Summary
En snabb metod för flyktig förening analys i frukt beskrivs. De flyktiga föreningar som föreligger i det övre utrymmet av ett homogenat av provet snabbt separeras och detekteras med en ultrasnabb gaskromatografi (GC) kopplad med en ytakustisk våg (SAW)-sensor. Ett förfarande för hantering av data och analys diskuteras också.
Abstract
Många och olika fysiologiska förändringar under fruktmognad, inklusive utvecklingen av en specifik flyktigt blandning som kännetecknar frukt arom. Mognad vid skörden är en av de viktigaste faktorer som påverkar smaken kvaliteten på frukt och grönsaker 1. Validering av robusta metoder som snabbt bedöma frukt mognad och arom kvaliteten skulle tillåta förbättrad förvaltning av avancerade avelsprogram, praxis produktion och efter skörd hantering.
Under de senaste tre decennierna har mycket forskning gjorts för att utveckla så kallade elektroniska näsor, som är apparater som kan för att snabbt upptäcka lukter och smaker 2-4. För närvarande finns det flera kommersiellt tillgängliga elektroniska näsor kan utföra flyktiga analyser, baserade på olika tekniker. Den elektroniska näsan som används i vårt arbete (zNose, EST, Newbury Park, CA, USA), består av ultra-snabb gaskromatografi i kombination med en akustisk våg sensor (UFGC-SAW). Denna teknik har redan testats för sin förmåga att övervaka kvaliteten på olika varor, bland annat upptäcka försämringar i Apple 5, mognad och röta utvärdering mango 6, doft profilering av bräss arter 7, C 6 flyktiga föreningar i vindruvor 8; karakterisering av vegetabilisk olja 9 och upptäcka manipulationer i Virgin kokosolja 10.
Detta system kan utföra de tre viktigaste stegen i doft analysen: headspace provtagning, separation av flyktiga föreningar och detektion. I ca en minut, matas utsignalen, ett kromatogram, som produceras och, efter en rening cykel, är instrumentet redo för ytterligare analys. De resultat som erhölls med zNose kan jämföras med dem för andra gas-kromatografiska system genom beräkning av Kovats Index (Kl). När instrumentet har avstämd med en alkan standardlösningen är retentionstiderna automatiskt omvandlas tillKI. Emellertid är små förändringar i temperatur och flödeshastighet förväntas inträffa med tiden, vilket orsakar retentionstider att glida. Också, beroende på polariteten hos kolonnen stationära fasen, kan reproducerbarheten av KI beräkningar variera med flera indexenheter 11. En serie program och grafiska gränssnitt har därför utvecklats för att jämföra beräknade KIs bland prov i ett semi-automatiserat sätt. Dessa program minska den tid som krävs för kromatogram analys av stora datamängder och minimera risken för feltolkning av data när kromatogrammen inte perfekt linje.
Vi presenterar en metod för snabb flyktig förening analys i frukt. Provberedning, datainsamling och hantering, diskuteras också.
Protocol
1. Provberedning
- Harvest frukter i önskad mognad skede. Sköljning med kranvatten för att avlägsna smuts och damm.
- Välj frukter för analys, baserade på frånvaron av yttre och inre defekter och storlek homogenitet.
- Skär frukten i längdriktningen i klyftor som skall användas för flyktiga provtagning. I förekommande fall, ta bort skal, frön, utsäde hålrum vävnad eller grop. Frukt vävnaden val måste vara konsekvent genom hela experimentet och ta hänsyn till variationer i en enda frukt (dvs. få prov även från ekvatorn, blomma och stjälkdelar slut).
- Kombinera den valda frukten vävnaden, blanda det för att slumpa den och sedan väger upp 200 g i en mixer.
- Tillsätt 200 ml mättad CaCl2-lösning (372,5 g vid 20 ° C, i 500 ml avjoniserat vatten) och 50 pl av en 100 mM lösning av 2-metylbutyl isovalerat i metanol. Den CaCl 2 är tänkt att fungera som en hämmare av enzymatisk ACvitet, vilket kan inträffa efter skärning och homogenisering fruktköttet. 2-metylbutyl isovalerat tillsätts som en intern standard för att övervaka eventuella förluster av flyktiga ämnen under homogeniseringen processen.
