Cholesterol efflux Assay

Summary

Den cholesterol-assay er designet til at kvantificere graden af ​​cholesterol efflux fra dyrkede celler og kapaciteten af ​​plasma acceptorer til at modtage cholesterol frigivet fra cellerne. Analysen består af mærkning af celler med kolesterol, ligevægt af kolesterol blandt intracellulære pools og frigivelse af kolesterol til et ekstracellulært acceptor.

Abstract

Cholesterolindholdet af celler skal være inden for meget snævre grænser, for meget eller for lidt cholesterol i en celle resulterer i afbrydelse af cellulære membraner, apoptose og nekrose ^1. Celler kan kilde kolesterol fra intracellulær syntese og fra plasmalipoproteiner, begge kilder er tilstrækkelige til fuldt ud at tilfredsstille cellernes krav til kolesterol. Processerne for kolesterol syntese og optagelse er stramt reguleret, og mangler af kolesterol er sjældne ^2. Overdreven kolesterol er mere almindeligt problem ^3. Med undtagelse af hepatocytter og i nogen grad adrenocorticale celler er celler, i stand til at nedbryde cholesterol. Celler har to muligheder for at reducere deres kolesterol indhold: at konvertere kolesterol i cholesterylestere, en mulighed med begrænset kapacitet, som overbelastning celler med cholesterylestrene er også giftigt, og cholesterol efflux, en option med potentielt ubegrænset kapacitet. Cholesterol efflux er specforsk proces, der reguleres af en række intracellulære transportører, såsom ATP-binding kassetten transportør proteiner A1 (ABCA1) og G1 (ABCG1) og scavenger-receptor type B1. Den naturlige acceptor af cholesterol i plasma er high density lipoprotein (HDL) og apolipoprotein AI.

Den cholesterol efflux assayet er designet til at kvantificere graden af ​​cholesterol efflux fra dyrkede celler. Den måler kapaciteten af ​​celler til at opretholde cholesterol efflux og / eller kapaciteten af ​​plasma acceptorer til at modtage cholesterol frigivet fra cellerne. Assayet består af følgende trin. Trin 1: mærkning cellulær cholesterol ved tilsætning mærket cholesterol til serum-holdigt medium og inkubering med celler i 24-48 timer. Dette trin kan kombineres med lastning af celler med cholesterol. Trin 2: inkubation af celler i serumfrit medium for at ækvilibrere mærket cholesterol hos alle intracellulære cholesterol pools. Dette trin kan kombineres med aktivering af cellulære lmolesterol transportører. Trin 3: inkubering af celler med ekstracellulær acceptor og mængdebestemmelse af bevægelse af mærket cholesterol fra celler til acceptoren. Hvis cholesterol forstadier blev anvendt til at mærke nyligt syntetiserede cholesterol, et fjerde trin, oprensning af cholesterol, kan være nødvendig.

Analysen leverer følgende oplysninger: (i), hvordan en bestemt behandling (en mutation, en knock-down, en overekspression eller en behandling) påvirker effektiviteten af ​​cellen til efflux kolesterol og (ii) hvordan kapaciteten af ​​plasma acceptorer at acceptere kolesterol er påvirket af en sygdom eller en behandling. Denne metode anvendes ofte i forbindelse med hjerte-kar-forskning, metaboliske og neurodegenerative sygdomme, infektionssygdomme og reproduktive sygdomme.

Protocol

1. Fremstilling af ^{[3H]-cholesterol}

1. I stinkskabet, dispensere den krævede mængde af ^[3H] cholesterol i et 1,5 ml mikrofugerør (0,5 uCi (19 kBq) per brønd er nødvendig for en typisk assay).
2. Hvis ^{[3H]-kolesterol} suspenderes i toluen, tørres ned fuldstændigt med N2-gas og resuspender med 100% ethanol til en slutkoncentration på 1 uCi (37 kBq / ul. Vortexes og bland godt.

2. Udplade celler og Mærkning Cellular Kolesterol

Denne protokol er blevet testet under anvendelse af følgende celletyper: humane monocytter ^4,5, THP-1 humane monocyt-makrofager ^,6,7,8 RAW 264.7 murine makrofager ^5,9,10,11, HeLa-celler ^12, human navlevene endothelial celler (HUVEC), BHK-21 celler ^9, humane og muse fibroblaster ^13,14 og HepG2 humane hepatocarcinoma celler ^15, og i modificeret form, fra blodplader <sup> 16.

