Summary
이 문서에서 우리는 assays가 열 nociception 공부를 입증
Abstract
이 문서에서는 Drosophila의 애벌레에서 열 nociception 공부를 assays를 보여줍니다. 두 번째는 대부분의 도매 (전역) 활성화 또는 이러한 모든 뉴런 3을 포함하면서 한 분석은 열 nociceptors 1,2의 (로컬) spatially - 제한 자극을 포함한다. 함께 이러한 기법은 Drosophila nociceptive 감각 뉴런의 행동 기능의 시각화 및 부량을 허용합니다.
Drosophila의 유충은 온도 nociception, evolutionarily 종의 1,2 걸쳐 보존되고 잠재적으로 유해한 온도 감각 반응을 연구하기 위해 설립 모델 시스템입니다. 이러한 연구 Drosophila의 장점은 respons, 모든 metazoans에서와 같이, 그 신경계의 상대적인 단순 성과 Drosophila에서 근본적인 생물학 4-6의 분자 기초를 해부하는 데 사용할 수있는 유전자 기술의 고도화이다유해 열 자극에 전자는 일반적으로 제시 자극 7 "nocifensive"aversive 탈퇴 관련이 있습니다. 이러한 자극은 무료 신경 엔딩이나 nociceptors 통해 감지하고 organismal 응답의 진폭은 유해 자극에게 8을받은 nociceptors의 숫자에 달려있다. Drosophila에서는 photoreceptors 10들은 최근에 발견된 역할 이외에 유해 열 및 기계적 자극에 9 감지 클래스 IV의 돌기를 arborization 감각 뉴런이다. 잘 발달 수준에서 연구되어 이들 뉴런은 장벽 표피 시트 위에 arborize과 11,12 거의 모든 상피 세포와 연락처를 확인하십시오. 그들은 두 번째 순서 뉴런에 연결할 수있는 중추 신경계 11 복부 신경 코드로 각 클래스 IV 뉴런 프로젝트의 단일 축삭 그 뇌로 프로젝트.
기준 조건 하에서 nociceptive 감각 신경상대적으로 높은 임계값에 도달할 때까지 NS는 해고되지 않습니다. 여기에 설명된 assays는 조사가 기준선 행동 반응이나, 아마도, 다음과 같은 조직의 손상을 ensues sensitization.를 정할 수 있습니다 각 분석은 유해 열 자극에 뚜렷한하지만 관련 locomotory 행동 반응을 유발하고 Drosophila의 애벌레에 열 nociception의 다양한 측면을 시각화하고 수치 연구자를 허용합니다. assays는 원하는 genotypes의 유충이나 nociception에 영향을 미칠 수도 서로 다른 환경 조건 하에서 사육 유충에 적용할 수 있습니다. 열 nociception는 수종에 걸쳐 보존되어 있기 때문에, Drosophila의 유전자 해부에서 gleaned 결과 가능성이 척추 동물 등 다른 생물에서 열 nociception 우리의 이해를 통지합니다.
Protocol
두 열 nociception의 assays에 대한 정상 또는 UV-sensitized 애벌레를 준비하기위한 실험 단계의 일반적인 개요는 그림 1에 표시됩니다.
1. 애벌레의 작성
- 원하는 유전자형의 남성과 여성의 자손의 애벌레를 직접 테스트할 수 있습니다. 또는 유전 십자가는 관심 정의된 유전자형의 자손의 유충을 얻기 위해 설정할 수 있습니다. 20-30 처녀 암컷과 수컷 15-20를 사용하여 플라이 음식이 들어있는 병에 십자가를 설정합니다.
- 계란이 누워 후 5 일, 수확과 감상 플라이 음식을 떠서 부드럽게 630 μm의 (구멍 크기) 메쉬를 통해 물을를 실행으로 긴장하여 깨끗한 초기 셋째 instar의 애벌레. 기아와 dessication을 방지하기 위해 식품의 작은 촉촉한 패드로 초기 셋째 instar의 유충을 (anteroposterior 축을 따라 길이 ~ 3-4mm) 전송합니다. nociceptive sensitization이 테스트되어야하는 경우, 이후의 단계 2.1-2.11를 따릅니다. 애벌레는 absenc에 시험을하는 경우조직 손상 E, 3.1 단계로 바로 진행합니다.
