Summary
Assay כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית ואת היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay כולל תיוג תאים עם איזון כולסטרול, הכולסטרול בין בריכות תאיים ושחרור של כולסטרול כדי acceptor תאיים.
Abstract
תוכן כולסטרול בתאי יש לשמור בגבולות צרים מאוד, יותר מדי או מעט מדי כולסטרול בעוד כמה תוצאות תאים שיבוש של ממברנות הסלולר, אפופטוזיס ו נמק 1. תאים יכולים כולסטרול המקור סינתזה תאיים וממנה ליפופרוטאינים פלזמה, שני מקורות מספיקים כדי לספק את הדרישות באופן מלא של תאים כולסטרול. תהליכים של סינתזה ספיגת כולסטרול מוסדרים בחוזקה ליקויים של כולסטרול הן 2 נדיר. כולסטרול מופרזת היא בעיה נפוצה יותר 3. למעט hepatocytes וכן כמה תאים תואר adrenocortical, התאים אינם יכולים לבזות כולסטרול. לתאים יש שתי אפשרויות להפחתת כולסטרול התוכן שלהם: להמיר כולסטרול לתוך אסטרים cholesteryl, אופציה עם קיבולת מוגבלת כמו עומס יתר התאים עם אסטרים cholesteryl הוא גם רעיל, בזרימת כולסטרול, אפשרות בלתי מוגבלת עם יכולת פוטנציאלית. בזרימת כולסטרול הוא מפרטתהליך ific זה מוסדר על ידי מספר מובילי תאיים, כגון ה-ATP מחייב טרנספורטר קלטת חלבונים A1 (ABCA1) ו - G1 (ABCG1) ו הקולטן נבלות B1 סוג. Acceptor טבעי של כולסטרול בפלסמה הוא ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) אפוליפופרוטאין AI.
Assay בזרימת כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית. הוא מודד את היכולת של התאים לשמור בזרימת כולסטרול ו / או את היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay מורכב מהשלבים הבאים. שלב 1: תיוג כולסטרול הסלולר באמצעות הוספת כולסטרול שכותרתו עד בינוני סרום המכיל ו דוגרים עם תאים של 24-48 שעות. צעד זה עשוי להיות משולב עם הטעינה של תאים עם כולסטרול. שלב 2: הדגירה של תאים בינוניים סרום ללא כולסטרול כדי לאזן בין כל שכותרתו בריכות כולסטרול תאיים. שלב זה עשוי להיות משולב עם הפעלת הסלולר CHolesterol מובילי. שלב 3: הדגירה של תאים עם acceptor תאי ו quantitation התנועה של כולסטרול שכותרתו מתאי כדי acceptor. אם מבשרי כולסטרול שימשו לתייג כולסטרול מסונתז החדש, שלב 1/4, טיהור של כולסטרול, ייתכן שיהיה צורך.
Assay מספק את הפרטים הבאים: (א) כיצד טיפול מסוים (מוטציה, דפיקה למטה, ביטוי יתר או טיפול) משפיע על היכולת של התא כולסטרול בזרימת ו (ב) עד כמה את היכולת של acceptors פלזמה לקבל את הכולסטרול נגוע במחלה או טיפול. שיטה זו משמשת לעתים קרובות בהקשר של המחקר לב וכלי דם, הפרעות מטבוליות ו ניווניות, מחלות זיהומיות הרבייה.
Protocol
1. הכנת [3 H] כולסטרול
- בשכונה קטר, לוותר על הסכום הנדרש של כולסטרול [3 H] לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל (0.5 μCi (19 kBq) לכל גם נדרש assay אופייני).
- אם [3 H]-כולסטרול הוא תלוי טולואן, לייבש אותו לחלוטין עם גז N2 ו resuspend אתנול עם 100% ריכוז סופי של 1 μCi (37 kBq / μl. וורטקס ומערבבים היטב.