1. Resuspender cellerne og tælle dem. Plade celler i 12-brønds plader ved den endelige tæthed 0.2x10 ⁶ celler per brønd i 0,9 ml komplet medium. Celler vil fortsætte med at stige og vil nå 0.8x10 ⁶ brønd på tidspunktet for udstrømningen eksperimentet. For celler, der ikke opdeler såsom differentierede THP-1 celler, skal podningstæthed være 0.8x10 ⁶ celler pr. Hvis der anvendes 6 - eller 24-brønds plader, dobbelt-eller halvdelen af ​​det antal celler per brønd hhv. Antallet af brønde skal være tilstrækkelig til firdobbelte bestemmelser for hver forsøgsbetingelse.
2. Hvis differentiering af THP-1 celler er påkrævet, tilsættes PMA (endelig koncentration 0,1 ug / ml) til mediet i 48-72 timer.
3. Tilsættes en lille alikvot af mediet ind i mikrofuge-rør indeholdende ^[3H] cholesterol.
4. Vask sider af røret med medium før tilsætning af ^[3H] cholesterol i en separat aliquot af komplette medier (100 gl / brønd).
<li> Tilsæt medier indeholdende ^[3H] cholesterol til brønde med celler (slutvolumen per brønd er 1 ml). Hvis ingen behandling af celler, før mærkning, kan celler udpladet i ^[3H] cholesterol-holdigt medium.
5. Cellerne inkuberes i 48 timer i cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO _2).

3. Ligevægtsindstilling Inkubation

1. Efter 48 timers inkubation, se celler under mikroskop. Sikre, at de er sunde og er på cirka 80% sammenflydning.
2. Fjern mediet indeholdende ^[3H] cholesterol. Vask cellerne forsigtigt med PBS. Gentag 3 vaske gange.
3. Fremstille serumfrie medier. Hvis det kræves, aktivere celler ved tilsætning LXR agonist (såsom AT-901.317 ved 1-4 mmol / L) eller cAMP (0,3 mmol / l, for celler af museoprindelse alene) til serumfrit-medier.
4. Tilsættes 500 gl serumfri medium til hver brønd.
5. Inkuber i 18 timer i cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO _2).

<p class = "jove_title"> 4. Cholesterol efflux Inkubation

1. Efter 18 timers inkubation i serumfrit medium, se celler under mikroskop. Sikre, at de er sunde og sammenflydende (minimum 80% sammenflydning).
2. Fremstil en opløsning af cholesterol efflux acceptorer i serum-frit medium. Eksempler på acceptorer indbefatter:
   Apolipoprotein AI (ApoA-I) (endelig koncentration 10 ug / ml)
   High density lipoprotein (HDL) (endelig koncentration 20 ug / ml)
   Cyclodextrin (slutkoncentration 200 ug / ml)
   Plasma (slutkoncentration 1-2%)
3. Vask cellerne forsigtigt med PBS.
4. Tilsæt 250 pi serumfrit medium med acceptorer til hver brønd.
5. Efterlader et sæt brønde for at bestemme baggrunden udstrømning (udstrømning i serumfrie medier med NO acceptor)
6. Cellerne inkuberes i 2 timer i cellekultur inkubator (37 ° C, 5% CO _2). Varigheden af ​​udstrømningen inkubation kan variere fra 30 minutter til 8 timer efter behov.

5. Behandling Samples

1. Efter 2 timers inkubation kontrollere celler under mikroskop.
2. Samle mediet i 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Centrifugering ved 14.000 rpm i 1-10 min ved stuetemperatur for at fjerne cellerester.
3. Overfør 100 ul medium i 7 ml scintillationshætteglas. Tilsæt 5 ml Insta-gel Plus (PerkinElmer) og vortex-blanding. Opbevares resterende prøver ved 4 ° C.
4. Placere pladerne i fryseren i 30 minutter. Tilsæt 500 pi _dH2O til hver brønd. Se celler under mikroskop for at sikre, at alle celler er løftet fra bunden af ​​brøndene. Hvis stadig klæbende, efterlader enten plader med dH ₂ O ved 4 ° C natten over eller skrabe brønde.
5. Når alle celler er løftet, pipetteres op og ned for at opbryde celleklumper. Overfør 100 ul i 7 ml scintillationshætteglas. Tilsæt 5 ml Insta-gel Plus (PerkinElmer) og vortex-blanding. Opbevares resterende plader ved 4 ° C.
6. Anbring scintillationshætteglas på scintillationstæller. Konfigurer tæller til at tælle til ^[3 H] idpm enheder.

6. Analyse af resultaterne

1. Hastigheden af ​​cholesterol efflux udtrykkes sædvanligvis som en del af cholesterol flyttet fra celler til acceptoren. Følgende formel anvendes:

2. Den specifikke udstrømning beregnes som forskellen mellem udstrømningen i nærvær eller fravær af acceptor (blindprøve).

