Summary
במאמר זה, אנחנו מדגימים מבחני ללמוד nociception תרמית
Abstract
במאמר זה, אנחנו מדגימים מבחני ללמוד nociception תרמית הזחלים תסיסנית. אחת assay כולל גירוי מרחבית, מוגבלת (מקומי) של 1,2 nociceptors תרמית ואילו השני כולל הפעלת הסיטונאי (העולמי) של רוב או את כל הנוירונים כאלה 3. יחד טכניקות אלה מאפשרות הדמיה וכימות של פונקציות התנהגות של נוירונים חושיים תסיסנית nociceptive.
הזחל תסיסנית היא מערכת מודל הוקמה ללמוד nociception תרמית, תגובה חושית לטמפרטורות מזיקים, כי הוא שמור באבולוציה על פני 1,2 מינים. יתרונותיה של תסיסנית עבור מחקרים כאלה הם הפשטות היחסית של מערכת העצבים ואת התחכום של טכניקות גנטיות שניתן להשתמש בהם כדי לנתח את הבסיס המולקולרי של הביולוגיה הבסיסית 4-6 ב תסיסנית, כמו כל metazoans, respons אתדואר לגירויים תרמית רעילים בדרך כלל כרוך בנסיגה "nocifensive" מרתיעה לגירוי המוצג 7. גירויים אלה מזוהים באמצעות קצות עצבים או nociceptors חופשיות משרעת התגובה האורגניזם תלוי במספר nociceptors שקיבלו גירוי מזיק 8. ב תסיסנית, זה arborization את המעמד הרביעי הדנדריטים עצב סנסורי המזהים גירויים תרמי מכני רעילים 9 בנוסף לתפקיד לאחרונה גילו שלהם photoreceptors 10. אלו נוירונים, אשר נחקרו היטב ברמה התפתחותית, arborize על דף את מחסום האפידרמיס וליצור קשרים עם כמעט כל התאים אפידרמיס 11,12. האקסון אחת של כל אחד הרביעי פרויקטים ברמה נוירונים לתוך חוט העצב הגחון של מערכת העצבים המרכזית 11 שבו הם יכולים להתחבר 2 מסדר נוירונים הפרויקט למוח.
בתנאי הבסיס, נוירו חושית nociceptiveNS לא יפטר עד לסף גבוהה יחסית הוא הגיע. מבחני המתוארים כאן לאפשר לחוקר לכמת תגובות התנהגותיות או הבסיס, יש להניח, כי רגישות מתפתח נזק לרקמות הבאות. Assay זה מעורר נפרדים אך קשורים תגובות התנהגותיות locomotory לגירויים תרמית רעילים ומאפשר לחוקר לחזות ולכמת היבטים שונים של nociception תרמית הזחלים תסיסנית. מבחני ניתן להחיל את הזחלים של גנוטיפים הרצויות או זחלים העלה בתנאים סביבתיים שונים שעשויים להשפיע nociception. מאז nociception תרמית נשמרת בין זנים, הממצאים שלוקטו לנתיחה גנטי תסיסנית צפויה להודיע הבנתנו nociception תרמית של מינים אחרים, כולל בעלי חוליות.
Protocol
מתווה טיפוסי של צעדים ניסיוניים להכנת זחלים רגיל או UV-רגיש לשני מבחני nociception תרמית מוצג באיור 1.
1. הכנת הזחלים
- הזחלים צאצאים זכר ונקבה של הגנוטיפ הרצוי, ניתן לבדוק באופן ישיר. לחלופין, צלב גנטית ניתן להגדיר להשיג זחלים הצאצאים של גנוטיפ מוגדרת של עניין. הגדר חוצה בבקבוקים המכילים מזון זבוב באמצעות 20-30 נשים בתולות וגברים 15-20.
- 5 ימים לאחר הביצה להניח, מסיק ונקי הזחלים כבר 3 instar ידי חופנים מזון זבוב מעוך בעדינות מאמץ עם מים זורמים דרך מספר 630 מיקרומטר (גודל הנקבוביות) רשת. להעביר את הזחלים כבר 3 instar (~ 3-4 מ"מ באורך לאורך ציר anteroposterior) לרפד לחות קטנה של אוכל כדי למנוע רעב dessication. אם רגישות nociceptive הוא להיבדק, בצע את השלבים הבאים 2.1-2.11. אם הזחלים יש נבדק absencהדואר של נזק לרקמה, להמשיך ישירות לשלב 3.1.