2. 에테르 마취 및 자외선 조사
- 에테르 마취 챔버를 구축.
- 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 떨어져 바닥을 잘라요.
- 뜨거운 금속 주걱으로 microcentrifuge 튜브의 절단 가장자리를 녹여.
- 접사는 좋은 녹은 튜브 표면 메쉬 및 냉각 수 있습니다. 에테르 마취 챔버는 에테르 가스의 입국을 허용하지만, 애벌레의 탈출을 방지합니다.
- 포셉 또는 부드럽게 집에서 만든 에테르 마취 챔버 내부에 10 초 셋째 instar의 유충을 배치하기위한 페인트 브러시를 사용합니다.
- 뚜껑과 가까이의 안쪽을 따라 장소 애벌레.
주 : 다음 두 단계는 에테르가 잠재적으로 폭발성 화학 물질이며 가스가 인간뿐만 아니라 애벌레를 마취 수있는 퓸 후드에서 수행해야합니다.
- 를 들고 10 ML의 비커를 포함 Coplin 병 안에 애벌레를 포함하는 에테르 마취 챔버를 배치면화 공이 디에틸 에테르 ~ 1.5 ML로 적셔.
- 2-2.5 분 에테르 가스에 애벌레를 노출하는 Coplin 용기의 뚜껑을 무시해. 이상 에테르 마취 시간이 악영향 애벌레 행동이나 생존에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 에테르 마취 후, 분산하기 위해 에테르 가스를 위해 후드에 몇 초간을 부여 Coplin 병 / 비커에서 에테르 마취 챔버를 제거합니다. 이제 연구실로 후드에서 이동할 수 있습니다.
- 부드럽게 에테르 마취 챔버에서 작은 배양 접시에 애벌레를 헹굴 위해 물 물총 병을 사용합니다.
- anesthetized 유충은 건조하고 3 "X 1"유리 현미경 슬라이드에 고정 양면 스카치 테이프 스트립에 부드럽게 접사 그들 지느러미 측면을 가릴하는 포셉 및 Kimwipe을 사용합니다.
- 자외선 조사 챔버의 바닥 표면에 슬라이드를 놓고 20 MJ / ㎝ 2 세기에서 6 초 동안 자외선에 유충을 쉽게받을 수 있습니다.
- 부드럽게 양면 scotc의 애벌레 오프 떠 위해 물에 슬라이드를 담가H 테이프.
- 부드럽게 그들이 25 시간 변수 기간 (8 -24 시간) 동안 복구할 수 플라이 음식을 ~ 1.0 ML을 포함하는 15 X 45mm 하나의 DRAM 유리 문화 유리병에 조사 애벌레를 배치 포셉 또는 페인트 브러시를 사용 ° C 또는 열 nociception의 assays를위한 재 수확하기 전에 다른 원하는 문화 온도.
3. 국부 열 프로브 분석
우리는 프로 데브 공학 (재료의 표 참조)가 제조하는 맞춤 건설한 열 프로브를 사용하여 개별 애벌레 몸 세그먼트에 유해 열 자극을 전달합니다. 이 탐사선의 최적 설계 기능을 가지고 있지만 (~ 0.07 mm이 지역의 작은 금속 팁과 정확하게 23 세트 포인트 온도를 유지하는 능력 ° C - 65 ° C까지) 원칙적으로 가열 수있는 작은 팁을있는 모든 도구를 최대 20 초 정도의 기간 동안 정의된 온도에 충분합니다. 프로브 팁이 dorsa에 정확하게 초기 3 회 instar의 애벌레를 자극하는 데 사용됩니다복부 세그먼트 대답에 난 중간선 (그림 2 참조). 이 열 자극에 대한 응답에서, 유충은 일반적으로 360도 이상으로 laterally 압연 aversive 인출 동작합니다. 이 동작은 일반적으로 그들의 locomotory 활동 13 짧은 일시 중지를 포함하지 않은 유해 상온 금속 탐침에 대한 그들의 가벼운 터치 응답과는 별개입니다.
