Encelliga Profilering av u och mogen näthinneneuroner

Summary

En metod för isolering av enskilda retinala celler och efterföljande amplifiering av deras cDNA är beskriven. Encelliga transkriptomik avslöjar graden av cellulär heterogenitet som finns i en vävnad och avslöjar nya markörgener för sällsynta cellpopulationer. Den åtföljande protokollet kan anpassas för att passa många olika celltyper.

Abstract

Högspecialiserade, men ytterst små populationer av celler spelar en viktig roll i många vävnader. Identifieringen av cell-typspecifika markörer och gener program uttryck för extremt sällsynta cellundergrupper har varit en utmaning med normala hela-vävnad metoder. Gene expression profiling av individuella celler möjliggör oöverträffad tillgång till celltyper som utgör endast en liten andel av den totala vävnaden ^1-7. Dessutom kan denna teknik användas för att undersöka de program genuttryck som transient uttrycks i små antal celler under dynamiska utvecklingsmässiga övergångar ^8.

Detta nummer av cellulära mångfald uppstår upprepade gånger i det centrala nervsystemet (CNS) där neuronala kopplingar kan förekomma mellan ganska olika celler ^9. Det exakta antalet distinkta celltyper är inte exakt känd, men det har uppskattats att det kan finnas så många som 1000 olika typer i hjärnbarken itself ^10. Funktionen (s) av komplexa neurala kretsar kan förlita sig på några av de sällsynta neuronala typerna och de gener de uttrycker. Genom att identifiera nya markörer och hjälpa till att molekylärt klassificera olika nervceller, är encelliga strategi särskilt användbart vid analys av celltyper i nervsystemet. Det kan också bidra till att belysa mekanismerna för neural utveckling genom att identifiera differentiellt uttryckta gener och vägar gen under tidiga stadier av neuronala stamceller utveckling.

Som en enkel, lättillgänglig vävnad med stor neuronal mångfald är ryggradsdjuret näthinnan en utmärkt modell för att studera processer för cellulär utveckling, neuronal differentiering och neuronal diversifiering. Men liksom i andra delar av CNS, kan denna cellulära mångfald ett problem för att bestämma de genetiska vägar som driver retinala progenitorceller att anta en specifik cell öde, särskilt med tanke på att stavar utgör maritetsbeslut av den totala retinala cell-populationen ^11. Här rapporterar vi en metod för identifiering av transkripten som uttrycks i enkla retinala celler (figur 1). Den encelliga profilering tekniken gör det möjligt att bedöma av mängden heterogenitet finns inom olika cellulära populationer av näthinnan ^2,4,5,12. Dessutom har denna metod visat en mängd nya kandidatgener som kan spela roll (er) i cellen öde beslutsprocesser som sker i delmängder av retinala stamceller ^8. Med några enkla justeringar av protokollet, kan denna teknik användas för många olika vävnader och celltyper.

