ストップトフロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元と酸化の半反応を監視する

Summary

我々は、還元および酸化半反応の両方を調査するストップトフロー装置の使用を記述<em>アスペルギルス</em>シデロフォアA（SIDA）、フラビン依存性モノオキシゲナーゼ。次にキンゴジカの反応の種に対応するスペクトルを示し、我々はそれらの形成のための速度定数を計算します。

Abstract

アスペルギルスシデロフォアA（SIDA）が（例えばferricrocinまたはN '、N "、N''' – triacetylfusarinine ^C）1病原性に必須であるヒドロキシデロフォアの生合成にオルニチンのヒドロキシル化を触媒するFAD含有モノオキシゲナーゼである。キンゴジカによって触媒される反応は、還元と酸化の半反応（スキーム1）に分割することができます。半反応の還元では、fキンゴジカにバインドされた酸化FADは、NADPH ^2,3削減されます。酸化半反応では、 、還元型補因子は、オルニチンに酸素原子を転送C4A-hydroperoxyflavin中間体を形成し、分子状​​酸素と反応します。ここでは、速度を測定し、にインストールされているストップトフロー装置を用いてキンゴジカの異なるスペクトルフォームを検出するための手順について説明します。嫌気性グローブボックス。ストップトフロー装置では、反応物の少量が急速に混合され、流れた後、目によって停止されeは注射器（ 図1）を停止し 、観測セル内に配置ソリューションのスペクトルの変化を経時的に記録されます。実験の最初の部分では、我々はNADPHによるfキンゴジカにおけるフラビンの嫌気性低下が直接測定された単一モードでストップトフロー測定器を使用する方法を示しています。次にfをキンゴジカが最初に嫌気的に高齢化、ループ内での時間指定されている期間内においてNADPH削減され、ダブルミキシング設定を使用して、観察細胞（ 図1）分子状酸素と反応した。還元的半反応が監視されている場合にのみ、ソリューション内の任意の酸素が減少しフラビン補因子と反応して最終的に酸化されたフラビンに戻って減衰しますC4A-hydroperoxyflavin中間体を形成するので、この実験を実行するために、嫌気性のバッファが必要です。 ENZの完全なターンオーバーがあるだろうので、これは、ユーザーが正確に縮小率を測定することができませんでしたYME。還元と酸化の間にちょうどステップが観察されるように、酸化半反応が検討されているときにこの酵素は酸素の存在下で還元される必要があります。この実験で使用されるバッファの1つは、我々は、酸素の高濃度で酸化半反応を調べることができる飽和酸素である。これらは、しばしば手続きであるフラビン含有モノオキシゲナーゼとの還元または酸化半反応のいずれかを勉強したときに実施した。ストップトフローで実行前の定常状態の実験の時間スケールは、固有の速度定数の決定と反応⁴の中間体の検出および同定を可能にする秒、ミリ秒です。ここで説明する手順は、他のフラビン依存性モノオキシゲナーゼに適用することができます^。5,6

