Summary
En rask metode for volatile sammensatte analyse i frukt er beskrevet. De flyktige forbindelser til stede i frivolum en homogenat av utvalget raskt skilles ut og oppdaget med ultrarask gasskromatografi (GC) kombinert med en Surface Acoustic Wave (SAW) sensor. En prosedyre for datahåndtering og analyse er også diskutert.
Abstract
Tallrike og diverse fysiologiske endringer forekomme under frukt modning, herunder utvikling av en bestemt flyktig blanding som karakteriserer frukt aroma. Forfall ved høsting er en av de viktigste faktorene som påvirker smaken kvaliteten på frukt og grønnsaker 1. Validering av robuste metoder som raskt vurderer frukt modenhet og aroma kvalitet ville tillate bedre forvaltning av avanserte avlsprogram, produksjon praksis og Kombinasjonen av håndtering.
Over de siste tre tiårene har mye forskning vært gjennomført for å utvikle såkalte elektroniske neser, som er enheter i stand til å raskt oppdage lukt og smaker 2-4. Foreløpig er det flere kommersielt tilgjengelige elektroniske neser i stand til å utføre volatile analyse, basert på ulike teknologier. Den elektroniske nesen brukes i vårt arbeid (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), består av ultra-rask gasskromatografi kombinert med en overflate akustisk bølge sensor (UFGC-SAW). Denne teknologien har allerede blitt testet for sin evne til å overvåke kvaliteten på ulike råvarer, deriblant deteksjon av forverring i eple 5, modenhet og råte evaluering i mango 6, aroma profilering av thymus arter 7; C 6 flyktige forbindelser i drue bær 8; karakterisering av vegetabilsk olje 9 og påvisning av adulterants i virgin kokosolje 10.
Dette systemet kan utføre de tre store skritt av aroma analyse: headspace prøvetaking, separasjon av flyktige forbindelser, og gjenkjenning. I omtrent ett minutt, vil effekten, et kromatogram, produsert og etter en sletting syklus, er instrumentet klar for videre analyse. Resultatene er oppnådd med zNose kan sammenlignes med de andre gass-kromatografisk systemer ved beregning av Kovats Indekser (KI). Når apparatet er innstilt med en alkane standard løsning, er oppholdstidene automatisk konvertert tilKIS. Det er imidlertid små endringer i temperatur og strømningshastighet forventes å skje over tid, forårsaker retensjonstider å drive. Også avhengig av polariteten på kolonnen stasjonære fasen, kan reproduserbarheten av KI beregninger variere med flere indeks enheter 11. En rekke programmer og grafiske grensesnitt ble derfor utviklet for å sammenligne beregnede KIS blant prøvene i en semi-automatisert måte. Disse programmene redusere tiden som kreves for kromatogram analyse av store datasett og færrest mulig feiltolking av data når kromatogrammer ikke er perfekt justert.
Vi presenterer en metode for rask volatile sammensatte analyse i frukt. Prøveopparbeidelse, datainnsamling og håndtering prosedyrer blir også diskutert.
Protocol
1. Prøvepreparering
- Harvests frukter på ønsket utviklingsstadium. Skyll med vann fra springen for å fjerne skitt og støv.
- Velg frukt for analyse basert på fravær av eksterne og interne feil, og størrelsen homogenitet.
- Skjær frukt i lengderetningen i båter som skal benyttes for volatile prøvetaking. Hvis det er aktuelt, fjerner hud, frø, frø hulrom vev, eller grop. Frukt vev utvalget må være konsekvent gjennom hele eksperimentet og ta hensyn til variasjonen innenfor en enkelt frukt (dvs. få prøve like fra ekvator, blomstre og stem end deler).
- Kombiner den valgte frukt vev, bland det i orden å randomisere den, og deretter veie ut 200 g i en blender.
- Tilsett 200 ml av mettet CaCl 2 oppløsning (372.5 g ved 20 ° C, i 500 ml avionisert vann) og 50 mL av en 100 mm løsning av 2-methylbutyl isovalerate i metanol. Den CaCl 2 er ment å fungere som en hemmer av enzymatisk activitet, som kan forekomme etter klipping og homogenisere frukten kjøtt. 2-Methylbutyl isovalerate legges til som en intern standard for å overvåke eventuelle tap av flyktige forbindelser i løpet av homogenisering prosessen.