2. Etherization ו הקרנת UV
- לבנות חדר etherization.
- חותכים את הצינור התחתון microcentrifuge 1.5 מ"ל.
- עם מרית מתכת חמה ממיסים את קצה חתך של הצינור microcentrifuge.
- להטביע רשת בסדר לפני השטח צינור מומסת להתקרר. תא etherization יאפשר כניסה של אדי האתר אך למנוע בריחה הזחל.
- השתמש מלקחיים או המכחול בעדינות כדי למקם 10 instar מוקדם הזחלים 3 בתוך החדר תוצרת בית etherization.
- מקום הזחלים לאורך הצד הפנימי של המכסה סגור.
הערה: הבא את שני השלבים יש לבצע במנדף כמו האתר הוא כימיקל חומרי נפץ ו אדי שלו יכול להרדים האדם כמו גם הזחל.
- מניחים את החדר etherization המכיל הזחלים בתוך צנצנת המכילה Coplin כוס 10 מ"ל נושאכדור צמר גפן ספוגה מ"ל 1.5 ~ של האתר diethyl.
- לדפוק על מכסה של צנצנת Coplin לחשוף את הזחלים כדי אדי האתר המיועד ל -2 עד 2.5 דקות. שים לב כי פעמים etherization יותר עשוי להשפיע לרעה על התנהגות הישרדות או הזחל.
- בעקבות etherization, הסר את תא etherization מ Coplin בצנצנת / ספל, נותן כמה שניות של מכסה המנוע של אדי האתר להתפוגג. כעת תוכל לעבור מכסה המנוע בחזרה למעבדה.
- השתמש בקבוק להשפריץ מים בעדינות ולשטוף הזחלים מן החדר etherization לתוך צלחת פטרי קטנה.
- שימוש במלקחיים ו Kimwipe למחוק הזחלים הרדים יבש בעדינות להדביק אותם בצד הגבי על רצועה של סרט דו צדדית ויסקי צמוד 3 "x 1" שקופיות מיקרוסקופ זכוכית.
- מניחים את השקף על פני השטח התחתון של חדר הקרנה UV ולחשוף את הזחלים לאור UV למשך 6 שניות ב 20 mJ / 2 ס"מ בעוצמה.
- לטבול את השקופית במים כדי לצוף בעדינות את הזחלים של דו צדדית scotcשעות הקלטת.
- השתמש מלקחיים או מכחול בעדינות כדי למקם את הזחלים מוקרן ב 15 x 45 מ"מ 1 בקבוקון ה-DRAM תרבות זכוכית המכיל ~ 1.0 מ"ל של אוכל לטוס בו יוכלו להתאושש לתקופה משתנה של זמן (8 -24 שעות) במהירות של 25 ° C או הטמפרטורה הרצויה בתרבות אחרת לפני קצירת מחדש של מבחני nociception תרמית.
3. חום מקומי Probe Assay
אנו מספקים גירוי תרמי מזיק קטע הגוף היחיד הזחל באמצעות בדיקה שהותקן תרמית מתוצרת הנדסה Pro-dev (ראו טבלה של חומרים). אף על פי בדיקה זו יש תכונות העיצוב האופטימלי (טיפ מתכת קטנה של ~ באזור 0.07 מ"מ 2 ואת היכולת לשמור על דיוק נקודת קבוצה הטמפרטורה בין 23 ° C עד 65 ° C) באופן עקרוני בכל כלי עם טיפ קטן שיכול להיות מחומם לטמפרטורה מוגדרת לתקופה של עד 20 שניות יספיק. בדיקה קצה משמש כדי לעורר הזחלים מוקדם 3 rd instar דווקא dorsaאני על קו האמצע A4 קטע בטן (ראה איור 2). בתגובה לגירוי זה תרמית, הזחלים בדרך כלל מפגינים התנהגות נסיגה מרתיעה של גלגול רוחבית של 360 מעלות או יותר. התנהגות זו שונה בתגובה מגע קל שלהם החללית הלא מזיק בטמפרטורת החדר מתכת אשר בדרך כלל כולל הפסקה קצרה של 13 locomotory הפעילות שלהם.
