우리는 reductive 및 산화 반 반응 모두를 조사하기 위해 중지 흐름 악기의 사용을 설명<em> Aspergillus fumigatus</em> siderophore (SidA), 플라빈 종속 monooxygenase. 그러면 SidA의 반응의 종류에 해당하는 스펙트럼을 보여 주며 우리는 그들의 형성에 대한 속도 상수를 계산합니다.
Aspergillus fumigatus siderophore (SidA)는 (예 : ferricrocin 또는 N ', N', N '' '- triacetylfusarinine C) 1 독성에 필수적인 hydroxamate siderophores의 생합성에서 ornithine의 hydroxylation을 catalyzes 유행 함유 monooxygenase입니다. SidA에 의해 촉매 반응은 reductive 및 산화 반 반응 (제도 1)로 나눌 수 있습니다. 하프 반응 reductive에서 F SidA에 바인딩 산화 유행은, NADPH 2,3에 의해 감소됩니다. 하프 반응 산화에 , 감소 cofactor는 ornithine에 산소 원자를 전송 C4a-hydroperoxyflavin 중간을 형성하는 분자 산소와 반응. 여기, 우리가 속도를 측정하고에 설치되어 중지 흐름 악기를 사용 SidA의 다양한 스펙트럼 형태를 감지하는 절차를 설명 무산소 장갑 상자. 정지 – 흐름 악기에서 reactants 작은 볼륨이 빠른 속도로 혼합이며, 흐름 이후 번째로 정지전자 정류장 주사기 (그림 1), 관찰 전지에 배치 솔루션의 스펙트럼 변화는 시간이 지남에 기록됩니다. 실험의 첫번째 부분에서는, 우리는 NADPH에 의해 F SidA의 플라빈의 혐기성 환원 직접 측정 단일 모드에서 정지 – 흐름 악기를 사용하는 방법을 보여줍니다. 그러면 F SidA 처음 anaerobically 노화 루프의 시간을 지정된 기간 동안 NADPH에 의해 감소되는 이중 믹싱 설정을 사용하고 관찰 세포 (그림 1)에서 분자 산소와 반응. 오직 reductive 반 반응을 모니터링하는 경우, 솔루션의 모든 산소가 줄어든 플라 빈의 cofactor로 반응하고 궁극적으로 산화 플라 빈으로 다시 가옥 것이다 C4a-hydroperoxyflavin 중간을 형성하기 때문에이 실험을 수행하기 위해서는 무산소 버퍼가 필요 . enz의 전체 매상이있을 수도 있기 때문에 이것은 사용자가 정확하게 감소의 속도를 측정하는 것을 허용하지 것입니다yme. 하프 반응 산화가 연구중인 경우 효소가 감소하고 산화 사이 단지 단계가 관찰되고 있도록 산소의 부재로 감소되어야한다. 본 실험에 사용되는 버퍼 중 하나는 산소가 우리가 산소보다 높은 농도에서 하프 반응 산화를 공부할 수 있도록 포화 상태입니다. 이들은 종종 플라빈 함유 monooxygenases로 reductive이나 산화 반 반응 중 하나를 공부하면 수행 절차입니다. 정지 – 흐름으로 수행 미리 정상 상태 실험의 시간 척도는 고유 속도 상수의 결정 및 반응 4 중간체의 탐지 및 식별을 허용 초 밀리초입니다. 여기에 설명된 절차는 다른 플라빈 종속 monooxygenases에 적용할 수 있습니다. 5,6
산화 환원 반응을 catalyze 효소는 일반적으로 촉매주기 동안 중요한 흡광도 변화를 받아야 hemes 및 flavins 같은 cofactors가 포함되어 있습니다. 플라 빈의 산화 형태 ~ 360과 450 nm의 흡광도에서 맥시멈을 제시하며, 감소는 일반적으로 450 nm의 7시 흡광도 감소에 따라 감시하고 있습니다. 일반적으로 일부 과도 중간체가 존재하지만 정규 spectrophotometers로 측정되어야하는 형태와 부식이 너무 빠르다. 응용 Photophysics SX20 중지 흐름 분광 광도계 (또는 이와 유사한 악기)를 사용하면, 그것은 밀리초 시간 척도에서 흡광도 변화 (죽은 시간, 2 MS) 측정이 가능하다. 여기 모델로 봉사, 플라빈 의존 monooxygenase F SidA의 reductive 및 산화 반 반응을 공부했습니다. 수소 전송 속도는 무산소 조건 하에서 NADPH과 효소를 혼합 후 452 nm의 흡광도에서의 변화를 측정에 의해 결정되었다. 그 후, advantag를 복용전체 감소가 달성되기 전까지 중지 흐름 악기의 이중 혼합 모드 E, 효소가 먼저 나서 할인 효소-NADP + 복잡한는 산소와 혼합되었다, NADPH로 반응했다. 이 절차에 따라 그것은 일시적인 산소 플라 빈의 중간체를 감지하고 형성과 붕괴의 속도를 측정할 수 있습니다. 이러한 중간체의 식별은 촉매의 반응 수종의 특성에 대한 실험 데이터를 제공합니다. F SidA, hydroxylating 수종입니다 C4a-hydroperoxyflavin (일반적으로 370-380 nm의에서 모니터)의 형성의 경우. 또한, 각 단계의 일정한 비율을 측정하는 것은 한 반응의 속도 – 결정 단계에 대한 정보를 얻고 효소의 운동 및 화학적 메커니즘을 명료하게하다하는 데 도움이 있습니다.