Protocol

1。嫌気性バッファーの調製 100mMリン酸カリウム緩衝液1 L、pHが7.5を準備します。攪拌棒を500 mLのブフナーフラスコにバッファー250mLのを注ぐ。 ゴム栓とフラスコを密封し、攪拌プレート上に置きます。シュレンクラインにフラスコの短いチューブを接続します。 ドガ攪拌しながら室温で5時間真空下でのバッファ。この期間中、毎時間脱気し、アルゴンでフラッシング真空の5つの連続した​​ラウンドを実行します。 10秒間のアルゴンとフラスコをフラッシュし、真空マニホールドから外します。グローブボックス内にフラスコを置きます。 激しく攪拌しながら一晩グローブボックス内でフラスコを開いたままにします。 2。ストップトフローシステムから酸素を除去する 0.1 M酢酸ナトリウム、pH5.0の1リットルを準備します。 250mLのブフナーフラスコに、このバッファ125 mLを注ぎ、ステップ1.2から1.4を実行します。 5を秤量アスペルギルスニジェール （181300 U / g）と0.9グラムのグルコース1.5mlのエッペンドルフチューブと50mlのファルコンコニカルチューブを使用して、それぞれからmgのグルコースオキシダーゼ。グローブボックスに両方のコンテナを配置します。 嫌気性0.1 M酢酸ナトリウム、pH5.0（それぞれ18.13 U / mLと100 mMの、最終濃度）の50 mLのグルコースオキシダーゼとグルコースを溶解する。この溶液（ 図1）貯水池シリンジを満たします。 ドライブのバルブは"負荷"の位置にあることを確認し、ドライブのシリンジ（ 図1）を記入してください。 "ドライブ"の位置にFバルブを回します。プロデータコントロールソフトウェアで空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFからバッファを押してください。このステップの合計で10回繰り返します。他の3つのドライブシリンジと同じ手順を実行します。一時間待ちます。 同じバッファcontaiとリザーバーシリンジのソリューションを置き換えるグルコースオキシダーゼとグルコース寧。手順2.4を繰り返します。 手順2.5を繰り返し、解決策は一晩フローシステムに立つことができます。 一晩インキュベートした後、手順2.5を繰り返します。 3。酸素飽和バッファーの調製 100mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を調製し、攪拌棒を50-mLバイアルに50mLを注ぎます。ウィートンのストッパーとウィートンのアルミシールでバイアルをキャップ。 氷の上でバイアルを置きます。溶液中に100％の酸素を含むタンクに接続されて長い針を浸します。ベントとして、バイアルの栓を介して別の短い針を挿入します。 泡攪拌しながら1時間100％の酸素とソリューションを提供します。 最初のバイアルから短い針を除去し、長い針を取り外す前に、10秒待ちます。グローブボックス内で閉じたバイアルを置きます。 4。 NADPH溶液の調製 1.5 mLのエッペンドルフチュー​​ブにNADPH 1mgを秤量し、iを置くグローブボックスにトン。 嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）300μLでNADPHを溶かす。分光光度計（ε340 nmの = 6270 M -1 cm -1を ）とNADPH濃度を決定するためにグローブボックスから、この溶液の30μLを削除します。 5。酵素溶液からの酸素の除去グローブボックス内の冷凍庫で、解凍から酵素ストック溶液400μLを取る。酵素原液（360μM）は、以前に100mM NaClを含む100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）で調製し、液体窒素中で凍結させた。 攪拌棒25 mLバイアル中に酵素溶液を移し、ウィートンのストッパーとウィートンのアルミシールでバイアルをキャップ、グローブボックスから削除します。 氷の上でバイアルを置き、バイアルの栓に針を挿入することによって、シュレンクラインに接続します。 ドガの連続した​​5ラウンドを行うことにより、酵素溶液1時間ごとに20分を脱気し、アルゴンでフラッシング真空。 10秒間アルゴンバイアルをフラッシュし、真空マニホールドから外します。グローブボックス内の氷の上に瓶を置きます。 6。還元的半反応：監視フラビン還元製造業者のプロトコルに従って、単​​一の混合モードでのストップトフロー測定器とPro-Dataの制御ソフトウェアを準備します。 循環水浴（15℃）をオンにします。 20分間それを通して窒素をバブリングすることにより水から酸素を除去します。これは、フロー回路を介して酸素の混入を防ぐことができます。 循環浴にストップトフローの水浴ハウジングを接続することにより、ドライブシリンジの温度と15の観測セル°Cを維持しています。 プロのデータの制御ソフトウェアを選択してフォトダイオードアレイ、外部トリガ（ストップトフローの動作をアクティブにする）、およびLogaritの[コントロールパネル]ウィンドウでHMIC規模。 プロのデータビューアソフトウェアを起動し、データファイルが格納されるディレクトリを定義します。 嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）と貯水池シリンジCとFのソリューションに置き換えます。 "ドライブ"の位置にCとFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で（RAMのそれぞれの動きの前に空にするをクリックします）、合計で5回、対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジの両方からのバッファを押してください。 そのグルコースオキシダーゼが流れ回路から完全に削除されていることを確認するためには、合計で6.6の4倍をステップ実行します。 プロのデータ制御ソフトウェアのベースラインをクリックします。 嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（15μMの停止流れの中で混合後の最終濃度）の1100μLに酵素原液の100μLを混和します。 貯水池SYRのソリューションを置き換える酵素溶液とFをインゲ。 "ドライブ"の位置にFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFから酵素液をプッシュします。合計で、この三回を実行します。プロのデータの制御ソフトウェアでは、60秒に取得時間を設定します。 両方のドライブシリンジは、ドライブシリンジのピストンと接触しているそれらに対応するソリューションとドライブの雄羊で満たされていることを確認してください。 "ドライブ"の位置に両方のバルブを回して、ドライブを実行するためにプロのデータ制御ソフトウェアの取得]をクリックします 。三重内のデータを取得するために2倍以上、この手順を繰り返します。酵素の酸化型のこの収量スペクトル。 ドライブから得られた452 nmの値を使用して、（ε452 NM = 13700 M -1 cm -1）を混合する前に酵素濃度を決定し、NADPH solutio 4 mLの準備を■1.5倍以上濃縮した。 