פרוטוקול assay בדיקה חום:
- שנקבע מראש לטמפרטורה של בדיקה תרמית הרצוי נקודת סט.
- שימוש במכחול או מלקחיים בעדינות כדי להעביר הזחל הפרט על גבי פלטפורמת שטוח (אנחנו בדרך כלל משתמשים פיסה קטנה של חתך ויניל מ קלסר) שבו הזחלים יהיה מגורה לאחר מכן. הזחל צריך להיות מכוסה על ידי שכבה דקה של מים לפני מגע עם בדיקה תרמית. הסרט של מים מכסה את הזחל צריך להיות קטן ככל האפשר לכסות לחלוטין את הזחל, תוך הקפדה כי הזחל הוא לא יבש כאשר נוגעים ויניל.
- לחץ בעדינות את קצה החללית נגד הזחל על A4 קטע הפעלת לחץ קל בקצה בזווית של ° 45 על בין החללית לבין פני השטח של הזחל (ראה איור 2). הלחץ צריך לגרום הכניסה קלה על פני השטח של הזחל ובדרך כלל די כדי למנוע תנועה. אם הזחל ממשיך לזוז, להפעיל לחץ קצת יותר וזה בדרך כלל לעצור. לא שומרים נתונים הזחלים שהם מעבר לשדה הראייה או עבורו קשר בדיקה מתמדת לא ניתן להשיג עד תגובה או הפסקת 20 שניות.
- המשך גירוי הזחל עד בתגובה לנסיגה מוצג או עד הפסקת 20 2 הוא הגיע, המוקדם מבין השניים. בתגובה הזחלים בדרך כלל 1 להראות התנהגות ראשונית של הרמת הראש והזנב. זה מלווה בדרך כלל על ידי התנהגות נסיגה של גלגול לפחות 360 מעלות. רק גליל שלם של 360 מעלות הוא הבקיע כהתנהגות nocifensive (hea ראשוניד או להעלות הזנב היא לא).
- לאחר התנהגות הנסיגה היא יזמה קשר עם שחרורו בדיקה ולהקליט חביון או זמן לנסיגה. אם לא התנהגות הנסיגה הוא ציין בתוך 20 שניות, אז הזחל הוא לא מגיב. המשיבים ניתן לחלק ל -2 קטגוריות. אם התנהגות נסיגה מוצג תוך 5 שניות, ואז הוא זחל במהירות המגיב. אם התנהגות נסיגה מוצג בין 5-20 שניות, ואז הוא זחל לאט המגיב (ראה איור 1 ב בבקוק, et al. 2009) 1.
4. מחממים העולמי פלייט Assay
Assay צלחת החום נועד למדוד nociception תרמית הזחלים תסיסנית כאשר כל חיה מתמודדת עם גירוי תרמי מזיק. אדם באמצע 3 rd הזחלים instar ממוקמים ירידה 80 μl מים על צלחת פטרי 60 x 15 מ"מ - ראה איור 3 עבור סכמטי תמונות של הסט assayלמעלה. צלחת פטרי ממוקם מכן על אבן חימום מוצק (המכונה "צלחת חום"). ככל שהטמפרטורה עולה טיפה של מים, זחל מציג סדרה של חמש התנהגויות סטריאוטיפיות אנו כינו ת'ראש ראש, רול, שוט, תפיסה, ושיתוק. כל ההתנהגויות הללו הן במידה מסוימת פונקציה של הטמפרטורה setpoint הצלחת חום נפח המים שבו הזחל שקוע אנו מציגים כאן את מה שיש לנו נמצא את התנאים האופטימליים (95 ° C צלחת חום, ירידה של 80 μl מים) על קיום כל 5 של התנהגויות עם חפיפה מינימלית ביניהם.
פרוטוקול assay צלחת חום:
- מקם את המדריכים סיבים אופטיים אור על מנת להבטיח כי יש מספיק תאורה גבוהה בניגוד לצפייה הזחל. השתמש הזחל הבדיקה במידת הצורך. כוח האור צריך להיות נמוך, כדי למנוע חום הסביבה על הזחל להיבדק.