Protocol

1. Celldissociation

1. Ett flödesschema som beskriver protokollet visas är figur 1. För katalognummer på de speciella reagenser som används i hela detta protokoll, se tabell 1. Dissekera näthinnan i en PBS-bad. Under dissektion, är det bäst att avlägsna glaskroppen och linsen sedan hålla dem med näthinnan kan hämma dissociation. Det är inte alltid kritiskt viktigt att avlägsna allt av det retinala pigmentepitelet (RPE) och i vissa fall kan det vara omöjligt att fullständigt avlägsna det. Men för enstaka experiment cell profilering av fotoreceptorer, bör RPE tas bort. Underlåtenhet att ta bort RPE kan leda till förorening av profilerna stång cell med RPE uttryckta gener. Detta är antagligen beroende på sambandet mellan fotoreceptorerna och RPE.
   För dissociation, är hela den vuxna murina näthinnor inkuberades vid 37 ° C under 10 min i en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 20il aktiverat papain, 20 | il 25 mM cystein i 5 mM EDTA och 360 ^ il Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med tillsats av 10 mM HEPES. Filter spets pipettspetsar används för alla steg i hela protokollet för att minimera eventuella föroreningar. Papain koncentration och tid för inkubation kommer att variera beroende på ålder och typ av vävnad. Till exempel, för att dissociera utveckla näthinnor isolerats vid postnatal dag 0 (P0), inkubera i näthinnan i 10 | il aktiverat papain, 10 | il 25 mM cystein i 5 mM EDTA och 380 ^ il Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med tillsats av 10 mM HEPES under 10 min vid 37 ° C. Näthinnor från olika arter kräver också lite olika förutsättningar. Kyckling näthinnor är tunnare än mus näthinnor på de flesta stadier av utveckling. Användning av 10 | il aktiverat papain, 10 | il 25 mM cystein i 5 mM EDTA och 380 ^ il Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med tillsats av 10 mM HEPES under 5 min vid 37 ° C är tillräcklig för att dissociera tessa näthinnan.
2. Knacka försiktigt på röret för att få bort eventuella avvecklade celler, så finfördela försiktigt 10-20 gånger med en P1000 pipett. Inkubera i ytterligare 10 minuter vid 37 ° C om stora klumpar av vävnad kvarstår och sedan åter finfördela 10-20 gånger.
3. Tillsätt 5 pl av DNas I (10 U / ^ il) och inkubera under 5 min vid rumstemperatur. Finfördela försiktigt med en P1000 pipett. Det exakta antalet gånger kommer att behöva bestämmas empiriskt, men i allmänhet ligger mellan 10-20.
4. Centrifugera i en bordsskiva centrifug vid 3000 rpm under 3 minuter Avlägsna supernatanten och lämnar 100-200 pl av vätska vid botten, och knacka på röret för att lösgöra pelleten. Tillsätt 1 ml HBSS och återsuspendera pelleten med försiktig triturering. Knacka på röret är avgörande här som bara resuspendering pelleten med Lyse många av de retinala celler. Detta är speciellt sant med vuxna murina näthinnor.
5. Centrifugera vid 3000 rpm under 3 minuter avlägsna försiktigt supernatanten och resuspendera i 450 pl PBS innehållaning 0,1% BSA. Det är viktigt att avlägsna så mycket av den supernatant som möjligt för att minimera närvaron av mRNA från lyserade celler och av produkter från dissociationen som kan inhibera framtida reaktioner.

2. Skörd Enstaka celler

1. Framställa två 6 cm skålar innehållande 5 ml PBS kompletterad med 0,1% BSA. Plattan de dissocierade cellerna på en skål och tillåta cellerna att sedimentera i minst 5 minuter. Celldensiteten används beror till stor del på naturen hos de enskilda celler som profilerade. Till exempel, för mycket sällsynta celler märkta med en fluorescerande markör, en GFP, är hela dissocierade näthinnor utströks på en enda 6 cm skål. För celler som är något mer rikligt förekommande, är färre celler initialt utströks för att göra det lättare att skörda en (eller mycket nära en cell) med den första mikropipett.
2. Placera plattan i dissocierade celler på ett inverterat mikroskop. Vi använder IMT-2 modellen från Olympus. Använda mikropipetter som har dragits till en fine spets (innerdiameter 0,5 mm, yttre diameter 1,04 mm) (Figur 2) och tillsammans med ett sugrör, skörda en enda cell. Cellerna in lätt mikropipetten när den placeras nära dem på fat. Det är kritiskt att sugröret varken är för lång eller för kort för avståndet till det stadium i samband med den inverterat mikroskop (Sugrören vi använder i vår inverterat mikroskop är 38,1 cm lång). Om röret är för lång, kan celler inte utvisas effektivt från mikropipett in i uppsamlingsröret. Den främsta anledningen till att vi använder den äldre IMT-2 modellen inverterat mikroskop är att vi har hittat det har det perfekta avståndet till scenen för våra rör aspirator montering. När du har angett mikropipett cellen (eller celler) ut på en andra platta (tvätt platta) för att säkerställa att en och endast en cell skördas för profilering av genuttryck. På den andra plattan är det ofta nödvändigt att antingen avlägsna främmande celler med en ny mikropipetteller flytta den intressanta cellen till en annan plats för att säkerställa att endast en enda cell kommer in i mikropipetten.
3. När en enskild cell är helt isolerad från angränsande celler, använda en ny mikropipett att aspirera cellen av intresse som i avsnitt 2,2 och sedan driva ut den direkt till en 0,2 ml PCR-rör innehållande 4,5 pl buffertcell lys. Cellen drivs ut på sidan av röret, försiktigt så att inte bryta spetsen av mikropipetten in i röret. Proverna kan centrifugeras kortvarigt i en bänk mikrocentrifug för att sänka ned den cell i lyseringsbuffert. Detta spinning görs vanligen efter varje 5th Cell och sedan igen i slutet av collection.Tubes innehåller enstaka celler i lysisbuffert bör hållas på is för länge enda cell isolering. För bästa resultat är enskilda celler samlas in inom en två timmar fönstret efter dissociation. Efter denna tid har förflutit, är det bäst att gå vidare till omvänd transkription steg eftersom ytterligare tid har observerbaraed att öka chanserna för RNA-nedbrytning.