- Homogenisere blandingen i et laboratorium blender (Waring, USA), i 30 sekunder på 18.000 rpm, deretter umiddelbart helles i glass flaske og forsegling med Teflon lokk. Hold homogenat i flasken ved romtemperatur før alle prøvene er forberedt.
- Etter å helle homogenat i flasken, vente i 10 minutter for å tillate utskilling av skum fra væsken, og pipetter 5 ml alikvoter av væske, uten skum, i 20 ml glass rav ampuller og forsegle hetteglassene med stål skrukorker utstyrt med Teflon / silikon septa. Denne prosedyren er egnet for melon og pære homogenat forberedelse. Hvis andre frukter brukes til analysen, kan en sentrifugering skritt være nødvendig. Derfor, fjern skummet og deretter sentrifuger væsken til pelletskaminer partikler som kanhindrer pipette. Forbered minst tre ampuller per prøve å tjene som teknisk replikater.
- På dette punktet kan prøvene analyseres umiddelbart eller flash-frosset i flytende nitrogen og lagret ved ultra-lav temperatur (-80 ° C) for senere analyse.
- For frosne prøver, på analyse dagen fjerne prøvene fra fryseren og la dem tine en time ved romtemperatur. Etter tining og før analyse, erstatte korken med en ny en som har en ren, tørr septum. Hvis septum ikke blir erstattet, kan vann kondensere på septum under tining bli trukket inn i instrumentet og skade den.
2. Gasskromatografi-Surface Acoustic Wave (GC-SAW) Set-up og Data Acquisition
- Legg i riktig analysemetode på zNose.
For analyse av ester-rik volatile profilen melon, våre parametre i MicroSense versjon 5.44.22 programvare (Newbury Park, CA, USA) er som følger: headspace sug inninnløp i 20 sekunder ved 30 ml min -1 via pumpe; innløpstemperatur ved 200 ° C; Tenax felle temperatur på 225 ° C; bæregass (helium renhet 99.999%) flow rate på 2,9 ml min-1, kolonne (DB-5 kolonne, 1 m × 0,25 mm ID × 0,25 mikrometer tykkelse) temperatur program fra 45 ° C til 180 ° C med en hastighet på 10 ° C sek -1; sensor temperatur på 40 ° C; ventil på 165 ° C. Den totale analysen er 1 minutt per prøve. - Koble til en rustfritt stål nål med ikke-sentrere kjernen tips til zNose innløp og rense systemet flere ganger med uteluft til grunnlinjen er stabil og ingen topper større enn 200 Counts (Ct) blir oppdaget.
- Still inn instrumentet med en løsning av rette kjetting alkaner (C6-C14). Låten Resultatet brukes av instrumentet programvare for å konvertere retensjonstiden av eluted toppene fra tidsenheter inn Kovats Index (KI) enheter. Følgelig, etter at systemet er innstilt, er oppholdstidene rapportert i KI enheter. Før analysen, la utvalget til stabilisering i 30 minutter. For å analysere en av prøven hetteglass, stikker en nål inn i hetteglasset septum å avlaste trykket. Deretter setter nålen koblet til instrumentet innløp i hetteglasset septum og initiere headspace prøvetaking. Analyser minst tre teknisk replikater per prøve.
- Manuell start instrumentet ved å klikke på "Play"-knappen, pumpen aktiveres og trekker damp presentere ovenfor prøven. På slutten av analysen, vises et kromatogram på skjermen, og sensoren automatisk varmes opp til 150 ° C i 10 sekunder for å rengjøre den. Når systemet status boksen knappen blir grønn igjen, er instrumentet klar til å analysere en ny prøve.