- מניחים את גוש חימום לתוך צלחת חום עם משטח ישר מעלה למקם את הצלחת על חוםבסיס מיקרוסקופ. להפוך על צלחת את החום למצב "גבוה", מאפשרים כ 15 דקות בטמפרטורה לייצב, ולהתאים בהתאם להשגת טמפרטורת פני השטח של 95 ° C.
- למדוד 80 μl של מים מזוקקים ולשים טיפה מים באמצע 60 x 15 מ"מ צלחת פטרי עם קלקר micropipettor.
- להשתמש במלקחיים כדי בעדינות במקום נקי באמצע 3 rd הזחל instar למרכז טיפה מים. נסה להעביר את הזחל עם נפח מינימלי של מים, כך טיפה כדי לחמם נשאר קרוב ככל האפשר ל μl 80 המקורי.
- בעדינות להניח בצלחת פטרי שמכילה את טיפת מים זחל אל הרחוב חימום מוצק בצלחת חום. להתאים במהירות את המיקום של המנה כל כך הזחל כולו טיפת מים נמצא בתצוגה. ראה איור 3 ווידיאו 1-6.
- הפעל את שעון העצר ברגע צלחת פטרי ממוקם על בלוק חימום מוצק של צלחת חום שיאשעת התחלה של התנהגות כל אחד. אם תרצה, התנהגויות יכולות להיווצר גם וידאו מוקלט - ראה וידאו של 1-5 דוגמאות מייצגות של התנהגות זו. לייקה התוכנה בגרסה 3.7 שימש להקליט את הסרטים, מצב ההקלטה היה "רציף", היתה מצלמה ברזולוציה 3 מגה פיקסל (היינו 0.63x זום שבה רזולוציית התמונה מחושבת הוא 10 מיקרומטר / פיקסל) מסגרות / שנייה היו 44.5.
5. נציג תוצאות
חום מקומי Probe Assay:
במגע עם בדיקה תרמית, זחל בדרך כלל מראה התנהגות ראשונית של הרמת הראש והזנב. בדרך כלל הרמה של הראש נתפס בעקבות לראשונה על ידי הרמת הזנב. מספר שניות לאחר התנהגות זו זחל ראשוני מתחיל בדרך כלל מתגלגל רוחבית אשר אנו מכנים "התנהגות מרתיעה נסיגה." הזמן שאחריו התנהגות ראשונית או התנהגות נסיגה מוצג עשויה להשתנות הטמפרטורה או GEnetic רקע. במחקר הראשוני שלנו מדדנו את אחוז הזחלים מציג נסיגה מרתיעה על טמפרטורות שונות להגדיר נקודת בדיקה ומצא כי 48 ° C היתה הטמפרטורה הנמוכה ביותר שבה כל הזחלים הגיב מהר (<5 ים). כאן אנו מדווחים כי יש תקרה לתגובה nociception הזחל תרמית (איור 4 א). 100% מגיבים מהר הם נצפו עד לטמפרטורה בדיקה של 52 ° C. עם זאת, ב 54 מעלות צלזיוס ומעלה, 90% או יותר של הזחלים אינם מגיבים גם לאחר 20 שניות של מגע. זחלים אלה אל תמשיך לנוע בעקבות הפסקת של 20.
כאמור 1, קטגוריות של התנהגות נסיגה בטמפרטורת זה ניתן להתוות והשוו סטטיסטית. בהתחשב כי מדובר assay התנהגותית יש איזה השתנות מן הזחל כדי זחל בין משתמשים בודדים. כדי להסביר את זה אנחנו בדרך כלל מודדים 3 סטים של 30 זחלים בכל תנאי הבדיקה. בנוסף קטגוריזציה פשוטה של אינטרנט אלחוטיחביון thdrawal שאנו דיווחו קודם לכן, אנו מדווחים כאן את המשרעת (מספר לחמניות או משך הזמן של התנהגות נסיגה מרתיעה) ניתן גם למדוד (ראה איור 4). באופן מפתיע, נראה שיש יחס הפוך בין טמפרטורת קלט את איתנות בתגובה כי בטמפרטורות נמוכות יותר מופיע לעורר מספר גבוה יותר של גלילי (איור 4B) ויותר זמן ביליתי בנסיגה מרתיעה (מידע לא מוצג). זה עשוי להצביע על כך משך החשיפה לטמפרטורה מזיק יכול להיות הקובע העיקרי של עמידות.