열 프로브 분석을위한 프로토콜 :
- 온도 프로브의 미리 설정된 온도가 세트 포인트를 원하는합니다.
- 부드럽게 애벌레가 연속적으로 자극 예정되는 플랫 플랫폼 (우리가 일반적으로 바인더의 비닐 커팅의 작은 조각을 사용)에 개별 애벌레를 전송할 화필이나 집게를 사용합니다. 유충은 온도 프로브와 접촉하기 전에 물을 박막이 적용되어야한다. 비닐을 만질 때 유충은 건조한 아니라는 것을 확보하면서 애벌레를 덮고 물을 영화는 가능한 작은 완전히 유충을 포함해야.
- 부드럽게 프로브 및 유충의 표면 (그림 2 참조) 사이에 45에 대한 ° 각도로 끝을 가진 빛의 압력을 적용 세그먼트 A4의 유충에 대한 프로브 팁을 누르십시오. 압력 유충의 표면에 약간의 굴곡을 일으킬해야하며 일반적으로 운동을 방지하기에 충분합니다. 유충은 이동을 계속하면 약간 더 압력을 적용하고는 일반적으로 중단됩니다. 전망 또는 어떤 일정한 프로브 연락처에 대한 필드를 넘어선 이동이 응답 또는 20의 단절까지 달성될 수 없다는 애벌레에서 데이터를 기록하지 마십시오.
- 금단 응답 전시 때까지 또는 20초 컷오프에 도달할 때까지 유충을 자극 계속, 중 먼저 발생합니다. 애벌레가 응답하는 것은 일반적으로 먼저 머리와 꼬리 부분을 리프팅의 예비 동작을 보여줍니다. 이것은 일반적으로 최소한 360도 롤링의 철수의 행동 뒤에있다. 360 도의만이 완벽한 롤은 nocifensive 동작 (예비 hea으로 채점됩니다D 또는 꼬리 인상)이 아닙니다.
- 탈퇴 문제는 프로브와 함께 릴리스 접촉을 시작하고 금단 증상까지 지연 또는 시간을 기록되면. 아무런 금단 동작 20 초 이내에 관찰되지 않은 경우 다음 유충이 아닌 응답이다. 조치가 추가로 두 개의 범주로 나눌 수 있습니다. 인출 동작은 5 초 이내에 표시되면 유충은 빠른 응답 기능입니다. 인출 동작은 5-20초 사이에 표시되면 유충은 느린 응답 (Babcock, 외. 2009 년 그림 1 참조) 1입니다.
4. 글로벌 히트 플레이트 분석
열 플레이트 분석은 전체 동물 유해 열 자극에 직면하면 Drosophila의 애벌레에 열 nociception을 측정하도록 설계되었습니다. 개인 중순 제 3 회 instar의 애벌레는 60 X 15mm 페트리 접시에 물을 80 μl 드롭에 배치됩니다 - 약도와 검정 세트의 사진을위한 그림 3을 참조하십시오최대. 배양 접시 그러면 고체 가열 블록 ( "열 플레이트"로 칭함)에 배치됩니다. 워터 드롭 상승의 온도로서, 유충은 우리가 머리 물장구 치기, 롤, 채찍, 발작과 마비 되나 않은 다섯 틀에 박힌 행동의 시리즈를 전시하고 있습니다. 이러한 행동은 유충은 우리가 최적 조건 (95 ° C 열 플레이트, 80 μl 드롭 것으로 나타났습니다 여기서 제시 잠겨있는 어느 정도 열 접시의 설정점 온도와 물의 부피의 함수에있는 바와 같이 물) 그들 사이의 최소한의 중복과 행동의 모든 5를 관찰입니다.
열 플레이트 분석을위한 프로토콜 :
- 유충을 보는 충분한 높은 콘트라스트 조명이있다는 것을 보장하는 광섬유 조명 가이드를 둡니다. 테스트 유충 필요한 경우 사용합니다. 광 전력 검증이 유충의 주위 더위를 피하기 위해 낮은에 있어야합니다.