- For å sikre en stabil baseline og riktig system rengjøring, kjøre minst en flybillett blank mellom hver prøve. For å overvåke for mulig flyktig forurensning fra hetteglasset og cap, analysere to hetteglass-blanks (tomme hetteglass med cap), i begynnelsen og slutten av dagen. </ Li>
3. Dataeksport og analyse
- Eksportere data til en Microsoft Excel-fil etter oppkjøpet ved hjelp av "Peak logging"-funksjonen i MicroSense programvare. Når dataene er eksportert, legge til kolonner som inneholder etiketter for variabler og replikerer.
- Forvandle dataformatet for enklere manipulering med Python (versjon 2.6, fritt tilgjengelig på nettet) script vi utviklet, kalt "reform_data.py" (se figur 1 for et eksempel på dataformatet før og etter bruk av skriptet "reform_data. py "). Navnet på kildefilen (xls-format) og ark navn for inndata, samt ønsket filnavn for utdata (xls-format), redigeres direkte i skriptet.
- Start "kim_interface.py" (også skrevet i Python 2.6, se figur 2), og importere data fra filen genereres i forrige trinn. Spesielt er analysen basert på visning og analysere antall ganger hver KI verdi ble påvist("Ki hits"). Dermed programmet viser et søylediagram av ki treff for hver KI verdi.
- Evaluere KI treff i spesifikke undergrupper av prøver, analysere hver gruppe av teknisk replikat sammen. For å gjøre dette, analysere hver behandling eller variabel separat ved å sjekke / fjerne merkingen de tilsvarende boksene. Se figur 2 bildetekst for detaljert beskrivelse av det grafiske brukergrensesnittet (GUI) funksjoner.
- Etter å identifisere bredden på hver KI vinduet med GUI, tilfeldig velge noen av de tilsvarende kromatogrammer i Microsense software og vurdere overlappende topper blant de teknisk replikatene. Se Figur 3 for et eksempel på overtrukket kromatogrammer av to tekniske replikater.
- Når KI vinduet er individuated, bruk 'Merge "-funksjonen tilgjengelig i GUI å flette KIS som faller i vinduet, inn i den mest befolkede KI. Ved å bruke denne funksjonen, er topper merket med en rekke KI verdier samlet på én KI etikett, allowing behandle slike topper som en enkelt variabel.
For å gjøre dette, klikker du først på "Flett"-knappen for å aktivere funksjonen, og velg den mest befolkede KI som sentrum av vinduet ved å venstreklikke tilsvarende bar. Når baren er valgt, endrer den farge og blir grønt. For å flette KIS som faller innenfor vinduet i det valgte KI, høyreklikk på de tilsvarende linjene, dette fører til at barene å bli rød, mens en blå bar av tilsvarende lengde legges på toppen av den sentrale KI (Se figur 4 ). Når alle de valgte KIS har blitt fusjonert inn i riktig sentrale KI, klikk på "Merge"-knappen igjen for å godta endringene, dette fører til at "Flett"-knappen for å gulne. I tilfelle av feil, er "Unmerge"-knappen også tilgjengelig. Til unmerge, klikker du Unmerge "-knappen i GUI, og deretter høyreklikker du på den røde linjen du ønsker å unmerge. Fra rødt, blir stolpen blå. Klikk på 'Unmerge "knappen igjen for å godta endringene. - Hvis man forsøker å incorrectly fusjonere to topper i en enkelt prøve i ett KI verdi, er en feilmelding skrives ut. I slike tilfeller nøye sjekk kromatogrammet og redefinere KI vinduet i denne regionen.
- Når alle de fusjonerende operasjoner har blitt utført, lagrer du filen.
- Før du fortsetter med statistisk analyse, er kromatogrammer i luften og hetteglasset blanks analyseres for å overvåke for mulige forurensinger. Når KI av toppene i de tomme feltene har blitt identifisert, trekker området til toppen oppdaget i luft-og / eller hetteglass-blank fra det området av topp stede i prøven.
Deretter fortsetter med statistisk analyse.
4. Representative Resultater
Den elektroniske nesen var i stand til å oppdage forskjeller i flyktige profiler blant melon frukt høstet på ulike forfall stadier (figur 5). Tjue KI vinduene ble identifisert på tvers av alle prøvene. En variansanalyse viste at 14 topper Detected av elektronisk nese varierte betydelig mellom modenhet etapper. I figur 6, er loggen over de gjennomsnittlige peak områdene disse 14 komponentene planla å vise forskjeller i peak hopetall mellom to forfall etapper, tidlig modne og fullt moden frukt.