7. Tidslinje

8. Repræsentative resultater

Et eksempel på et resultat af en cholesterol efflux eksperiment er vist i fig. 1. I dette eksperiment THP-1-humane monocytter blev differentieret til makrofager og cholesterol efflux forskellige acceptorer vartestet. Cholesterol efflux til medium uden acceptorer ("blank") var 0,79%, og denne værdi blev betragtet som en non-specifik efflux og blev subtraheret fra andre værdier. Cholesterol efflux til human ApoA-I (endelig koncentration 30 ug / ml) var 4,75%. En reference plasma-prøve blev inkluderet i dette eksperiment at overvåge inter-eksperimentel variation. En referenceprøve, kan anvendes til normalisering af data fra et stort antal eksperimenter, men vi har fundet det hensigtsmæssigt at gentage assayet, hvis variation er høj. En patient plasma (slutkoncentration 2%) blev testet før og efter patienten er blevet behandlet med lægemiddel. Det blev konkluderet, at denne patient medicin havde en negativ indvirkning på kapaciteten af ​​plasma til at understøtte cholesterol efflux.

Et andet eksempel på et resultat af udstrømningen eksperimentet er vist i fig. 2. I dette eksperiment RAW 264.7 makrofager blev aktiveret eller ikke aktiveres ved inkubering natten over med LXR agonist til-901.317 (slutkoncentration1 umol / l) og cholesterol efflux samme prøve af humant plasma (2%) blev testet. Det blev konkluderet, at aktivering af cellulær ekspression af ABC-transportører med LXR agonist forøger kapaciteten af ​​celler for at frigive cholesterol til ekstracellulær acceptor.

Figur 1. Cholesterol efflux fra THP-1 celler til forskellige acceptorer. Procentdel af cholesterol efflux (dvs. den del af mærket cholesterol flyttet fra celler til den angivne acceptor) er vist efter subtraktion af blindværdier. Middel ± SD af firdobbelte bestemmelser, * p <0,05.

Figur 2. Cholesterol efflux fra RAW 264,7 aktiveres eller ikke aktiveres med LXR agonist til human plasma. Procentdel af cholesterol efflux (dvs. den del af mærket cholesterol flyttet fra celler tilangivet acceptor) er vist efter subtraktion af blindværdier. Middel ± SD af firdobbelte bestemmelser, * p <0,001.

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåde til måling cholesterol efflux er designet til at måle bevægelsen af ​​cholesterol fra celler til en ekstracellulær cholesterol acceptor. Der er flere kritiske overvejelser i forståelsen af ​​denne metode.

Mærkning og ækvilibrering

I den beskrevne metode mærket cholesterol sættes til serumholdigt serum. Selv aldrig undersøgt i detaljer, antages det, at cholesterol er inkorporeret i serumlipoproteiner, og de optages af celler. Det er vigtigt at give tilstrækkelig tid til lipoproteiner, der skal tages op og for kolesterol at flytte fra lipoproteiner til cellemembraner. Sædvanligvis 24 h mærkning er tilstrækkelig, men mærkning i 48 timer opnås højere specifik aktivitet af intracellulært cholesterol. Det bør tages i betragtning, at hvis ^[14C] cholesterol i stedet for ^[3H] cholesterol (f.eks dobbelt mærkning eksperimenter), den specifikke handlingivity af førstnævnte er meget lav, og tilføje nok mærket kolesterol til at opnå hensigten specifik aktivitet kan ændre cellens kolesterol indhold og dermed påvirke resultatet. Det er også vigtigt, at (i) der er ingen mærket cholesterol eller lipoproteiner ikke-specifikt fanget på celleoverfladen, da dette cholesterol hurtigt vil blive inkorporeret i en acceptor via ikke-specifik overførsel og (ii) mærket cholesterol ækvilibreres mellem forskellige intracellulære puljer. Selvom der i vores erfaring 24 timer ækvilibrering inkubation i serumfrit medium er tilstrækkelig til at opnå disse mål, sædvanligvis 48 h inkubation anvendes. Mange celletyper ikke overlever i 48 h eller endda 24 h i serumfrit medium. I dette tilfælde 0,1% BSA (i det væsentlige fedtsyrer fri) kan fungere som erstatning. Lipoproteinfrit serum eller forskellige serum-udskiftning kosttilskud kan bruges som en sidste udvej, men det er vigtigt at erkende, at lipoprotein-mangelfuld serum gør, og serum-udskiftning kosttilskud kan contain apolipoproteiner og der kan påvirke resultatet. Desværre producenterne ofte ikke afsløre sammensætningen af ​​kosttilskud.