- Homogenisera blandning i en laboratorieblandare (Waring, USA), i 30 sekunder vid 18.000 rpm, sedan omedelbart häll glasflaska och tätning med Teflon lock. Hålla homogenatet i flaskan vid rumstemperatur tills alla prover framställes.
- Efter hällning av homogenatet in i flaskan, vänta 10 minuter för att möjliggöra separation av skummet från vätskan, då pipetten 5 ml alikvoter av vätska, utan skum, i 20 ml glasflaska bärnsten små medicinflaskor och försegla flaskorna med lock stålskruv försedda med Teflon / silikon septa. Detta förfarande är lämpligt för melon och päron homogenat beredning. Om andra frukter används för analysen, kan ett centrifugeringssteg krävas. Därför, ta bort skummet och sedan centrifugera vätskan pellets partiklar som skulle kunnahindra pipett. Bered minst tre flaskor per prov för att tjäna som teknisk replikat.
- Vid denna punkt kan proverna analyserades omedelbart eller snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid ultralåg temperatur (-80 ° C) för senare analys.
- För frysta prover på analysen dagen ta prover från frysen och låt dem tina i en timme vid rumstemperatur. Efter upptining och före analys ska burkens lock med en ny som har en ren, torr septum. Om septumet inte ersätts, kan vatten kondenseras på skiljeväggen vid upptining dras in i instrumentet och skada den.
2. Gaskromatografi-ytakustisk Wave (GC-SAW) Set-up och Data Acquisition
- Ladda lämplig analysmetod på zNose.
För analys av ester-rika flyktig profilen melon, våra parametrar i MicroSense versionen 5.44.22 mjukvara (Newbury Park, CA, USA) är som följer: gasutrymme sugning in iinlopp i 20 sekunder vid 30 ml min -1 via pump, inloppstemperatur vid 200 ° C, Tenax fällan temperatur vid 225 ° C, bärgas (helium renhet 99,999%) flöde på 2,9 ml min-1, kolonn (DB-5 kolonn, 1 m x 0,25 mm ID x 0,25 ^ m filmtjocklek) temperaturprogram från 45 ° C till 180 ° C vid en hastighet av 10 ° C sek -1; sensorn temperatur vid 40 ° C; ventil vid 165 ° C. Den totala analystiden är 1 minut per prov. - Ansluta en nål av rostfritt stål med icke borrande spets till zNose inlopp och rena systemet flera gånger med omgivande luft tills baslinjen är stabil och inga toppar är större än 200 räknevärden (Ct) detekteras.
- Stämma instrumentet med användning av en lösning av rakkedjiga alkaner (C6-C14). I storleksordningen resultatet används som instrumentet mjukvara för att omvandla retentionstiden för de eluerade topparna från tidsenheter i Kovats index (Kl)-enheter. Följaktligen efter att systemet är inställd, är retentionstiderna redovisas i KI-enheter. Före analys, så att provet uppnå jämvikt under 30 minuter. För att analysera ett av de prov flaskor, sätt en nål i flaskan septum för att lindra trycket. Sedan in nålen ansluten till instrumentet inloppet i flaskan septum och initiera headspace provtagning. Analysera minst tre tekniska replikat per prov.
- Manuellt starta instrumentet genom att klicka på "Play"-knappen, pumpens aktiveras och drar bort ångorna närvarande över provet. Vid slutet av analysen visas ett kromatogram på skärmen, och sensorn automatiskt upphettas till 150 ° C under 10 sekunder för att rengöra den. När systemet statusrutan knappen blir grön igen är instrumentet redo att analysera ett annat prov.