3. Omvänd transkription

1. Kortfattat snurra proven i en bänk minicentrifuge att säkerställa att alla de enskilda cellerna är nedsänkta i cellen lyseringsbuffert. För att främja cellys, inkubera provet vid 70 ° C under 90 sek. i en termocykel. Placera omedelbart rören igen på is.
2. Lämnar rören på is under 2 minuter. För alla reagenstillsatser använder filter-tip pipettspetsar för att förhindra kontaminering. För att utföra omvänd transkription, tillsätt 0,33 il Superscript III (200 U / fil), 0,05 ^ il RNas-inhibitor (40 enheter / | il), och 0,07 | il T4-gen 32-protein. Inkubera reaktionsblandningen under 50 min vid 50 ° C i en termocykel. Inaktivera enzymet vid 70 ° C under 15 minuter och placera på is.
3. För att ta bort det fria primer, tillsätt 0,1 pl Exonukleas buffert (10X), 0,8 pl dH ₂ 0 (molekylärbiologi kvalitet), och 0,1 pl exonukleas I (20 U / l). Inkubera vid 37 ° C under 30 min ien termocykler. Inaktivera enzymet genom att inkubera reaktionen vid 80 ° C under 25 min och sedan placera rören på is.

4. Svans och Single-Cell PCR

1. Tillsätt 6 | il av svans reaktionsblandningen och använda en termocykelanordning för att inkubera provet vid 37 ° C under 20 min, 70 ° C under 10 min och håll vid 4 ° C
2. Tillsätt 10 pl av den svansade provet till PCR-reaktionsblandningen och utföra den andra strängsyntes och PCR-amplifiering med användning av följande betingelser:
   1. 95 ° C under 2 min
   2. 37 ° C under 5 min
   3. 72 ° C under 16 minuter
   4. 93 ° C under 40 sek
   5. 67 ° C under 1 min
   6. 72 ° C under 6 min, tillsats av 6 sekunder per cykel
   7. Gå till steg 4 34 gånger
   8. 72 ° C under 10 min
   9. Håll vid 4 ° C

5. Märkning för Affymetrix Chips

1. Etiketten 10-20 pg av cDNA (den koncentration av det amplifierade cDNA resultatning från en enda cell är vanligtvis på ~ 1 ng / ^ il) för att erhålla en stabil hybridisering på Affymetrix mikromatriser. Först fragment cDNA genom att tillsätta 10-20 fil av encelliga cDNA till 8 pl 1X En Phor-Alla buffert och 1 pl utspädd (1:10 i 1X One-Phor-Alla buffert) DNasI i en 80 pl reaktion. Inkubera i en termocykler under 13 min vid 37 ° C. Inaktivera DNas I i 15 min vid 100 ° C och placera på is.
2. Tillsätt 20 pl 5X TdT-buffert, 2,5 pl biotin N6-ddATP (Enzo Biosciences) och 1 | il TdT (utspädd 1:8 i TdT-buffert).
3. Inkubera under 90 min vid 37 ° C, därefter 5 minuter vid 65 ° C. Lagra vid -20 ° C eller hybridisera omedelbart till en Affymetrix microarray. Hybridiseringen utförs med användning av standardförfaranden Affymetrix protokoll.