2. ציפוי תאים וסימון כולסטרול נייד
פרוטוקול זה נבדק באמצעות סוגי תאים הבאים: ומונוציטים האדם, 4.5 THP-1 אדם מונוציטים למוצרי ומקרופגים 6,7,8, גלם 264.7 ומקרופגים Murine 5,9,10,11, תאים הלה 12, וריד הטבור האדם אנדותל תאים (HUVEC), BHK-21 תאים 9, fibroblasts אדם ועכבר 13,14, HepG2 תאים hepatocarcinoma אדם 15 ו, בצורה שונה, החל טסיות <sup> 16.
- Resuspend תאים ולספור אותם. התאים לתוך צלחת של 12 צלחות גם בצפיפות הסופי של 0.2x10 6 תאים בכל טוב בינוני 0.9 מ"ל מלאה. תאים ימשיך לגדול ויגיע 0.8x10 6 תאים לכל גם כאשר הניסוי בזרימת. עבור תאים שאינם מתחלקים, כמו הבדיל THP-1 תאים, צפיפות זריעה צריך להיות 0.8x10 6 תאים לכל טוב. אם באמצעות 6 - או 24 גם צלחות, כפול או חצי את מספר התאים בכל טוב בהתאמה. מספר בארות צריך להיות מספיק קביעות ארבע פעמים עבור כל תנאי הניסוי.
- אם הבידול של THP-1 התאים נדרשת, להוסיף PMA (הריכוז הסופי 0.1 מיקרוגרם / מ"ל) לתקשורת של 48-72 שעות.
- הוסף aliquot קטנה של מדיה לתוך צינור המכיל microfuge [3 H] כולסטרול.
- לשטוף את הצדדים של הצינור עם התקשורת לפני הוספת [3 H] כולסטרול לתוך aliquot נפרד של אמצעי התקשורת מלאים (100 μl / טוב). <li> הוסף התקשורת המכילים [3 H] הכולסטרול על בארות עם תאים (נפח סופי לכל גם הוא 1 מ"ל). אם אין טיפול בתאי נדרש לפני תיוג, תאים ניתן מצופה ב [3 H] בינוני כולסטרול המכיל.
- דגירה התאים למשך 48 שעות בתרבית תאים בחממה (37 ° C, CO 5% 2).
3. איזון דגירה
- לאחר דגירה 48 שעות, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ. לוודא שהם בריאים הם במפגש כ 80%.
- הסר מדיה המכילה [3 H] כולסטרול. לשטוף את התאים בעדינות עם PBS. לחזור 3 פעמים כביסה.
- להכין סרום ללא התקשורת. במידת הצורך, להפעיל את התאים על ידי הוספת אגוניסט LXR (כגון, 901317 ב 1-4 mmol / L) או מחנה (0.3 μMol / L, עבור תאים ממוצא העכבר בלבד) כדי בסרום חופשי בתקשורת.
- הוסף 500 μl מדיה חופשיים בסרום היטב כל אחד מהם.
- דגירה של 18 שעות תרבית תאים בחממה (37 ° C, CO 5% 2).
- לאחר דגירה 18 שעות במדיום סרום חינם, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ. לוודא שהם בריאים confluent (מינימום 80% confluency).
- הכן את הפתרון של acceptors בזרימת הכולסטרול בדם ללא בינוני. דוגמאות acceptors כוללים:
אפוליפופרוטאין AI (apoA-I) (הריכוז הסופי 10 מיקרוגרם / מ"ל)
ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) (הריכוז הסופי 20 מיקרוגרם / מ"ל)
Cyclodextrin (הריכוז הסופי 200 מיקרוגרם / מ"ל)
פלזמה (הריכוז הסופי 1-2%) - לשטוף את התאים בעדינות עם PBS.
- הוסף 250 μl של סרום ללא מדיה עם acceptors היטב כל אחד מהם.
- לעזוב קבוצה אחת של בארות כדי לקבוע רקע בזרימת (בזרימת התקשורת חופשיים בסרום עם acceptor NO)
- דגירה תאים עבור 2 שעות תרבית תאים אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). משך הדגירה בזרימת עשוי לנוע בין 30 דקות ועד 8 שעות לפי הצורך.
5. עיבוד שאmples
- לאחר 2 שעות הדגירה לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ.
- איסוף מדיה לתוך צינורות 1.5 מ"ל microfuge. ספין ב -14,000 סל"ד 1-10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות הסלולר.