צלחת חום Assay:
חמש התנהגויות locomotory סטריאוטיפיים הם נצפו על העברת הזחל שקוע במים לצלחת את החום. אלה מתוארים להלן רואים בסרט יחד עם התנהגות טיפוסית של הזחל locomotory מוסק במים. Latencies את הממוצע שבו התנהגויות אלו נצפות מוצגות באיור 5, כמו גם ירידה של מים בטמפרטורות הממוצעות שנמדדו על השהיית כל אחד. בתנאים אופטימליים assay שהוצג אחוז הזחלים מראה כל התנהגות שונה נע בין 77% ל 100 (5 ב איור) אם כי מדי פעם את ההתנהגויות מתגלגל ו מצליף מושמטים, חפיפה, או להופיע בסדר הפוך. את ההתנהגויות שנצפו, בסדר כרונולוגי, להלן תיאור וניתן צפו בסרטון על הזמן המצוין להלן:
- תנועה נורמלית היעדר חום: תנועה peristaltic מלווה על ידי חיפוש תנועות הראש. ראה וידאו של 6:27.
- תרש ראשי: הזחל עובר בראש במהירות בתנועה קדימה או לרוחב. תנועה זו דומה לתנועה הרגילה במים (ראה וידאו 1), אך שכיחה יותר בכבדות ובהתמדה. ראה וידאו של 6:40.
- רול: גולם מתגלגל רוחבית לפחות 360 ° מלא. ראה וידאו של 6:50. זה יכול להתרחשמספר משתנה של פעמים ולפעמים כרוך גלילים שלמים. לצורך ניקוד התנהגות אנחנו רק לספור מלאים לחמניות 360 מעלות. אופן פעולה זה הוא הדומה ביותר לזה לראות עם יישום מקומי של החללית חום.
- שוט: הזחל תערוכות התכווצות מהירה, תנועות שחרור לאורך ציר anteroposterior המביאים ראש לזמן קצר מאוד קרוב הזנב. ראה וידאו של 7:11. להצליף הוא נצפה לעיתים קרובות ברצף מהיר או באותו זמן כמו מתגלגל.
- תפיסה: גולם משתרע לאורך ציר anteroposterior ותערוכות תדר גבוה בכל הגוף רועד התנהגות בלי להתכופף. ראה וידאו של 7:25.
- שיתוק: גולם חדל התנועה. ב הזחלים חלק זה הוא קבוע ואילו אחרים ואז להציג תנועה נמוכה תדירות הפעימה. ראה וידאו של 7:36.
נתונים אלה מראים כי הטמפרטורה של טיפת מים החביון להתפתחות של 5 charהתנהגויות acteristic שנצפו על חימום גלובלי של ירידה הזחל / מים מתואמים מאוד.
באיור 1. תמציתי של צעדים ניסיוניים עבור הכנה assay של הזחלים. לפני מנסה לאמוד nociception עם החללית חום או צלחת חום, הזחלים נגזר מניה ספציפית או צלב גנטית נקצרים וניקה של מזון. אם רגישות nociceptive (בניגוד nociception הבסיס) יש להעריך, קצירת מלווה etherization (חשיפה האתר), הרכבה, קרינת UV, תקופה של התאוששות על אוכל לטוס. הזחלים שנקטפו או התאושש חשופים לטמפרטורות ואז הבדיקה רעילים או באמצעות בדיקה חום (מקומי) או צלחת חום (העולמי) assay. המספרים מתייחסים קטעי טקסט שיטות המתארות את הצעד (ים) הראו.
Figurה 2. ניסיוני להגדיר עבור assay חום מקומי בדיקה. בדיקה חום נשלטת על ידי יחידת בקרת החום המשמש להגדיר ולשמור את הטמפרטורה של החללית. בדיקה מוחזק בניצב לציר anteroposterior ומשמש כדי לעורר את הזחל בזווית של ° 45 עד האופקי. צור קשר עם החללית נעשה ספציפית A4 קטע בטן כפי שמוצג. על המשתמש לשמור על קשר עם לחץ קל עד הפסקת 20 עד 2 או התנהגות מתגלגל מתחילה. אם הטמפרטורה נתפס מזיק, זחל יראה התנהגות נסיגה מרתיעה מאופיינת רול 360 לפחות 1 °. מספר גלילים יכול להיות בודדות או מרובות (ראה תרשים 4 ב).