- 평평한 들고 열 판로 가열 블록을 놓고 열 플레이트쪽으로 배치현미경 기지이다. "높음"위치로 열 접시를 켜고, 온도 약 15 분 정도 안정 수 있도록, 그리고 95 ° C의 표면 온도를 달성하기 위해 적절하게 조정
- 증류수 80 μl를 측정하고 micropipettor있는 60 X 15mm의 폴리스티렌 페트리 접시의 중앙에 물 방울을 넣으십시오.
- 부드럽게 물 방울의 중간에 깨끗한 중순 제 3 회 instar의 유충을 배치하기 위해 집게를 사용하십시오. 가장 가까운 가능한 한 원래의 80 μl로 가열되는 드롭이 유지되도록 물을 최소한의 가능한 볼륨으로 유충을 전송하려고합니다.
- 부드럽게 열 접시에 고체 가열 블록에 워터 드롭과 유충이 들어있는 페트리 접시를 놓습니다. 전체 유충과 물이 방울이보기에 너무 빨리 접시의 위치를 조정합니다. 그림 3과 비디오 1-6을 참조하십시오.
- 순간 타이머를 시작 배양 접시가 열 판과 기록 고체 가열 블록에 배치됩니다각 행동의 발병의시기. 원하는 경우, 동작은 또한 비디오를 기록할 수 - 각 행동의 대표적인 예제를위한 비디오 1-5을 참조하십시오. Leica 소프트웨어 버전 3.7이 영화를 레코딩에 사용되었다 녹화 모드는 "연속"이었다, 카메라 해상도는 3 메가픽셀이었다 (우리가 계산 이미지 해상도는 10 μm의 / 픽셀입니다 함께 0.63x 줌 사용) 및 프레임 / 초는 44.5 있었다.
5. 대표 결과
국부 열 프로브 분석 :
온도 프로브와 접촉되면 유충은 일반적으로 아기의 머리와 꼬리를 리프팅의 예비 동작을 보여줍니다. 일반적으로 머리 리프팅은 꼬리 리프팅에 의해 첫번째 다음에 보인다. 몇 초이 예비 동작 후 유충은 일반적으로 우리가로서 참조하는 laterally 압연 시작 "aversive 탈퇴 동작." 예비 행동이나 인출 동작이 표시되는 이후 시간은 기온이나 GE에 따라 다를 수 있습니다netic 배경. 우리의 초기 연구에서 우리는 다양한 프로브 세트 포인트의 온도에서 aversive 탈퇴를 전시 애벌레의 비율을 측정하고 48 ° C에서 모든 애벌레는 (<5들) 빠른 응답되는 최저 기온 것으로 나타났습니다. 여기서는 애벌레 열 nociception 응답 (그림 4A)에 천장이있다는 것을보고합니다. 백퍼센트 빠른 조치가 52 ° C의 온도 프로브까지 관찰된다 그러나 54에 ° C 이상, 애벌레의 90 % 이상 연락도시 20을 대응 실패합니다. 이 애벌레가 20의 컷오프 따라 움직이고 계속 않습니다.
이전에 한 바와 같이, 각각의 온도에서 탈퇴 문제의 범주는 꾸몄다과 통계적으로 비교할 수 있습니다. 이것은 행동 분석임을 감안할 때 유충의 유충과 개별 사용자 사이 변화가있다. 이러한 용도에 대한 상세한 설명 우리는 일반적으로 시험 조건 30 애벌레의 3 세트를 측정합니다. 위스콘신의 간단한 분류 외에우리가 이전에 보고된 것으로 thdrawal 지연, 우리는 진폭이 (롤이나 aversive 탈퇴 동작에서 보낸 시간 숫자)도 (그림 4 참조) 측정할 수 있다고 여기를보고합니다. 놀랍게도, 낮은 온도는 롤의 높은 숫자를 유도할 수있는 표시 (그림 4B)와 더 많은 시간 (데이터가 표시되지 않음) aversive 탈퇴에 소비하기 때문에 입력 온도와 반응의 견고 사이에 반비례 관계가있을 나타납니다. 이것은 유해 온도에 노출 기간은 견고의 주요 결정자있을 수 나타낼 수 있습니다.