- להעביר Media 100 μl לתוך בקבוקון מ"ל 7 נצנץ. הוסף 5 MLS של Insta-ג'ל פלוס (PerkinElmer) תערובת מערבולת. לאחסן דגימות הנותרים ב 4 ° C.
- מניחים צלחות במקפיא למשך 30 דקות. הוסף 500 μl DH 2 O היטב כל אחד מהם. לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי כל התאים נוקף מעומק בארות. אם חסיד עדיין, או לעזוב את הצלחות עם DH 2 O על 4 מעלות צלזיוס בארות לילה או גירוד.
- לאחר כל התאים לא המריא, פיפטה למעלה ולמטה כדי לפרק את גושי תאים. העברת 100 μl לתוך צלוחיות 7 מ"ל נצנץ. הוסף 5 MLS של Insta-ג'ל פלוס (PerkinElmer) תערובת מערבולת. אחסן את לוחות הנותרים ב 4 ° C.
- מניחים צלוחיות נצנץ על מונה נצנץ. להגדיר מונה לספור על [3 H] בDPM יחידות.
6. ניתוח תוצאות
- שיעור בזרימת הכולסטרול בא לידי ביטוי בדרך כלל שיעור הכולסטרול עבר התאים acceptor. הנוסחה הבאה נעשה שימוש:
- בזרימת מסוימת מחושב כהפרש בין בזרימת בנוכחות או העדר acceptor (ריק).
7. ציר הזמן
8. נציג תוצאות
דוגמה לתוצאות של ניסוי בזרימת כולסטרול מוצג איור. 1. בניסוי זה THP-1 מונוציטים אדם היו מובחנים אל מקרופאגים ו בזרימת הכולסטרול acceptors שונים היהנבדק. בזרימת כולסטרול עד בינוני ללא acceptors ("ריק") היה 0.79% ואת ערך זה נחשב בזרימת שאינו ספציפי והיה מפחיתים את הערכים האחרים. בזרימת כולסטרול לאדם apoA-I (הריכוז הסופי 30 מיקרוגרם / מ"ל) היה 4.75%. מדגם פלזמה התייחסות נכלל לתוך הניסוי הזה כדי לפקח בין הניסוי השונות. מדגם התייחסות יכול לשמש נורמליזציה של נתונים על פני מספר רב של ניסויים, אבל מצאנו שנכון לחזור assay אם השונות היא גבוהה. פלזמה החולה (הריכוז הסופי 2%) נבדקה לפני ואחרי החולה קיבל טיפול תרופתי. הוא הגיע למסקנה כי התרופה לחולה הייתה השפעה שלילית על היכולת של פלזמה לתמוך בזרימת כולסטרול.
דוגמה נוספת של תוצאות הניסוי בזרימת מוצג איור. 2. בניסוי זה הגלם 264.7 מקרופאגים הופעלו או לא יופעלו על ידי הדגירה לילה עם אגוניסט LXR TO-901317 (הריכוז הסופי1 μmol / L) בזרימת כולסטרול מדגם זהה של פלסמה אנושית (2%) נבדק. הוא הגיע למסקנה כי הפעלת ביטוי הסלולר של רשת ABC עם מובילי אגוניסט LXR מגביר את היכולת של התאים לשחרר את הכולסטרול acceptor תאיים.
באיור 1. בזרימת כולסטרול מן THP-1 תאים acceptors שונים. אחוז בזרימת כולסטרול (דהיינו, את שיעור הכולסטרול שכותרתו עבר התאים acceptor הוגדר) מוצגת לאחר ניכוי המקרים של ערכים ריקים. ממוצע ± סטיית תקן של קביעות ארבע פעמים, * p <0.05.
איור 2. בזרימת כולסטרול מ 264.7 אחוז מופעל או לא מופעל עם אגוניסט LXR כדי פלזמה האדם. RAW של בזרימת כולסטרול (דהיינו, את שיעור הכולסטרול שכותרתו עבר התאיםacceptor המצוין) מוצגת לאחר ניכוי המקרים של ערכים ריקים. ממוצע ± סטיית תקן של קביעות ארבע פעמים, * p <0.001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת למדוד בזרימת כולסטרול נועד למדוד את התנועה של כולסטרול מן התאים acceptor כולסטרול תאי. ישנם שיקולים קריטיים מספר בהבנה זו מתודולוגיה.