איור 3. ניסיוני הגדרת עבור assay צלחת חום. (א) קריקטורה מבט אופקי של צלחת פטרי 60 x 15 מ"מ המכיל 1 באמצע 3 rd בכוכב הזחל בטיפת מים 80 μl. (ב) קריקטורה מבט גבי הזחל ממוקם במרכז טיפת מים לראות מבעד למיקרוסקופ. (ג) צילום של נוף אופקי של תחנת עבודה עבור assay זה. (ד) צילום של הזחל לראות מבעד למיקרוסקופ.
באיור 4. כימות התגובה ההתנהגותית באמצעות assay בדיקה חום. (א) מגרש לאחוז המגיבים של כל קטגוריה (מהיר, איטי, ולא המגיבים) לעומת הטמפרטורה. (ב ') מגרש של חביון להתנהגות נסיגה מרתיעה לעומת מספר לחמניות הזחל בכל הוצגו ארבע טמפרטורות של מבדקים שונים של noxiousness הגדלת (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C, ו - 52 ° C).
איור 5. הצלחת assay חום: חביון לעומת טמפרטורה Behאביאור. () חביון הטמפרטורה הממוצעת טיפת מים כל תגובה התנהגותית בתנאים אופטימליים של 95 מעלות צלזיוס (טמפרטורת פני צלחת חמה) ו - 80 μl טיפה של מים (n = 150). שים לב שכל התנהגות הוא ציין בתוך פרק זמן מסוים. ירידה בטמפרטורות המים נמדדו באמצעות תרמי מוכנס לתוך החלק העליון או התחתון של ירידה (N = 10 טיפות עבור כל מיקום) ואת אלה מדידות היו בממוצע. (ב) אחוז הזחלים מציג כל תגובה התנהגותית בתנאים אופטימליים assay. חבטה, תפיסה, ושיתוק הם נצפו כמעט 100% מהזמן תוך גלגול מתוקה הם נצפו 77 ו - 80% מהזמן, בהתאמה. בבית התחתון הטמפרטורה תפיסת השטח נקודות סט ושיתוק לא נצפתה בתוך 200 של ובנקודות מוגבה מתגלגלת מצליף ניתן לדלג או עלולה להתרחש בעת ובעונה אחת. n = 150. (ג) אחוז הזחלים כי לשרוד חניכה הבאה של התנהגות שיתוק. הזחלים היו מחוממים עד להיותשיתוק ginning ולאחר מכן להסיר את התנאים תרבות סטנדרטיים כדי להתאושש. מוק שטופלו הזחלים קיבל טיפול שווה ערך למעט חשיפה לחום. כינונה של מבוגרים גלמים קיימא היו לכמת בימים 7-13. n = 120.
איור 6. איון של הזחל עצב סנסורי nociceptive מגביר latencies התגובה ההתנהגותית. העלילה של זמן אחזור להתנהגות זו על גנוטיפים הצביע: W 1118, Gal4 109 (2) 80 = MD-Gal4 / +, כטב"מ-Ork1.Δ-C / +, כטב"מ-Ork1.Δ-NC / +, MD- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C, ו md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. MD-Gal4 כוננים ביטוי כטב"מ מוסדר transgenes בכל ארבעת סוגי multidendritic עצב סנסורי הפריפריה; כטב"מ Ork1.Δ-C-14 מבטא גירסה שונה של פתוח תסיסנית מיישר K + ערוץ הנדרש להעברת סינפטי, ו-U AS-Ork1.Δ-NC 14 מבטא גירסה שונה נוספת של הערוץ באותו אינו מפריע הולכה סינפטית. שים לב הזחלים רק הנושא הן את הנהג MD-Gal4 6 ואת כטב"מ-Ork1.Δ-C transgenes להראות latencies עלה על ארבעה מתוך חמשת התנהגויות נצפות (ת'ראש, גליל התפיסה, ושיתוק). שימו לב בגלל חביון עלה ל מתגלגל אלה שוט חיות לפני שהם מגלגלים. הכוכבית מציינת p <0.05 על ידי הסטודנטים של מבחן t. n = 30 זחלים לכל גנוטיפ.