일반적으로 유사한 접근 방식은 같은 단백질과 같은 다른 flavoenzymes하거나, 발생한 변경되는 흡광도를 위해 단백질, 사용할 수있는 cont아무것도 헴, 피리 독살 인산, 또는 비 헴 철 8-10. 이 방법의 한계는 정화 효소의 대량이 필요한 것이지만, 이것은 높은 수율로 표현 시스템을 사용하여 극복할 수 있습니다. 하나는 강한 충분한 신호가 관찰 수 있도록 충분한 단백질을 사용하여 녹음 스펙트럼을위한 최적의 단백질 농도를 결정하지만, 너무 많은 그래서 효소가 낭비되지 않습니다. 일반적으로 정지 – 유동 실험에 사용 플라빈 함유 효소의 낮은 효소 농도는 6-10 μm의 (혼합 후)이고 효소의 해당 어금니 흡광 계수를 사용하여 결정됩니다. F SidA의 경우에는 효소 구속 유행의 비율 50~65% 2입니다. 바운드 유행의 cofactor는 촉매 작용에 필요한이므로 APO-단백질은 이러한 실험에서 비활성 상태로 간주됩니다. 이 방법의 또 다른 가능한 제한 효소의 프로세스가 발생할 경우 2보다 더 빠른 MS가 (정지 – 흐름의 죽은 시간) 그들이 관찰되지 않는 일이다오히려이 요금은이 문제를 극복하기 위해 감소 수있는 전략을보고됩니다. 이것에 대한 한 예로 ferredoxin-NADP + 환원 효소 11 반응에 높은 NaCl 농도를 사용하여 포함한다. 정지 – 흐름의 흐름 회로에서 산소 닦고는 종종 본 실험에서 복잡한 단계이며 특별한주의가 필요합니다. 그것이 효과적이고 저렴한 방법이기 때문에 여기에 설명된 포도당 산화 효소 포도당 시스템은 대부분의 실험실에서 성공적으로 사용됩니다. 그러나, H 2 O 2의 생산을 포함하고 어떤 어플 리케이션을 위해 protocatechuate dioxygenase-protocatechuate 시스템과 같은 다른 대안는 12 간주되어야하는 몇 가지 단점이 있습니다. 무산소 글러브 박스의 활용은 쉽게 무산소 조건을 보장하기 위해 만들지만, 필수가 아닙니다. 우리가 효소가 산소의 부재로 감소되고 싶어하거나 농도에서 산소와 반응으로 산소가 정지 흐름의 흐름 회로에서 제거되어야합니다우리가 지정한들. 정지 – 흐름 글러브 박스에 있지만 우리가 이전 실험에서 에어로빅 버퍼를 사용한 경우, 산소 유량 회로에 있습니다. 흡광도 측정뿐만 아니라, 형광 및 원형 dichroism의 assays는 해당 액세서리와 응용 Photophysics SX20 중지 흐름 분광 광도계에서 수행할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
연구는 NSF 상을 MCB-1021384에 의해 지원.
General Laboratory Equipment | Company | Catalogue Number |
Vacuum pump | Welch | – |
Büchner flasks | Fisher | 70340-500 |
Stir bars | Fisher | 14-512-129 |
Stir plates | Fisher | 11-100-49S |
Schlenk lines | Kontes Glass | – |
Argon tank | Airgas | AR UPC300 |
Nitrogen tank | Airgas | NI200 |
Nitrogen tank, ultra high purity grade | Airgas | NI UHP200 |
Oxygen tank | Airgas | OX 40 |
5% Hydrogen balance nitrogen tank | Airgas | X02NI95B200H998 |
SX20 Stopped-flow spectrophotometer | AppliedPhotophysics | – |
Glove box | Coy | – |
Water bath | Brinkmann Lauda | – |
Supplies | ||
50 mL BD Falcon tubes | Fisher | 14-432-23 |
15 mL BD Falcon conical tubes | Fisher | 05-527-90 |
1.5 mL Eppendorf microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-18 |
50 and 25 mL glass vials | Fisher | 06-402 |
Rubber stoppers | Fisher | 06-447H |
Aluminum seals | Fisher | 06-406-15 |
Reagents | ||
Potassium phosphate, monobasic | Fisher | AC2714080025 |
Potassium phosphate, dibasic | Fisher | P288-500 |
Sodium acetate | Sigma | S-2889 |
Glucose oxidase from A. niger | Sigma | G7141-250KU |
D-Glucose | Fisher | D16-500 |
β-NADPH | Fisher | ICN10116783 |
L(+)-Ornithine hydrochloride | Fisher | ICN10116783 |