- För att säkerställa en stabil baslinje och korrekt system för rengöring, kör minst en luft tom mellan varje prov. För att övervaka för eventuella flyktiga föroreningar från flaskan och locket, analysera två flaska-ämnen (tomma flaskan med lock) i början och slutet av dagen. </ Li>
3. Data Export och analys
- Exportera data till ett Microsoft Excel-fil efter förvärvet med "Peak loggning" funktionen i MicroSense programvara. När data exporteras, lägga till kolumner som innehåller etiketter för variabler och replikat.
- Omvandla det dataformat för lättare hantering med hjälp av Python (version 2,6, fritt tillgänglig på nätet) script vi utvecklat, med namnet "reform_data.py" (se figur 1 för ett exempel på dataformat före och efter användning av skript "reform_data. py "). Namnet på källfilen (xls-format) och plåt namn för indata, liksom önskat filnamn för utdata (xls-format) är redigeras direkt i skriptet.
- Starta "kim_interface.py" (även skrivet i Python 2,6, se figur 2) och importera data från filen som genereras i föregående steg. Närmare bestämt är analysen baserad på visa och analysera hur många gånger varje KI värde upptäckta("KI hits"). Således programmet visar ett stapeldiagram över KI träffar för varje KI värde.
- Utvärdera KI hits av specifika undergrupper av prover, analysera varje grupp av teknisk replikat tillsammans. För att göra detta, analysera varje behandling eller variabel separat genom att markera / avmarkera motsvarande rutor. Se figur 2 bildtext för detaljerad beskrivning av det grafiska användargränssnittet (GUI) funktioner.
- Efter att ha identifierat bredden på varje KI fönstret med hjälp av GUI, slumpmässigt välja något av motsvarande kromatogrammen i Microsense program och utvärdera överlappande toppar bland tekniska replikat. Se figur 3 för ett exempel på överlagrade kromatogram av två tekniska replikat.
- När KI fönstret individualiseras, använd "Merge"-funktionen tillgänglig i GUI att sammanföra KIs som faller i fönstret, i den mest befolkade KI. Genom att använda den här funktionen finns toppar märkta med en rad KI värden samman under ett och samma KI etikett, allowing behandla sådana toppar som en enda variabel.
För att göra detta först klicka på "Merge" knappen för att aktivera funktionen och välja den mest befolkade KI som centrum av fönstret genom att vänsterklicka på motsvarande baren. När baren har valts, ändrar den färg och blir grön. Att slå samman KIs som faller inom fönstret i den valda KI, högerklicka på motsvarande stängerna, vilket gör att stängerna bli röd, medan en blå stapel av motsvarande längd läggs på toppen av den centrala KI (se figur 4 ). När alla de valda KIs har slagits samman till det lämpliga centrala KI, klicka på "Merge"-knappen igen för att acceptera ändringarna, vilket gör att "Merge" för att gulna. Vid fel, är "unmerge"-knappen också. För längre kommer, klicka på "unmerge" knappen i GUI, högerklicka på den röda baren som du vill unmerge. Från röd, blir stapeln blå. Klicka på "unmerge"-knappen igen för att acceptera ändringarna. - Om man försöker att incorrectly samman två toppar i ett enda prov till en enda KI värde är ett felmeddelande ut. Under sådana omständigheter, nära kontrollera kromatogrammet och omdefiniera KI fönstret i regionen.
- När alla de fusionerande verksamheten har utförts, spara filen.
- Innan statistisk analys är kromatogram i luften och ämnen injektionsflaska analyseras för att övervaka eventuella föroreningar. När väl KI av topparna i det att ämnena har identifierats, subtrahera arean av toppen detekteras i luft-och / eller ampull-ämnet från toppytan närvarande i provet.
Fortsätt sedan med statistisk analys.
4. Representativa resultat
Den elektroniska näsan kunde upptäcka skillnader i flyktiga profilerna bland melon frukt som skördats vid olika löptid stadier (Figur 5). Tjugo KI fönstren identifierades i alla prover. En analys av variansen visade att 14 toppar DeTected av den elektroniska näsan varierade kraftigt mellan mognad steg. I figur 6, är loggen för de genomsnittliga toppareorna av dessa 14 komponenter ritas för att visa skillnader i topp bestånd mellan två förfall steg, tidig mogna och helt mogen frukt.