Figur 1. Eksempler på data format eksportert fra instrument programvare (A) og etter transformasjon, utført ved hjelp av "reform_data.py" script (B). For å lette datamanipulasjon og analyse, er alle de unike KIS identifisert på tvers av alle prøvene, så dataene er omorganisert med prøven informasjon i rader og topp området i kolonner, tilsvarende unike KIS. Hvis en topp ikke blir oppdaget i en KI verdi i en prøve, forblir den tilsvarende cellen tom.
Figur 2. Skjermbilde fra Skriftenet file "kim_interface.py". Plottet i sentrum viser antall treff pr KI versus KI. «Hit per KI 'er antall prøver der en topp med den spesifikke KI ble oppdaget. På venstre side er det tre gule bokser som kontrollerer de valgte dataene. De viser parametere for å dele datasettet (behandlinger, gjentak, kvalitative variabler, etc.). I denne figuren, er de (fra øverst til nederst): Variety, Planting dato og utviklingsstadium ved høsting. På bunn: ved å klikke på de 3 barer og flytte den blå linjen til venstre eller til høyre, kan man velge minimum og maksimum verdi av KI rekkevidde, og minimum peak området ('Threshold "). På høyre: den "Merge"-knappen lar sammenslåing utvalgte KIS ved manuelt å klikke på barer i plottet. The 'Unmerge-knappen gjør det mulig å reversere prosessen for utvalgte saker.
Figur 3. Overtrukket kromatogrammer (i svart og rød) av to teknisk replikat fra melon volatile headspace å illustrere et skifte i oppholdstid.
Figur 4. Eksempel på KI sammenslåing prosedyren. I den sentrale tomten, representerer den grønne linjen (Central KI) den mest befolkede KI, som har blitt valgt som sentrum i KI vinduet. KI X og KI Y er KIS faller i vinduet av interesse og de trenger å bli fusjonert inn i sentrale KI. Ved å høyreklikke på KI X-bar, blir det rødt, og på samme tid, vises det en blå bar med samme lengde på KI X-bar, på toppen av den grønne. Ved å gjenta samme prosedyre for KI Y, lengden på den blå linjen (Innfusjonerte KIS) vil øke av tilsvarende lengde. Når alle KIS har blitt lagt til, ved å klikke på den grønne "Merge"-knappen, de fusjonerende prosessen avsluttes, lagres endringene, og knappen fargen blir gul.
/ Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg "/>
Figur 5. To kromatogrammer av melon prøver høstet på forskjellig modenhet stadier, tidlig moden (øverst) og fullmoden (nederst), for å illustrere muligheten for elektronisk nese til å oppdage forskjeller i flyktige hopetall.
Figur 6. Radar plott som viser toppen område av 14 komponenter som finnes i to melon prøver på to forskjellige forfall stadier, tidlig modne og fullt moden. The Peak områdene er rapportert i logskalaen å hjelpe visualisere sammenligning. Tallene ved utgangen av hvert ray representerer de tilsvarende Kovats indeksene.