Varigheden af ​​efflux inkubation

Cholesterol efflux fører til lastning af cholesterol til en ekstracellulær acceptor og udtømning af cholesterol i celler. Ændringer i cholesterol indhold af begge celler og acceptor, kan påvirke hastigheden og andre egenskaber af cholesterol efflux. Hvis endvidere acceptor indeholder cholesterol (f.eks HDL) kan bevæge sig fra acceptoren til celler, og hvis specifikke aktivitet af cholesterol i acceptoren bliver signifikant, som vil komplicere fortolkningen af ​​resultaterne. Således er det bedst at holde udstrømning inkubation så kort som muligt, så imidlertid tid tilstrækkelig mængde af mærket cholesterol til at bevæge sig fra celler til acceptoren at muliggøre en pålidelig detektion. Generelt 2-6 timer er den anbefalede tid. Inkuberinger længere end 24 timer ville afspejle en tilstand af equilibrium og derfor vil være indikativ for evne acceptoren til at akkumulere cholesterol end hastigheden af ​​cholesterol efflux.

Acceptor

Forskellige acceptorer er specifikke for forskellige veje for cholesterol efflux. Til måling af specifikke cholesterol efflux-ApoA I anvendes til at afspejle ABCA1-afhængig udstrømning medens HDL eller rekonstitueret HDL til ABCG1 og SR-B1-afhængige veje. Cyclodextrin anvendes ofte til vurdering af ikke-specifik efflux. Det er vigtigt, at i eksperimentet en "blank" prøve, som ikke indeholder acceptor overhovedet til måling af mængden af ​​ikke-specifik dissociation af cholesterol og cholesterol frigivet fra disintegrerende døde celler.

Koncentrationen af ​​acceptoren

Cholesterol efflux omfatter (i) frigivelse af cholesterol i celler og (ii) dens optagelse af en acceptor, kan begge trin være hastighedsbegrænsende. Hvis den eksperimentelle formål er at undersøge ændringer ievne af celler for at frigive cholesterol (fx efter transfektion eller knock-down), så koncentrationen af ​​acceptoren bør ikke være hastighedsbestemmende. For ApoA-I og HDL koncentrationerne på 30-50 ug / ml er sædvanligvis ikke hastighedsbegrænsende. Hvis kapaciteten af ​​acceptoren til at understøtte cholesterol efflux er målet for undersøgelsen (f.eks kapacitet isoleret HDL-eller plasmaprøver fra patienter eller dyr til at understøtte cholesterol efflux), så koncentrationen af ​​acceptoren skal hastighedsbegrænsende. For ApoA-I og HDL dette sædvanligvis 10 ug / ml, for plasmaprøver er sædvanligvis 1-2%, men en indledende dosis-afhængighed eksperiment for at finde en korrekt koncentration er vigtigt at vælge dosis.

Aktivering af celler

De centrale elementer, der er ansvarlige for specifikke cholesterol efflux er to ABC-transportører og ABCA1 og ABCG1. Begge reguleres af LXR og præ-inkubering af celler med LXR agonist (mest populære forbindelse er til-901.317 fås fra Sigma) anvendt ved koncentrationer 1-4 umol / L øger andelen af ​​specifikke cholesterol efflux. Celler af museoprindelse, såsom RAW 264,7-eller J774, kan også aktiveres af cAMP (0,3 mmol / L).

Lastning af celler med cholesterol

Læsning af celler med kolesterol ved præ-inkubere dem med acetyleret eller oxideret LDL eller cyclodextrin-kolesterol kompleks også stimulerer cholesterol efflux. Det skal erindres, at lastning celler, især makrofager med kolesterol ændringer mange aspekter af deres stofskifte. Valg af model (kolesterol læsset versus ikke kolesterol indlæst) afhænger videnskabelige mål med undersøgelsen.

Præsentation af resultaterne

Sædvanligvis resultatet af cholesterol efflux forsøg er præsenteret som en procentdel af cholesterol frigivet fra cellerne: Dette eliminerer variation fra celleantal i individuelle brønde og effektivitet mærkning. Imidlertid ther er kun gyldig, hvis behandlingen ikke påvirker kolesterol optagelsen og efflux i fravær af acceptor (tom). Disse to betingelser skal være eksperimentelt bevist.

Teoretisk kan denne metode anvendes til at studere udstrømning af en cellulær kreds til en ekstracellulær acceptor. Hvis modsætning cholesterol er en sådan forbindelse omdannes derefter en analytisk oprensningstrin skal inkluderes. Yderligere, hvis forbindelsen er syntetiseret i cellen, kan syntetiske prækursorer kan anvendes til mærkning. For eksempel ^[14C] acetat og ^[3H] vand blev anvendt til at undersøge udstrømningen af nyligt syntetiserede cholesterol og ^[14C]-cholat til undersøgelse af udstrømningen af phospholipider. I dette tilfælde nyligt syntetiserede cholesterol skal adskilles fra forstadier og mellemprodukter, sædvanligvis ved tyndtlagskromatografi.