열 플레이트 분석 :
다섯 틀에 박힌 locomotory 행동은 열 접시에 물 속에 포장되어 유충의 양도에 따라 관찰하고 있습니다. 이것은 아래에서 설명하고 물에 unheated 유충의 전형 locomotory 동작과 함께 비디오에 표시됩니다. 이러한 행동이 관찰되는에서 평균 대기 시간은 그림 5에 표시됩니다로서 각 지연에 대해 측정된 평균 워터 드롭 온도입니다. 최적의 분석 조건이 여기에 제시된에서 가끔 압연 및 갈기 행동은, 중복 사항을 생략하거나, 반대 순서로 발생하고 있지만 각각 별개의 행동을 보여주는 애벌레의 비율은 77에서 100 % (그림 5B)로 원거리. 관찰 행동은 순서에서 다음과 같이 설명되어 있습니다 아래 표시된 시간에 비디오로 시청하실 수 있습니다
- 가열 부재의 정상 동작 : 머리의 움직임을 검색하여 함께 연동 운동. 6시 27분에서 비디오를 참조하십시오.
- 머리 물장구 치기 : 애벌레의 움직임은 앞으로 또는 측면 움직임에 신속 향해. 이 운동은 물속에서 자신의 정상적인 운동 (비디오 1 참조)과 비슷하지만 더 jerkily하고 지속적으로 발생합니다. 6시 40분에서 비디오를 참조하십시오.
- 롤 : 유충은 laterally 적어도 전체 360 °를 굴리는 것과 같습니다. 6시 50분에서 비디오를 참조하십시오. 이 발생할 수가끔 변수 횟수와 불완전 롤을 포함한다. 우리가 단지 전체 360 ° 롤을 계산 동작을 채점의 목적을 위해. 이 동작은 열 프로브의 로컬 응용 프로그램과 함께 본 것과 가장 유사합니다.
- 채찍 : 꼬리에 가까운 매우 짧게 머리를 가지고 anteroposterior 축을 따라 애벌레가 전시 급격한 수축 - 릴리스 동작을. 7시 11분에서 비디오를 참조하십시오. 채찍질은 종종 신속하게 연속적으로하거나 압연과 같은시기에 관찰된다.
- 발작 : 유충은 anteroposterior 축을 따라 밖으로 뻗어과 굽힘없이 고주파 온 - 몸 흔들어 동작을 전시하고 있습니다. 7시 25분에서 비디오를 참조하십시오.
- 마비 : 유충은 움직임을 중단됩니다. 다른 사람들이 그때 저주파 맥동 운동을 나타내는 반면에 일부 유충 이것은 영구적이다. 7시 36분에서 비디오를 참조하십시오.
이러한 데이터는 것이 좋습니다 다섯 번째 문자의 발병에 물 방울과 대기의 온도애벌레 / 물 방울의 글로벌 가열시 관찰 acteristic 행동은 매우 상호됩니다.
1 그림. 애벌레의 준비와 분석을위한 실험적인 단계의 개요. 이전 열 프로브 또는 열 플레이트와 nociception을 시금에, 특정 주식이나 유전 십자가에서 파생된 애벌레는 수확 및 식품의 세척합니다. nociceptive sensitization은 (같은 기준 nociception 반대) 평가되어야하는 경우, 수확은 에테르 마취 (에테르에 노출), 장착, 자외선 조사, 그리고 플라이 식품에 대한 회수 기간이옵니다. 수확하거나 복구 애벌레는 다음 중 하나를 열 프로브 (로컬) 또는 열 플레이트 (전역) 분석을 사용하여 유해 테스트 온도를 받게됩니다. 숫자가 표시된 단계를 (들) 설명하는 방법 텍스트의 섹션을 참조하십시오.
FigurE 2. 실험은 지역 열 프로브 분석에 대해 설정합니다. 열 프로브는 프로브의 온도를 설정하고 유지하는 데 사용되는 열 제어 장치에 의해 제어됩니다. 프로브 anteroposterior 축에 수직 개최하고 수평으로 45 °의 각도로 애벌레를 자극하는 데 사용됩니다. 그림과 같이 프로브 연락처는 복부 세그먼트 A4에서 특별히 만들어졌다. 사용자는 20초 컷오프 때까지 또는 롤링 동작이 개시까지 부드럽게 압력이 접촉을 유지해야합니다. 온도가 유해으로 인식되면 유충은 적어도 하나의 360 ° 롤 특징으로 aversive 탈퇴 동작을 보여줍니다. 롤스의 수는 (그림 4B 참조) 하나 또는 여러 될 수 있습니다.