6. Representativa resultat

För att bedöma kvaliteten av cDNA, 10 pl av cDNA-prov laddades på en 1% agarosgel. CDNA främst bedöms av sin storlek (500-2000 bp)och intensiteten av cDNA utstryk (figur 1 och 3a figuren). I gelén visas i figur 1, visar varannan rad a cDNA utstryk från retinala celler isolerades E16.5. Banorna mellan visar de resulterande smetas när bara mediet sugs in i nålen och deponeras i PCR-rör. Dessa filer är aldrig helt saknar en svag fläck, men de visar inte några resultat när genspecifika PCR primers används för att förstärka gener från dem. Dessutom kan intensiteten av cDNA utstryk variera något (jämför figur 1 och 3a figuren). I körfält figur 3a a, f, g och h innehåller robusta cDNA smetar medan körfält b, c, d och e är betydligt mindre robust.

Genspecifik PCR används som en sekundär screening av kvaliteten hos det cDNA från en enda cell. CDNA-sekvensema i Figur 3, isolerades från fluorescerande retinala ganglionceller och de var tested med PCR primers för näthinneganglieceller markörer Brn3b och Pax6. För denna analys tillsattes 1 pl av cDNA utsattes för PCR i 30 cykler. Kvantitativ realtids-PCR är en föredragen analys, men det kan vara oöverkomligt dyra och är inte nödvändigt för enbart bedöma cDNA kvalitet. Alla 8 av de enskilda celler var positivt för Brn3b och 6 ut 8 för Pax6 (figur 3b). Även de cDNA smetas som var mindre robusta producerade band för Brn3b och Pax6. Trots dessa PCR resultat är det vår erfarenhet att cDNA smetar som de i banorna b, c, d och e inte ger kraftfulla hybridiseringar på Affymetrix kedjor och allmänhet undvikas. Genspecifik PCR för fotoreceptorn markör Crx användes för att bestämma nivån av föroreningar i de enskilda cell-cDNA (figur 3b). En fotoreceptor markör valdes eftersom dessa celler utgör majoriteten av näthinnan (~ 70%) och därför skulle varje cell-lys som inträffade sannolikt innebära stav photoreceptors. Det fanns bara en svag mängd Crx närvarande i dessa cDNA-beredningar även efter 30 cykler av PCR. Slutligen kan denna PCR-baserad skärm användas för att börja att bestämma vilken underuppsättningar av en speciell celltyp som cDNA-sekvensema härrörde från innan de utsätts för en fullständig mikromatris profilering. Detta kan bidra till att prioritera de celler som är profilerade, eftersom detta är den mest kostsamma steget i processen. Till exempel har vi identifierat underuppsättningar av retinala ganglionceller genom screening dem med avseende på närvaro av genen Tachykinin1 (figur 3b).

Från den lilla PCR-baserad skärm är det vissa enskilda celler väljs och deras cDNA hybridiserades till en Affymetrix microarray. Den microarray data jämförs och mönster kan upptäckas med användning av standardmetoder klustring algoritmer. Heatmaps, såsom i figur 4, alstras för att grafiskt representera data. Det finns två huvudsakliga slutsatser om de enskilda datacell profilering i figur4. Första, gener som uttrycks i specifika celltyper påträffas nästan uteslutande i de celltyper efter en enda cell-protokollet utförs. I de flesta fall där markörgener av en celltyp återfinnes också i en andra celltyp, såsom observationen att bipolära celler uttrycker vissa "stav"-gener på lägre nivåer, detta uttryck i den andra celltypen lätt bekräftas genom antingen in situ hybridisering eller antikroppsfärgning. För det andra, i den mer mångsidig amakrina och ganglion profiler cell är heterogenitet av genuttryck omedelbart uppenbara. Pou4f1 bara uttrycks i ca 1/4 av u-ganglion celler, medan Nr4a2 och Scube2 är två exempel på ojämnt uttryckta gener i olika amakrina celler. Faktum är att de gener som visas i heatmap är bara ett litet urval som flera hundra gener har identifierats och bekräftats som markörer i utvecklingsländer ganglieceller eller som markörer för olika populationer av amakrina celler ^2,4.

