a la misma medida en viales frescos.
Figura 1. De instalación para el ensayo de ANILLO. La cámara digital se coloca aproximadamente 1 m por delante del aparato que contiene las moscas en los viales de poliestireno, el enfoque y zoom con la cámara en el aparato, y establecer un temporizador de 3.0 segundos.
Datos de la figura 2. Representativos de la prueba de rastreo utilizando larvas moscas ectópica expresar UAS-FUS WT, y UAS-FUS R521C bajo el control de un controlador de la neurona motora (OK371-GAL4).
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Discussion
El comportamiento de Drosophila está estrechamente regulada por factores genéticos y ambientales. Nosotros, y otros, han utilizado previamente los ensayos descritos aquí para recoger datos para examinar los genes relacionados a volar a los comportamientos y las enfermedades neurodegenerativas humanas modeladas en Drosophila 5-19. Para la prueba de rastreo, la selección cuidadosa de 3 de las larvas es un paso crítico. Si el tratamiento con un fármaco, se tardará 10-15 minutos (o más dependiendo del tipo y la naturaleza del fármaco) para conseguir el efecto máximo si tiene buena solubilidad. Por lo tanto, de manera rutinaria alimentar vuela el fármaco durante 15 minutos, y luego esperar un período adicional de 15 minutos antes del ensayo. Es importante, sin embargo, para mantener las concentraciones de fármaco en solución, y tiempos de exposición, entre los grupos de tratamiento del mismo para la comparación exacta. Fármacos activos del SNC por lo general tienen un efecto máximo duradera ~ 45 minutos. Las larvas deben ser bien lavadas después de la selección (o excavados, alimentación) para eliminar la comida y la moscapermitió aclimatarse durante 1 minuto antes de comenzar el ensayo gatear. La placa de agar debe mantenerse a temperatura ambiente (~ 22 ° C) durante una hora, como a baja temperatura pueden influir en la capacidad de rastreo de larvas. Aunque el ensayo de rastreo de las larvas puede proporcionar información importante sobre los niveles de actividad, no es adecuado para el análisis de los déficits de coordinación sutiles. Por lo tanto, como una plataforma de cribado es más apropiado para una primera pasada examinar déficits brutas de actividad.
Un comportamiento de los adultos que consiste en la coordinación motora fina es el cortejo y el apareamiento. Este comportamiento se ha utilizado para examinar los aspectos de los comportamientos relacionados con enfermedades humanas, y consiste en el procesamiento sensorial (olfato, acústica visual), además de buen control del motor 18. Cuando un hombre se da cuenta de una mujer, se inicia el ritual de cortejo que avanza en un patrón que comienza con el estereotipo de comportamiento de la orientación (hacia el y persiguiendo a la hembra). Esto es seguido por wingsong, chuparseg intervención de los órganos genitales de la hembra, rizado del abdomen hacia la hembra, y culmina en la cópula, que puede durar varias decenas de minutos 20-22. Debido a que muchos de los aspectos del cortejo implican señales visuales, la oscuridad conducir a una degradación de la conducta de apareamiento, y los ensayos deben realizarse con suficiente luz para que las moscas pueden ver unos a otros. En consecuencia, las moscas de ojos blancos por lo general tienen un rendimiento muy pobre en nuestro ensayo descrito y los lectores se les recomienda no utilizar la planificación de experimentos con este protocolo. Si el tratamiento de las moscas con un fármaco, poner el fármaco en el medio de las moscas están aislados en (por ejemplo, 1% de agarosa sacarosa + 10% + de drogas en lugar de comida estándar en el tratamiento con fármaco para evitar cualquier posible degradación del fármaco por los microorganismos en el los alimentos). En general, las moscas se encuentran aisladas en 5 tubos de ensayo que tienen ml 300-500 ml de comida en ellos, tapados con algodón. NO anestesiar a las moscas para la transferencia a la rueda de apareamiento. Se is absolutamente crítico para lavar la rueda de apareamiento muy bien entre utiliza para eliminar las feromonas residuales (agua tibia con un poco de jabón Alconox durante la noche con agitación, luego se lava por un mínimo de 48 horas en agua desionizada con agitación, y numerosos cambios de agua) . Otra consideración al realizar el ensayo se describe es el clima. En las moscas de nuestra experiencia no se corte si está lloviendo o parece que va a llover. Ellos se desempeñan mejor en días soleados, sin importar si el laboratorio tiene ventanas o no. Nuestra teoría actual es que este fenómeno está relacionado con la presión atmosférica, pero no hemos investigado esto.
El método tradicional geotaxis negativa se basa en la medición de cómo muchas moscas subir por encima de una altura predeterminada en 10 segundos (que se describe en el http://www.jove.com/details.php?id=2504 ). Creemos que el ensayo ANILLO tiene ciertas ventajas sobre el método tradicional. Uno es throughput, como seis repeticiones independientes se pueden medir simultáneamente en comparación con la del ensayo estándar, y el sistema es generalmente escalan. Otra es la sensibilidad, ya que la altura promedio se incrementó en un período de tiempo definido se cuantifica, en lugar de un pase / fallo número para la altura absoluta. Con este enfoque, los déficits más sutiles pueden ser observadas. Debido a que el nivel de rendimiento, el ensayo es más adecuado a las pantallas que el más tedioso método tradicional geotaxis negativo. Además, Garagano et al. (2005) describen un método de puntaje computarizado que si se emplea más que aumentar el rendimiento. Las consideraciones principales para este ensayo son que es imperativo que las moscas no son anestesiados antes de la prueba, y que los viales frescas se utilizan después de un determinado conjunto de ensayos antes de que un nuevo lote de las moscas se ponen a prueba.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Astha Maltare para la generación de los datos se arrastran larvas. Nos gustaría agradecer al Dr. Nicolás Lanson Jr. para dar sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Centro Robert Packard para la ELA en la Universidad Johns Hopkins (para UBP) y la Asociación de Esclerosis Lateral Amiotrófica (UBP), y R01MH083689 de los Institutos Nacionales de Salud Mental (CDN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 6 oz Drosophila bottle | Genesee Scientific | 32-130 | |
| Paint Brush (#1) | Ted Pella, Inc. | 11859 | |
| Cornmeal | Fisher Scientific | NC9109741 | |
| Agar | Genesee Scientific | 66-104 | |
| Molasses | Fisher Scientific | NC9349176 | |
| Propionic acid | Acros Organics | 14930-0010 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Yeast | Genesee Scientific | 62-107 |
References
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