6.10で説明したようにNADPH溶液と空の補充停止シリンジで3回リザーバーシリンジCの溶液を交換してください。 ステップ6.11を繰り返します。酵素の減少時にこの収量スペクトルを示す。 7。酸化半反応：監視フラビンの酸化ストップトフロー測定器および製造業者のプロトコルに従って、ダブルミキシング·モードのPro-Dataの制御ソフトウェアを準備します。 ステップ6.2から6.5を繰り返します。 嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を持つ4つのリザーバーシリンジ内の溶液を交換してください。 "ドライブ"の位置にFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFからバッファを押してください。各ドライブシリンジとの合計でこのステップを5回実行します。 TOTには7.3の4倍をステップ実行します。らは、完全に流れ回路からコンテンツを削除します。 プロのデータ制御ソフトウェアのベースラインをクリックします 。 嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（15μMの停止流れの中で混合後の最終濃度）の1000μLに酵素原液の200μLを混和します。 酵素溶液をリザーバーシリンジのソリューションに置き換えます。 "ドライブ"の位置にバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって、ドライブシリンジから流れ回路を介して酵素溶液をプッシュします。このステップを合計3回を実行します。プロのデータの制御ソフトウェアでは、0.5秒の遅延時間と60秒の取得時間を設定します。 すべてのドライブシリンジは、ドライブシリンジのピストンと接触しているそれらに対応するソリューションとドライブの雄羊で満たされていることを確認してください。 "ドライブ"の位置にすべてのバルブを回しとPro-DATの取得をクリックしますドライブを実行する制御ソフトウェア。三重内のデータを取得するためにこのステップを2回以上繰り返します。酵素の酸化型のこの収量スペクトル。 注射器Aの酵素溶液 "ドライブ"の位置と空の補充停止注射器のように7.7で説明されて三回にBバルブを回して、1.5倍より濃縮されたNADPH溶液とリザーバーシリンジBの溶液を交換してください。 酸素バッファを持つ貯水池注射器Cの溶液を交換してください。ストップシリンジに7.7で説明したように三回の "ドライブ"の位置と空にCのバルブを回して補充。プロのデータの制御ソフトウェアでは、それぞれ、15、900秒での遅延と取得時間を設定します。 手順7.8を繰り返します。完全に減少し、酵素の再酸化の間にこの収量スペクトルを示す。 8。データ解析プロのデータコンバータソフトを起動します。 オプションアイコンをクリックするとProDataCSVに保存]を選択します。 開くデータファイルが格納されていたディレクトリにコピーします。 APLプロのデータコンバータのウィンドウにファイルをドラッグします。データは同じディレクトリ内のCSV形式ファイルとして自動的に保存されます。 をMicrosoft Excel（マイクロソフト、レッドモンド、ワシントン州、米国）を使用してCSV形式のファイルを開きます。 700 nmで対応する吸収を差し引くことによってストップトフロー·トレースのベースラインを正規化します。 適切な指数関数に対応する最大時間に対する吸光度のプロットをフィッティングすることにより、カレイダグラフ（Synergyソフトウェア、読書、PA）を用いて補正トレースを分析する。 図2Bに示すように、452 nmの吸光度をストップトフロー装置内酵素およびNADPHを混合した後、フラビンの削減率を決定するために、時間の関数としてプロットした。この場合、データのベストフィットは、還元、resの第1および第2の位相を計算した二重指数関数方程式と0.65と0.23 s -1の速度を用いて得られたpectively。 C4A-hydroperoxyflavin中間体の形成の速度と酸素が ​​減少する酵素を反応させた後、再酸化を決定するために、我々は、それぞれ380および452 nmであり、（ 図3B）で停止したフローのトレースを分析した。単一の指数関数の式を使用して、我々は、それぞれ、酸化半反応の第一および第二のステップで1.4と0.006 s -1の速度を算出した。 9。代表的な結果前のセクションで説明した実験結果からは、fキンゴジカの還元の半反応はフラビンの酸化還元状態の変化に対応する452 nmの吸光度の変化を測定することにより監視することができる方法を示しています。このステップの速度は、適切な式（;ステップ8.4 図2）にデータをフィッティングすることにより決定することができます。得られた削減率（0.65秒-1）と計算されたk個の猫値に似ています還元反応の律速段階であることを示唆している定常状態の実験2。ストップトフローのダブルミキシング·モードを活用して、酸化し、この半反応における中間体の速度が（;ステップ8.4 図3）決定することができます。 Fキンゴジカによって触媒される反応では、C4A-hydroperoxyflavinは明らかに（380nmのλmax）で検出され、形成と崩壊の速度を計算することができます。得られた再酸化（0.006秒-1）の遅い速度は、C4A-hydroperoxyflavinが存在しない場合にオルニチン非常に安定であることを示します。 スキーム1。Fキンゴジカのメカニズム。 FAD補のisoallozaxineリングが表示されます。酸化フラビン（）は、NADPH（B）に結合してフラビンとNADP +（C）を還元型に反応します。酸素分子との結合との反応後オルニチン、C4A-hydroperoxyflavin（D）が形成される。これは、ヒドロキシル化種である。オルニチンの水酸化の後、hydroxyflavin（E）は、酸化酵素を形成するために脱水する必要があります。 NADP +は、触媒サイクルを通して結合したままで、（F）をリリースする最後の製品です。 図1ストップトフロー測定器。 A）応用光物性SX20のコンポーネントの写真ストップトフロー分光光度計を。サンプルハンドリングユニットのB）画像。ダブルミキシング·モードでのフロー回路のC）スキーム。 図2。ストップトフロー測定器でNADPHとキンゴジカの嫌気性減少。 30μMと45μMキンゴジカのNADPHの等量を混合した後に記録された）スペクトルの変化。第一スペクトル（酸化SIDA）と最後のスペクトル（完全に削減シド）は、それぞれ青と赤で強調表示されます。 B）の吸光度は時間の関数として記録された452 nmでトレースします。 ストップトフロー測定器でキンゴジカの図3。酸化。 A）スペクトルの変化は完全に低下しキンゴジカと酸素バッファの等量を混合した後に記録されます。最終濃度は15μMSIDA、22.5μMのNADPH、および0.95 mMの酸素であった。スペクトルは、0.034、4.268で記録され、727.494 sは、それぞれ完全に減少する酵素、C4A-hydroperoxyflavin中間体（380nmのλmax）、および酸化酵素（450nmのλmax）に対応しています。 B）382及び452 nmでの吸光度トレースは時間の関数として記録されます。