Figur 1. Flödesschema för en enda cell profilering metod. Första näthinnor är isolerade och dissocieras till enskilda celler med hjälp papain. För det andra är enskilda celler skördas med en drog glasnål och deponeras i PCR-rör. Cellerna lyseras och cDNA amplifierades med användning av omvänd transkription följt av PCR. Det resulterande cDNA kvalitet bedöms på en agarosgel såsom den som visas. Efter DNA-stege i den första filen, banorna visar cDNA smetar från enstaka celler (indikeras av de röda parentes) omväxlande med amplifieringsprodukter från media kontroller. Utstryk av denna kvalitet (röda parentes) hybridiseras till Affymetrix mikroarrayer.

Figur 2. Bilder av nålar och aspiratorn röraggregatet. Enskilda celler isoleras med användning av kapillärverkan av endrog glasmikropipett (innerdiameter 0,5 mm, yttre diameter 1,04 mm) och överförs med hjälp av trycket av blåsa i aspirator. Det är viktigt att sugröret är både tillräckligt lång för att lätt manipulera och tillräckligt kort för att tillförlitligt ladda ur individuella celler. En närbildsvy av kapillärröret dras in en nål som visas i B.

Figur 3. Representativt exempel på en enda cell cDNA utstryk och genspecifika PCR. Att bestämma kvaliteten av cDNA från enstaka celler efter amplifiering, var 10 | il av varje enskild cell prov kördes på en 1% agarosgel tillsammans med en negativ kontroll (A). En smear ska visas mellan 500-2000 bp. Ytterligare PCR-screening för specifika gener kan bidra till att identifiera / bekräfta den typ av cell som isolerades och mängden av föroreningar närvarande i provet (B). Primrar som är specifika för näthinneganglieceller markörer Brn3boch Pax6 testades för att bekräfta identiteten av dessa celler (rader 1 och 2). För att bedöma mängden fotomottagaren föroreningar i preparatet har primers specifika för fotoreceptorn markören Crx används (rad 3). Undergrupper av ganglionceller kan också identifieras genom screening med avseende markörer såsom Tachykinin1 (rad 4).

Figur 4. Enda cell expression av markörgener. Mikromatrisen Resultaten för utvalda gener som uttrycks i 22 distinkta enstaka celler visas i en heatmap format. Intensiteterna från de microarray signalerna har skalats för att motsvara den intensitet för den röda färgen. Svart indikerar frånvaron av signalen i mikroskaran. De retinala ganglionceller (RGC) visas prekursorer isolerades från embryon tidpunkter, medan de andra cellerna isolerades från vuxna näthinnan.

Discussion

En ständigt växande antal studier avslöjar robust cell till cell variation i populationer som ansågs vara mer homogena med avseende på deras genuttryck ^6,8. I åtminstone ett fall har detta genuttryck "brus" visat sig spela en viktig biologisk funktion ^13. Genuttryck skillnader mellan enskilda celler skyms med traditionella av hela vävnad metoder. Dessa experiment genererar uttryck profilen för en "genomsnittlig" cell, vilket kanske inte är representativa ^14. Här presenterar vi en metod för isolering och identifiering av de genexpressionsmönster från enstaka retinala celler. Studiet av enskilda celler ger forskare möjlighet att undersöka den cellulära heterogeniteten underliggande komplexa vävnader, vilket är avgörande för att bestämma karakteristiska genexpressionsmönster av olika celltyper. Dessutom kan en-cellisolering ge insikt i genprogram drivande aktiviteten hos indidual celler i tidpunkter under hela utvecklingen. Vilket är särskilt användbart för att studera nervsystemet, där dess verksamhet komplexa cellulära nät kan bero på den unika genuttrycket av sällsynta celltyper, kan detta protokoll anpassas för att isolera enskilda celler från olika vävnader.