וידאו משלים 1. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
וידאו משלימה 2. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
משלימה וידאו 3."Target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בווידאו.
וידאו משלימה 4. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
וידאו משלימה 5. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
וידאו משלימה 6. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
Discussion
מבחני שתוארו כאן ניתן להעריך איכותית וכמותית הזחלים של גנוטיפים שונים של היענות לגירויים תרמית רעילים. התכונה העיקרית של assay בדיקה החום הוא הגירוי ניתנת רק מוקד אחד. זה כנראה מוביל ירי של תת היחידה הקטנה של המעמד הרביעי נוירונים-the אלה במגזר קשר עם החללית ואולי אלה מיד קטעים הסמוכים 11. בגלל גירוי מקומי, assay בדיקה החום מחקה את החוויה החושית משותף של גילוי גירוי מזיק, כי הוא מקומי לגוף מסוים באזור, כגון יד יצירת קשר עם תנור חם. החיסרון של assay בדיקה חום היא כי יש כמה לשונות המשתמש אל המשתמש יכול סביר לייחס לשלושה גורמים: א) את הלחץ שבו המשתמש חל בדיקה כדי הזחל, ב) את המיקום המדויק של החללית על הזחל יחסית לתאי העצב nociceptive הבסיסית, ו, ג) ang מדויקלה בו בדיקה קשרים פני השטח של הזחל.
אנחנו קודם לכן דיווחו אסטרטגיה כמותית של הזחלים לסווג את המגיבים, שאינם מגיבים איטיים, המגיבים מהר המבוססים על זמן אחזור נסיגתם לטמפרטורה מסוימת 1. כאן אנו מדווחים על היענות הזחל לטמפרטורות גבוהות יותר אפילו. מעניין, אנו מוצאים כי קיימת תקרה הזחל תגובות nociceptive תרמית וכי התקרה זה נמצא בין 52 ו - 54 ° C. זה עשוי להצביע על כך הזחלים אינם בעלי פוטנציאל הקולטן חולף (TRP) ערוץ מסוגל gating בטמפרטורות גבוהות מ 52 ° C. לחלופין, הוא יכול להציע את הנוירונים או השרירים ליזום או לבצע את תגובת המנוע ניזוק לפני שהם יכולים גם לתפקד הנסיגה מרתיעה. כמו כן, אנו מדווחים על ניתוח שונה של משרעת של נסיגה בתגובה, או באמצעות מספר לחמניות אינדיקטור "חוסן" התגובה. בתמימות, 1היינו מצפים כי הפרמטרים הללו יגדילו את הטמפרטורה או הגדלת זמן של גירוי. למרבה ההפתעה, אנו מוצאים כי זה לא המקרה. הזחלים מגורה זמן רב יותר בטמפרטורה בקצה הנמוך של טווח מזיק (42 ° C) הצג לחמניות יותר ויותר זמן ביליתי מתגלגל מ הזחלים נחקר בטמפרטורות גבוהות (48-52 מעלות צלזיוס). הדבר מצביע על כך בתוך חלון הטמפרטורה מזיק זה בעיקר משך החשיפה הקובע את האמפליטודה של התגובה. מאז הזחלים חשופים לטמפרטורות רעילים מאוד (48-52 מעלות צלזיוס) להגיב בממוצע מהר מאוד, הם אינם מציגים כמו לחמניות רבים ככל זחלי נחשף לטמפרטורה מזיק פחות לאורך זמן ארוך יותר. אנליזה של משרעת התגובה דווח כאן מוסיף עוד מימד כמותי שלאורכו גנוטיפים שונים או מניפולציות סביבתיות ניתן להשוות.