Discussion

酸化還元反応を触媒する酵素は、通常、触媒サイクルの間に有意な吸光度の変化がヘムとフラビンなどの補因子が含まれています。フラビンの酸化型では、〜360と450nmの吸光度の最大値を示し、その減少は一般的に450 nmの⁷での吸光度の減少に従うことによって監視されています。一般的には、いくつかの一時的な中間体は存在するが、通常の分光光度計で測定される形と減衰が速すぎです。応用光物性SX20ストップトフロー分光光度計（または類似の楽器）を使用して、それはミリ秒の時間スケールでの吸光度の変化を（デッドタイム、2ミリ秒）を測定することが可能です。ここでは、モデルとして、フラビン依存性モノオキシゲナーゼFキンゴジカの還元的および酸化的半反応を調べた。水素化物の転送速度は、嫌気的条件下でNADPHと酵素を混合した後、452 nmでの吸光度の変化を測定することにより決定した。その後、advantagを取る完全な削減が達成されるまでストップトフロー装置の二重混合モードのE、酵素は、まず減少し、酵素NADP ⁺複合体は酸素と混合し、NADPHと反応させた。この手順に続いて、それは一時的な酸素フラビン中間体を検出するための形成と崩壊の速度を測定することが可能です。これらの中間体の同定は、触媒の反応種の性質についての実験データを提供します。 F SIDA、ヒドロキシル種であるC4A-hydroperoxyflavin（通常は370から380 nmでモニター）の形成の場合である。さらに、各ステップの速度定数を測定すると、1つは、反応の律速段階に関する情報を取得し、酵素の速度論的および化学的メカニズムを解明するのに役立つことができます。