Labelling ועל איזון
המתודולוגיה המתוארת כולסטרול שכותרתו מתווסף סרום סרום המכיל. למרות שמעולם לא נחקר בהרחבה, ההנחה היא כי כולסטרול הוא משולב בתוך ליפופרוטאינים בדם והם נתפסות על ידי התאים. חשוב לאפשר מספיק זמן ליפופרוטאינים להילקח מעלה את הכולסטרול ליפופרוטאין לעבור את ממברנות הסלולר. בדרך כלל 24 שעות תיוג מספיק, אבל תיוג עבור 48 שעות משיגה פעילות ספציפית גבוהה יותר של כולסטרול תאיים. זה צריך להביא בחשבון שאם [14 C] הכולסטרול משמש במקום של כולסטרול [3 H] (למשל בניסויים תיוג כפול), מעשה ספציפיivity לשעבר הוא נמוך מאוד והוספת כולסטרול שכותרתו מספיק כדי להשיג פעילות ספציפי המיועד עשויים להשתנות כולסטרול תוכן התא ובכך להשפיע על התוצאה. כמו כן, חשוב כי (א) אין כולסטרול שכותרתו או ליפופרוטאינים לכודים שאינם דווקא על פני התא כמו זה כולסטרול ישולבו במהירות על ידי acceptor באמצעות העברה לא ספציפית, וכן (ב) כולסטרול שכותרתו היא equilibrated בין תאיים שונים בריכות. למרות הניסיון שלנו 24 שעות הדגירה איזון במדיום סרום ללא מספיק כדי להשיג מטרות אלה, בדרך כלל 48 שעות הדגירה משמש. סוגי תאים רבים לא שורדים 48 שעות או אפילו 24 שעות במדיום סרום חינם. במקרה זה 0.1% BSA (בעיקר שומן חומצה חופשית) יכול לשמש תחליף. ליפופרוטאין, מדולדל או בסרום שונים בדם, החלפת תוספי יכול לשמש כמוצא אחרון, אך חשוב להכיר בכך סרום ליפופרוטאין מחסר עושה החלפת בסרום, תוספי C עשויontain apolipoproteins וזה עשוי להשפיע על התוצאה. לרוע המזל היצרנים לעיתים קרובות לא לחשוף את ההרכב של תוספי.
משך הדגירה בזרימת
בזרימת כולסטרול מוביל הטעינה של כולסטרול כדי acceptor תאי ודלדול של כולסטרול בתאים. שינויים בתוכן הכולסטרול של שני תאים נוטלים עלול לשבש את שיעור ומאפיינים אחרים של בזרימת כולסטרול. יתר על כן, אם acceptor מכיל כולסטרול (למשל ה-HDL) הוא עשוי לעבור acceptor לתאים ואם פעילות ספציפי של כולסטרול acceptor הופך להיות משמעותי, כי יסבך את הפרשנות של התוצאות. לכן, עדיף לשמור הדגירה בזרימת קצר ככל האפשר, המאפשר זמן זאת על כמות מספקת של כולסטרול שכותרתו לעבור לתאים acceptor כדי לאפשר זיהוי אמין. בדרך כלל 2-6 שעות זה הזמן המומלץ. Incubations יותר מ 24 שעות תשקף מצב של equilibrium ולכן יהיה מעיד על היכולת של acceptor לצבור כולסטרול ולא בשיעור של בזרימת כולסטרול.
Acceptor
Acceptors שונים ספציפית עבור מסלולים שונים של בזרימת כולסטרול. למדידת בזרימת כולסטרול ספציפי, apoA-I משמש כדי לשקף ABCA1 תלוי בזרימת תוך HDL או HDL המחודשת של ABCG1 ו-SR-B1 תלויי המסלולים. Cyclodextrin משמש לעתים קרובות כדי להעריך הלא ספציפית בזרימת. חשוב לכלול בניסוי מדגם "ריק", אשר אינו מכיל acceptor כלל, כדי למדוד את התרומה של ניתוק שאינו ספציפי של כולסטרול כולסטרול להשתחרר מתפוררים תאים מתים.