התכונה העיקרית של assay צלחת חום היא שזה כרוך בחשיפה גלובלית מזיקחום. ככזה, הוא דומה יותר לחיה יושב קלחת חימום מאשר לגעת בתנור חם. אם כי לא ברור מתי הזחל עשויה לחוות גירוי מזיק ברחבי העולם בטבע, במעבדה את תגובות התנהגותיות חשיפה הגלובלי הזה הם מורכבים יותר מאשר אלו שנצפו על גירוי מקומי. כוחו של assay צלחת חום, ציין גם על ידי אחרים 3, היא כי יש שונות קטנה המשתמש אל המשתמש מאז נוגע הזחל אינו מרכיב של הפרוטוקול. השונות רק ניכר נראה בהגדרת כאשר התנהגות זו מתחילה וזה יכול להיות ממוזער עם צפייה חוזרת / היכרות. הבדל מעניין בין מבחני הוא הטמפרטורה שבה ההתנהגויות אברסיביים להתחיל. אלה הם הרבה יותר נמוך ב assay צלחת חום מאשר עם החללית חום. התנהגות ראשונית הוצגו על ידי הזחלים קשר עם החללית חום (ראש ולהעלות את הזנב) עשוי להיות מתאם של ת'ראש ראש העיר ב ~ 27 ° C ב Plat חוםדואר assay. יתכן כי תגובה זו משקפת "נוחות" יותר "כאב". אנחנו לא נצפה מתאם של הצלפה, פרכוסים, ושיתוק אפילו גבוהה (עד 48 מעלות צלזיוס) בטמפרטורות ב assay בדיקה חום וייתכן כי מסה קריטית של תא עצב תחושתי ירי מאזור אחד או יותר של הגוף היא צריך להביא על התנהגויות אלה. מעניין לציין, כי התנהגויות של תפיסה ושיתוק הם נצפו בטמפרטורות (~ 34-37 ° C) מתחת בסופו של דבר לסף התחתון של nociceptive ציין עם החללית חום המעיד כי גירוי העולמי עשוי לכלול סיכום של תגובות עצביות, כי הם לא מספיק כדי לעורר התנהגות עם המקומיים היישום של החללית חום. אלה הטמפרטורות נתפסים ממש כמו מזיק זחלי נתמך על ידי התבוננות כי זחלים שמתחילים התנהגות שיתוק מותר לאחר מכן לשחזר את האוכל זבוב לא ברוב המקרים לשרוד (איור 5 ג). יתר על כן התומכות בטענה כי החום PLassay אכלו קורא את התגובות nociceptive היא העובדה כי חסימת הולכה סינפטית ב הידועים עצב סנסורי nociceptive מגדיל את זמן האחזור של רוב ההתנהגויות הנצפות (איור 6). תצפית שאין עליה חביון על התנהגות גבוה יותר בטמפרטורה מתוקה עולה כי נוירונים חושיים אחרים שאינם מבטאים MD-Gal4 עשויות להידרש להתנהגות זו.
לסיכום, שני מבחני כרוך בחשיפת הזחל הפרט לגירוי תרמי מזיק של הטמפרטורה מוגדר - עצה חמה של החללית מתכת קטן assay טבילה המקומית בטיפת מים במהירות חימום assay העולמי. תגובות התנהגותיות של הזחלים תסיסנית משתנה רקע גנטי ו / או חשיפה לתנאי סביבה משתנים (למשל פלוס או מינוס נזק לרקמות), ניתן ללמוד לכמת באמצעות אלה מבחני. בסופו של דבר, התוצאות של מבחני אלה יסייעו לנו להבין טוב יותר רשתות גנטיות השליטה NOCiception ב תסיסנית ו מינים קרובים אחרים.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו מודים כריסטיאן לאנדרי על עיצוב החללית חום, דניאל בבקוק לפיתוח חום הזחל בדיקה assay, שון סוויני עבור המצביע על הצלחת חום assay, תסיסנית Bloomington מרכז במלאי למניות לעוף, Galko חברי המעבדה של קריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 NS069828 כדי MJG ואת מרק NIH U-STAR הדרכה גרנט (T34GM079088 לאוניברסיטת יוסטון-Downtown חוקרים באקדמיה) עבור גישה המיעוט לקריירות המחקר (ממוצע).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific | C-2170 |
References
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae. Fly (Austin). 5, 17810 (2011).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field. J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).
- Woolf, C. J., Ma, Q. Nociceptors--noxious stimulus detectors. Neuron. 55, 353-364 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis. Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell. 109, 485-495 (2002).