Figur 1. Exempel på dataformatet som exporterats från instrumentets programvara (A) och efter transformation, som utförs med hjälp av "reform_data.py" script (B). För att underlätta datamanipulation och analys, är alla unika KIs identifierade i alla prover, sedan uppgifterna ordnas med prov information i rader och toppyta i kolumner, motsvarande unika KIs. Om en topp inte detekteras för ett Ki-värde i ett prov, förblir den motsvarande cellen tom.
Figur 2. Skärmdump från skrifternaT filen "kim_interface.py". Handlingen i centrum visar antalet träffar per KI kontra KI. "Hit per KI" är det antal prover i vilka en topp med den specifika KI upptäcktes. På vänster sida finns tre gula rutor styr de valda uppgifterna. De visar parametrar för att dela upp datamängden (behandlingar, replikat, kvalitativa variabler, etc.). I denna figur är de (från topp till botten): Variety, plantering datum och Maturity stadium vid skörd. På botten: genom att klicka på 3 barer och flytta det blå fältet till vänster eller till höger, kan man välja den minsta och det högsta värdet på KI området, och den minsta topparean (Threshold "). På höger: "Sammanfoga"-knappen kan samman utvalda KIs genom att manuellt klicka på staplarna i diagrammet. Den "unmerge"-knappen gör att man kan vända processen för utvalda fall.
Figur 3. Överlagrade kromatogram (i svart och rött) av två tekniska replikat från melon flyktigt headspace för att illustrera en förändring i uppehållstid.
Figur 4. Exempel på KI sammanslagning förfarandet. I den centrala tomten representerar det gröna fältet (Central KI) den mest befolkade KI, som har valts som centrum för KI fönstret. KI X och KI Y är KIs faller i fönstret av intresse och de behöver slås samman i den centrala KI. Genom att högerklicka på KI X bar, blir den röd och samtidigt visas ett blått fält av samma längd av KI X bar, på toppen av den gröna. Genom att upprepa samma procedur för KI Y, längden på det blå fältet (sammanslagna KIs) kommer att öka i motsvarande längd. När alla KIs har lagts genom att klicka på den gröna "Merge"-knappen, de fusionerande processen avslutas, sparas ändringarna, och knappen färgen blir gul.
/ Files/ftp_upload/3821/3821fig5.jpg "/>
Figur 5. Två kromatogram av melon skördade vid olika löptider stadier, tidig mogen (överst) och helt mogna (botten), för att illustrera förmågan hos elektronisk näsa för att detektera skillnader i flyktiga tätheter.
Figur 6. Radar diagram som visar topparean av 14 komponenter i två melon prov vid två olika löptider steg, tidig mogna och helt mogna. Toppareorna rapporteras i log-skala för att hjälpa visualisera jämförelse. Siffrorna i slutet av varje stråle representerar motsvarande Kovats Index.