ריכוז acceptor
בזרימת כולסטרול כולל (א) שחרור של הכולסטרול על ידי התאים ו (ב) על ידי ספיגת acceptor, לשתי הפעולות יכול להיות שיעור הגבלת. אם מטרת הניסוי היא לבדוק שינוייםהיכולת של התאים לשחרר כולסטרול (למשל לאחר transfection או דפיקה למטה), ואז ריכוז acceptor לא צריכה להיות הגבלת קצב. עבור apoA-I ו-HDL הריכוזים של 30-50 מיקרוגרם / מ"ל בדרך כלל ללא הגבלת שער. אם היכולת של acceptor לתמוך בזרימת הכולסטרול הוא מטרת החקירה (למשל היכולת של HDL מבודד או דגימות פלסמה של חולים או בעלי חיים כדי לתמוך בזרימת כולסטרול), ואז ריכוז acceptor צריך להיות שיעור הגבלת. עבור apoA-I ו-HDL זה בדרך כלל 10 מיקרוגרם / מ"ל, עבור דגימות פלזמה זה הוא בדרך כלל 1-2%, אבל ניסוי ראשוני במינון התלות למצוא ריכוז נכונה היא חיונית כדי לבחור את המינון.
הפעלה של תאים
המרכיבים העיקריים האחראים בזרימת כולסטרול ספציפי שני מובילי ABC, ABCA1 ו ABCG1. שניהם מוסדרים LXR ו הדגירה מראש של תאים עם אגוניסט LXR (מתחם הפופולרית ביותר היא 901317, זמינים SigMA) השתמשו בריכוזים 1-4 μmol / L מגביר באופן משמעותי את שיעור הכולסטרול בזרימת ספציפי. תאים שמקורם בעכבר, כגון 264.7 RAW או J774, יכול גם להיות מופעל על ידי המחנה (0.3 mmol / L).
הטעינה של תאים עם כולסטרול
הטעינה של תאים עם הכולסטרול על ידי מראש דוגרים עליהם מורכבת acetylated או חמצון ה-LDL-כולסטרול או cyclodextrin גם מגרה בזרימת כולסטרול. זה צריך לזכור כי טעינת תאים, בעיקר מאקרופאגים עם שינויים כולסטרול היבטים רבים של חילוף החומרים שלהם. בחירת מודל (כולסטרול טעון מול לא הכולסטרול טעון) תלוי המטרה המדעית של המחקר.
הצגת התוצאות
בדרך כלל התוצאות של הניסוי בזרימת כולסטרול מוצגים כאחוז כולסטרול להשתחרר תאים: זה מבטל שונות ממספר תא בארות הפרט יעילות של תיוג. עם זאת, ההוא תקף רק אם הטיפול לא השפיע על ספיגת כולסטרול בזרימת בהעדר acceptor (ריק). אלו שני תנאים צריכים להיות מוכחת בניסוי.
תיאורטית בשיטה זו ניתן להשתמש כדי ללמוד בזרימת של ציבור כלשהו הסלולר acceptor תאיים. אם, שלא כמו כולסטרול, מתחם כזה metabolised, אז צעד טיהור אנליטית צריך להיכלל. יתר על כן, אם המתחם הוא מסונתז בתא, מבשרי סינטטיים ניתן להשתמש בהם תיוג. לדוגמה, [14 C] אצטט ו [3 H] המים שימשו ללמוד את מוצאו של כולסטרול מסונתז החדש ו [14 C] cholate ללימוד בזרימת של פוספוליפידים. במקרה זה כולסטרול מסונתז החדש צריך להיות מופרד מבשרי ביניים, בדרך כלל על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים שום אינטרסים מנוגדים הקשורים במחקר זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד לבריאות ומחקר רפואי המועצה של אוסטרליה (NHMRC) (526615 ו - 545906) ו בין השאר על ידי תוכנית של ממשלת ויקטוריאני OIS. DS הוא בחור של NHMRC.
References
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
- Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
- Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
- Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
- Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
- D'Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
- Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
- Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
- Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).
- Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
- Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
- Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
- Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).