Discussion
Elektroniske neser representerer en lovende metode for rask, objektiv vurdering av aroma profiler fra frukt eller flyktige-rike prøver. Men skifter i oppholdstid representere en utfordring for topp identifisering og kan føre til feiltolking av data når to kromatogrammer ikke er perfekt justert. Visuell inspeksjon av kromatogrammer indikerte at variasjonen av oppholdstid mellom prøvene ofte forårsaket den samme toppen som skal merkes med litt andre KI verdier (ca ± 10). Dette oversettes til en overdrevet antall unike KIS oppdaget. For å dra nytte av de fakta som (a) ulike forbindelser er tilstede på ulike forfall stadier og (b) teknisk gjentak er omtrent identiske, to PC-baserte skript ("kim_merge.py", som inneholder rutiner for håndtering av data set, og "kim_interface.py", som gir et grafisk brukergrensesnitt (GUI)) ble utviklet for å systematisksammenligne prøvene på en semi-automatisert måte, noe som reduserer tiden som trengs for kromatogram analyse av store datasett. Disse programmene la konsolidering, eventuelt av topper merket med en rekke KI verdier under ett KI etikett. Dette tjener to viktige formål: (a) det muliggjør en statistisk analyse for å behandle slike topper som en enkelt variabel, og (b) det letter topp identifisering og sammenligning med andre systemer og publiserte verdier. Resultatene som presenteres her indikerer at melon prøvene kunne diskrimineres basert på modenhet og aroma profilering bruke zNose system i kombinasjon med tilstrekkelig KI identifikasjon. Dette representerer en lovende ny teknologi for analyse av flyktige som kan benyttes for kvalitetskontrollprogrammer.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Bill klarer (Harris Moran Seed Company, Davis) for å gi melon frukt for denne analysen. Dette prosjektet er støttet av Spesialist Avlinger Research Initiative Competitive Grants-programmet gir nei. 2009-51181-05783 fra USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | MP Biomedicals | 195088 | |
| 2-Methylbutyl isovalerate | SAFC Global | W350613 | ≥ 98%, natural, FCC |
| Methanol | Fisher Scientific | A411-4 | |
| Vial | Sigma-Aldrich | SU860098 | |
| Cap | Sigma-Aldrich | SU860101 | |
| Laboratory blender | Waring Laboratory | 7009G | 2-speed blender; 1- Liter glass container |
| Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Pyrex, 500 mL; polypropylene plug-seal |
| Needle | Electronic Sensor Technology | TLC101046 | Side hole luer |
| Alkanes solution | Electronic Sensor Technology | C6-C14 alkanes solution in methanol | |
| zNose | Electronic Sensor Technology | Model 4500 | |
| DB-5 GC column | Electronic Sensor Technology | SYS4500C5 | |
| MicroSense | Electronic Sensor Technology | Version 5.44.22 | |
| Python 2.6 | Freely available on-line | ||
| "reform_data.py" and "kim_interface.py" scripts | Scripts available as supplementary material on JoVE |
References
- Kader, A. A. Flavor quality of fruits and vegetables. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88, 1863-1868 (2008).
- Persaud, K., Dodd, G. Analysis of discriminant mechanisms in the mammalian olfactory system using a model nose. Nature. 299, 352-355 (1982).
- Gardner, J. W., Bartlett, P. N. A brief-history of electronic noses. Sensors and Actuators. 18, 211-220 (1994).
- Rock, F., Barsan, N., Weimar, U. Electronic nose: Current status and future trends. Chem. Rev. 108, 705-725 (2008).
- Li, C., Heinemann, P. H., Irudayaraj, J. Detection of apple deterioration using an electronic nose and zNose. Transactions of the Asabe. 50, 1417-1425 (2007).
- Li, Z. F., Wang, N., Raghavan, G. S. V., Vigneault, C. Ripeness and rot evaluation of 'Tommy Atkins' mango fruit through volatiles detection. J. Food Eng. 91, 319-324 (2009).
- Oh, S. Y., Ko, J. W., Jeong, S. Y., Hong, J. Application and exploration of fast gas chromatography-surface acoustic wave sensor to the analysis of thymus species. J. Chromatogr. A. 1205, 117-127 (2008).
- Watkins, P., Wijesundera, C. Application of zNose for the analysis of selected grape aroma compounds. Talanta. 70, 595-601 (2006).
- Gan, H. L., Man, Y. B. C., Tan, C. P., NorAini, I., Nazimah, S. A. H. Characterisation of vegetable oils by surface acoustic wave sensing electronic nose. Food Chem. 89, 507-518 (2005).
- Marina, A. M., Man, Y. B. C., Amin, I. Use of the SAW Sensor Electronic Nose for Detecting the Adulteration of Virgin Coconut Oil with RBD Palm Kernel Olein. Journal of the American Oil Chemists Society. 87, 263-270 (2010).
- Evans, M. B., Haken, J. K. Recent developments in the gas-chromatographic index scheme. Journal of Chromatography. 472, 93-127 (1989).