Discussion
Elektroniska näsor representerar en lovande metod för den snabba, objektiv utvärdering av arom profiler från frukter eller flyktiga-rika prover. Men har en förändrad uppehållstid utgör en utmaning för topp identifiering och kan leda till feltolkningar av data när två kromatogram inte är perfekt i linje. Visuell inspektion av kromatogram visade att variationen av retentionstiderna bland prover orsakas ofta samma topp som skall märkas med lite olika KI-värden (ca ± 10). Detta kan översättas till en överdriven antal unika upptäckta KIs. För att dra fördel av de fakta som (a) olika föreningar är närvarande vid olika löptid stadier och (b) tekniska replikerar är ungefär identiska två datorbaserade skript ("kim_merge.py", som innehåller rutiner för hantering av data uppsättning, och "kim_interface.py", som tillhandahåller ett grafiskt användargränssnitt (GUI)) har utvecklats för att systematisktjämföra prover i en halvautomatiserad sätt, vilket kraftigt minskar den tid som krävs för kromatogram analys av stora datamängder. Dessa program tillåter konsolidering, i förekommande fall, av topparna märkta med en rad KI värden under en enda KI etikett. Detta tjänar två viktiga syften: (a) den möjliggör en statistisk analys för att behandla sådana toppar som en enda variabel, och (b) den underlättar topp identifiering och jämförelse med andra system och publicerade värden. Resultat som presenteras här visar att melon prover skulle kunna diskrimineras på grundval av mognad och arom profilering med zNose i kombination med lämplig KI identifiering. Detta utgör en lovande ny teknik för analys av flyktiga ämnen som kan användas för program för kvalitetskontroll.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Bill Klarar (Harris Moran Seed Company, Davis) för att ge melon frukt för denna analys. Projektet stöds av specialgrödor Research Initiative konkurrenskraftig Grants inte bevilja. 2009-51181-05783 från USDA National Institute of livsmedel och jordbruk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | MP Biomedicals | 195088 | |
| 2-Methylbutyl isovalerate | SAFC Global | W350613 | ≥ 98%, natural, FCC |
| Methanol | Fisher Scientific | A411-4 | |
| Vial | Sigma-Aldrich | SU860098 | |
| Cap | Sigma-Aldrich | SU860101 | |
| Laboratory blender | Waring Laboratory | 7009G | 2-speed blender; 1- Liter glass container |
| Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1C | Pyrex, 500 mL; polypropylene plug-seal |
| Needle | Electronic Sensor Technology | TLC101046 | Side hole luer |
| Alkanes solution | Electronic Sensor Technology | C6-C14 alkanes solution in methanol | |
| zNose | Electronic Sensor Technology | Model 4500 | |
| DB-5 GC column | Electronic Sensor Technology | SYS4500C5 | |
| MicroSense | Electronic Sensor Technology | Version 5.44.22 | |
| Python 2.6 | Freely available on-line | ||
| "reform_data.py" and "kim_interface.py" scripts | Scripts available as supplementary material on JoVE |
References
- Kader, A. A. Flavor quality of fruits and vegetables. Journal of the Science of Food and Agriculture. 88, 1863-1868 (2008).
- Persaud, K., Dodd, G. Analysis of discriminant mechanisms in the mammalian olfactory system using a model nose. Nature. 299, 352-355 (1982).
- Gardner, J. W., Bartlett, P. N. A brief-history of electronic noses. Sensors and Actuators. 18, 211-220 (1994).
- Rock, F., Barsan, N., Weimar, U. Electronic nose: Current status and future trends. Chem. Rev. 108, 705-725 (2008).
- Li, C., Heinemann, P. H., Irudayaraj, J. Detection of apple deterioration using an electronic nose and zNose. Transactions of the Asabe. 50, 1417-1425 (2007).
- Li, Z. F., Wang, N., Raghavan, G. S. V., Vigneault, C. Ripeness and rot evaluation of 'Tommy Atkins' mango fruit through volatiles detection. J. Food Eng. 91, 319-324 (2009).
- Oh, S. Y., Ko, J. W., Jeong, S. Y., Hong, J. Application and exploration of fast gas chromatography-surface acoustic wave sensor to the analysis of thymus species. J. Chromatogr. A. 1205, 117-127 (2008).
- Watkins, P., Wijesundera, C. Application of zNose for the analysis of selected grape aroma compounds. Talanta. 70, 595-601 (2006).
- Gan, H. L., Man, Y. B. C., Tan, C. P., NorAini, I., Nazimah, S. A. H. Characterisation of vegetable oils by surface acoustic wave sensing electronic nose. Food Chem. 89, 507-518 (2005).
- Marina, A. M., Man, Y. B. C., Amin, I. Use of the SAW Sensor Electronic Nose for Detecting the Adulteration of Virgin Coconut Oil with RBD Palm Kernel Olein. Journal of the American Oil Chemists Society. 87, 263-270 (2010).
- Evans, M. B., Haken, J. K. Recent developments in the gas-chromatographic index scheme. Journal of Chromatography. 472, 93-127 (1989).