I början av utvecklande mus näthinnan, är ganglion celler, horisontella celler, kon fotoreceptorceller och amakrina celler all genereras i en överlappande tidsfönster ^15. Dessutom är varje cell som har lämnat cellcykeln i ett annat stadium av mognad och detta faktum bara bidrar till komplexiteten i att utveckla näthinnan. Slutligen, för vissa typer av retinala neuroner, finns det ett stort antal olika morfologier (upp till ca 30 i fallet med amakrina celler) i det mogna näthinnan ^16. Eftersom näthinnan är en sådan blandning av celltyper, microarray och serieanalys av genuttryck (SAGE) studier ^17-19 som var beroende av homogenizring av hela näthinnan inte kan avslöja markörer gener som uttrycks i sällsynta subtyper och inte för att lösa dynamiska skillnader genuttryck mellan celltyper, särskilt under utveckling. För att börja förstå komplexiteten av olika celltyper både i vuxna näthinnan och under retinal utveckling har encelliga genuttryck profiler ~ 200 enskilda celler från många olika tidpunkter analyserats ^2-5,8. De erhållna data har gett en mängd nya markörer för enskilda celltyper och gav ett fönster in viktiga övergångar i utvecklande tid som tidigare var uppskattad.

De encelliga uttryck profiler har visat betydande heterogenitet i genuttryck i amakrina celler ^4, där den förväntade, och Müller gliaceller, där det var oväntat ^5. Även en undersökning av de enskilda amakrina celldata avslöjade mer än 450 gener som uttrycks i amakrinaceller och uteslutna från andra retinala celltyper, var ingen av dessa gener uttrycks i alla amakrina cellerna ^4. Dessa resultat sannolikt uppstår från det faktum att amakrina cellklass är mycket varierande och det underliggande heterogenitet är en återspegling av de olika funktionerna hos dessa celler. Dessa fynd skulle inte ha varit möjligt att använda hela vävnads-baserade metoder. Slutligen visade cykling retinala stamceller (RPC) den högsta graden av heterogenitet i genuttryck av någon av de retinala celltyper profilerade ^8. Transkriptionsfaktorer var den klass av gener som har den högsta graden av heterogenitet bland progenitorceller, vilket antyder att dynamiska genuttrycksmönster skulle kunna spela en viktig roll i utvecklingen av de olika retinala celltyper ^8. Återigen skulle dessa resultat inte varit möjligt utan användning av en enda cell profilering av genuttryck teknik.

Encelliga Transkriptom studierkan också användas för att få insikt i sjukdomsmekanismer. I många neurodegenerativa sjukdomar, inklusive retinala degenerativa sjukdomar, vissa nervceller dör medan de angränsande nervceller överlever ^20. Förstå varför vissa celler genomgå apoptos kräver identifiering av gener eller program gen som är förändrade i enskilda celler i dessa sjukdomar modeller. Hela-vävnad modeller återigen potentiellt skymmer de förändringar som sedan cellerna ofta inte dö på samma gång och därför vid en given tidpunkt vävnaden är en blandning av döende och överlevande celler. Dessutom, för många cancerformer cellen ursprungslandet är en öppen fråga. Detta är särskilt fallet med barndomen ögat tumören retinoblastom. Nyligen använda en enda cell profileringen protokollet beskrivs här, visade det sig att enskilda celler från retinoblastom har program genuttryck av flera celltyper ^21. Det förefaller som om dessa celler är hybrider av odifferentierade stamceller och neuroner ²1. Dessa experiment krävs en analys på en enda cell och skulle inte ha varit möjligt med hela vävnad metoder.

Alternativa metoder

Linjär amplifiering är ett alternativ till det PCR-baserad amplifiering protokoll beskrivs här. Medan PCR-baserad amplifiering tros resultera i en snedställning av överflöd förhållanden, är linjär amplifiering tänkt att upprätthålla dessa förhållanden ^22. Tekniken för linjär förstärkning har använts för att profilera flera neuronala typer ^23. Emellertid har direkta jämförelser mellan de två metoderna visade att den linjära amplifieringsteknik kan associeras med en hög falskt negativa ^24,25. Vi gynnar PCR-baserad metod som beskrivs i denna rapport av två skäl. Först i våra experiment har vi fokusera på gener med robusta uttryck skillnader mellan celler. För det andra har vi funnit en mycket god korrelation mellan vårt enda cell microarray proarkivering experiment och hybridisering in situ studier för samma gener. I själva verket hittills har vi utfört in situ-hybridiseringar för hundratals gener och har observerat åtminstone 75% överensstämmer med förutsagda mönstret från mikromatriser. Detta är sannolikt en försiktig uppskattning, eftersom den vanligaste orsaken till en avvikelse finns en brist på signal från in situ sonden.