一般的には、同様のアプローチは、他のflavoenzymes、またはそのようなCONTそのタンパク質などの吸光度の変化が発生したタンパク質は、使用することができAINヘム、ピリドキサール、リン酸、または非ヘム鉄^8-10このメソッドへの制限は、精製酵素の大量が必要であることですが、これは高収率で発現系を用いることにより克服することができます。一つは、十分に強い信号が観測できるように十分なタンパク質を使用して記録スペクトルの最適なタンパク質濃度を決定するではなく、多すぎるように酵素が浪費されていません。一般的に、ストップトフロー実験に使用したフラビン含有酵素の最も低い酵素濃度は6-10μM（混合した後）であり、酵素の対応するモル吸光係数を用いて決定される。 Fキンゴジカの場合には、酵素結合したFADの割合は50から65パーセント²です。バインドされたFAD補因子が触媒作用に必要となりますので、アポ蛋白質は、これらの実験では非アクティブと見なされます。このメソッドへのもう一つの可能​​性の制限は、酵素のプロセスは、彼らが観察されることはありません2ミリ秒（ストップトフローのデッドタイム）よりも速いが発生した場合ですが、目EREは、レートは、この問題を克服するために減少させることができる戦略を報告されています。このための一つの例は、フェレドキシン-NADP ⁺還元酵素¹¹の反応で、高NaCl濃度を使用して含まれています。ストップトフローの流路からの酸素のスクラブは、多くの場合、この実験ではトリッキーなステップであり、特別な注意が必要です。それが効果的かつ安価な方法としてここで説明したグルコースオキシダーゼグルコースシステムは、ほとんどの研究室で正常に使用されています。しかしながら、H ₂ O ₂の産生を含め、いくつかのアプリケーションのためprotocatechuateオキシゲナーゼ-protocatechuateシステムなど、他の選択肢が¹²考慮すべきいくつかの欠点があります。嫌気性グローブボックスの利用は、簡単に嫌気的条件を確保することができるが、必須ではありません。我々は酵素は酸素の存在下で減少する場合や、濃度の酸素と反応し、酸素が停止してフローの流路から除去しなければならない我々は指定されたの。ストップトフローは、グローブボックス内でですが、我々は以前の実験で好気性のバッファを使用した場合、酸素が流れ回路である。吸光度測定に加えて、蛍光および円偏光二色性アッセイは、対応するアクセサリと応用光物性SX20ストップトフロー分光光度計で行うことができます。

Materials

General Laboratory Equipment	Company	Catalogue Number
Vacuum pump	Welch	–
Büchner flasks	Fisher	70340-500
Stir bars	Fisher	14-512-129
Stir plates	Fisher	11-100-49S
Schlenk lines	Kontes Glass	–
Argon tank	Airgas	AR UPC300
Nitrogen tank	Airgas	NI200
Nitrogen tank, ultra high purity grade	Airgas	NI UHP200
Oxygen tank	Airgas	OX 40
5% Hydrogen balance nitrogen tank	Airgas	X02NI95B200H998
SX20 Stopped-flow spectrophotometer	AppliedPhotophysics	–
Glove box	Coy	–
Water bath	Brinkmann Lauda	–
Supplies
50 mL BD Falcon tubes	Fisher	14-432-23
15 mL BD Falcon conical tubes	Fisher	05-527-90
1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-18
50 and 25 mL glass vials	Fisher	06-402
Rubber stoppers	Fisher	06-447H
Aluminum seals	Fisher	06-406-15
Reagents
Potassium phosphate, monobasic	Fisher	AC2714080025
Potassium phosphate, dibasic	Fisher	P288-500
Sodium acetate	Sigma	S-2889
Glucose oxidase from A. niger	Sigma	G7141-250KU
D-Glucose	Fisher	D16-500
β-NADPH	Fisher	ICN10116783
L(+)-Ornithine hydrochloride	Fisher	ICN10116783