그림 3. 열 플레이트 분석을위한 설정 실험. (A) 60 X 15mm 배양 접시의 가로보기의 만화는 한 중반 제 3 회를 포함하는80 μl 워터 드롭의 스타 유충. (B) 유충의 최고 전망의 만화는 현미경으로 본 물의 드롭의 중간에 위치. 이 분석을위한 워크 스테이션의 가로보기 (C) 사진. (D) 유충의 사진은 현미경을 통해 볼.
4 그림. 열 프로브 분석을 사용하여 행동 반응의 부량. () 조치의 %의 플롯에서는 각 카테고리 (빠르게, 느리게, 비 조치) 대 온도에 속하는. (B) 각각의 유충이 증가 유독함의 네 가지 시험 온도 (42 ° C ~ 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C 및 52 살에 전시 롤의 수를 비교 aversive 탈퇴 동작에 대한 대기 시간의 플롯 ° C).
그림 5. 열 플레이트 분석 : 지연 시간 및 온도 대 Behavior. () 95의 최적의 조건에서 각각의 행동 반응에 대한 지연 시간 및 평균 워터 드롭 온도 ° C (뜨거운 플레이트 표면 온도)와 물 80 μl 드롭 (N = 150). 각 동작은 특정 시간 간격 내에 관찰 않습니다. 워터 드롭의 온도는 평균되었다 상단이나 하단의 드롭의 (각 위치에 n은 = 10 드랍스) 이러한 측정치 중 하나에 삽입 열전대를 사용하여 측정되었다. (B) 애벌레의 비율이 최적의 분석 조건 하에서 각각의 행동 반응을 전시. 압연과 채찍질 각각 77과 시간의 80 %를 관찰하는 동안, 맞고 경련 및 마비는 시간의 거의 100 %를 관찰하고 있습니다. 낮은 표면 온도 설정 포인트 발작과 마비에서 압연 및 갈기 생략하거나 동시에 발생할 수있는 200의 내에서 높은 세트 지점에서 관찰되지 않습니다. N = 150. (C) 마비의 행동을 다음과 개시 살아남을 애벌레의 비율. 될 때까지 애벌레가 가열되었다ginning 마비 후 회복 표준 배양 조건에 제거됩니다. 실물 크기 모형 처리 유충 열 노출을 제외하고 동등한 대우를 받았다. pupae과 실용적 성인의 형성은 7-13 일에 계량했다. N = 120.
그림 6. 애벌레 nociceptive 감각 뉴런의 불활 성화의 행동 응답 대기 시간을 증가시킵니다. 지정된 genotypes 각 동작에 대한 대기의 줄거리 : W 1118, Gal4 109 (2) 80 = MD-Gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / +, UAS-Ork1.Δ-NC / + MD- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C, 그리고 md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. multidendritic 말초 감각 뉴런의 네 가지 클래스에서 UAS-규제 transgenes의 MD-Gal4 드라이브 표현, UAS-Ork1.Δ-C 14 시냅스 전달에 필요한 Drosophila 오픈 정류기 K + 채널의 수정된 버전을 표현하고, U AS-Ork1.Δ - 노스캐롤라이나 14 시냅스 전달에 방해가되지 않는이 동일한 채널의 추가로 수정된 버전을 표현합니다. MD-Gal4 드라이버 6 UAS-Ork1.Δ-C의 transgenes 모두 베어링만이 애벌레가 다섯 관찰된 행동 (물장구 치기, 롤, 발작, 그리고 마비) 네 가지에 대해 증가 대기 시간을 표시합니다. 참고 또한 있기 때문에 그들이 롤백하기 전에이 동물 채찍을 압연으로 증가 대기 중. 별표는 학생의 T-테스트하여 P <0.05를 나타냅니다. N = 유전자형 30 애벌레.
보충 비디오 1. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .
보충 비디오 2. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .
보충 비디오 3."대상 ="_blank "> 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 4. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .
보충 비디오 5. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .
보충 비디오 6. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
여기에 설명된 assays는 질적 및 양적 유해 열 자극에 대한 반응에 대해 다른 genotypes의 유충을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 열 프로브 분석의 주요 기능은 자극은 단지 하나의 현장에서 주어진다는 것입니다. 이것은 아마도 아마도 유일한 작은 탐침으로 연락을 세그먼트에있는 클래스 IV 뉴런-것들의 집합과 바로 인접 세그먼트 11에서 이들의 발포로 안내합니다. 때문에 현지 자극, 열 프로브 분석은 지역과 같은 뜨거운 난로에 문의 손으로로서 특정 몸에 현지되는 유해 자극을 감지의 일반적인 감각 경험을 모방한 것이었 지요. ) I) 사용자가 유충에 프로브를 적용있는 압력, II 프로브의 정확한 위치 열 프로브 분석의 단점은 그것이 가능성이 세 가지 요소에 의한 것이 일부 사용자에 대한 사용자의 다양성을 가지고있다는 것입니다 기본 nociceptive 뉴런, 그리고, 3) 정확한 중앙에 상대적으로 유충에르 어떤 탐사선이 접점 유충의 표면에서.
우리는 이전에 주어진 온도를 1로 자신의 탈퇴 대기 시간을 기준으로 비 답장, 느린 조치 및 신속한 조치로 분류 애벌레의 양적 전략을보고했다. 여기에서 우리는 더 높은 온도에 애벌레 대응에 대한 리포트입니다. 흥미롭게도, 우리는 애벌레 열 nociceptive 답변에 천정이있다는 것을 발견하고이 천장 52 54 사이에 놓여 있다고 ° C. 이것은 일시적인 수용체 잠재적인 (TRP) 52보다 높은 온도에서 게이팅 수있는 채널 ° C를 소유하지 않는 애벌레 나타낼 수 또는 그것이 사용되는 뉴런이나 근육이 시작하거나 심지어 그들 aversive 탈퇴에서 작동하기 전에 운동 반응이 손상되어 수행하는 것이 좋습니다 수 있습니다. 우리는 또한 금단의 진폭의 다른 분석 반응을 이용하여 응답의 "견고"의 지표로서 롤의 숫자 중 하나를보고합니다. Naively 한이러한 매개 변수가 자극을 증가 온도 또는 시간으로 증가할 것이라고 기대합니다. 놀랍게도, 우리는이 사건 아닌 것을 알게됩니다. 애벌레는 유해 범위 (42 ℃)의 낮은 끝에 온도에서 긴 시간 동안 자극하는 것은 더 많은 롤을 보여 주며 더 많은 시간이 애벌레는 높은 온도 (48-52 ° C)에서 탐지보다 압연 보냈다. 이것은 유해 온도 창 안에 그것이 주로 응답의 진폭을 결정하는 노출의 기간입니다 것이 좋습니다. 애벌레는 매우 유해 온도에 노출되어 있기 때문에 (48-52 ° C) 매우 빠른 속도로 평균 반응, 그들은 시간의 긴 기간 동안 덜 유해 온도에 노출 애벌레 많은 롤스로 전시하지 않습니다.에게 여기에 보고된 응답 진폭의 분석은 다른 genotypes이나 환경 조작가를 비교할 수있는 더불어 또 다른 양적 차원을 추가합니다.
열 플레이트 분석의 주된 기능은 유해에 대한 글로벌 노출과 관련된 것입니다더위. 따라서 그것은 뜨거운 난로를 만져보다 가열 가마솥에 앉아 동물에 더 가깝다입니다. 유충이 글로벌 노출에 대한 행동 반응은 현지 자극에 따라 관찰하는 것보다 더 복잡 실험실에서, 야생에서 세계적으로 유해 자극을 경험할 수 있습니다했을 때 그것은 명확하지 않지만. 또 다른 3 언급 열 플레이트 분석의 강점은, 유충을 만지는 것은 프로토콜의 구성 요소가 아니므로 그것이 작은 사용자로 사용자의 다양성을 가지고있다는 것입니다. 유일한 상당한 편차는 각 행동 개시하고 이것이 반복 시청 / 친숙로 최소화할 수있을 때 정의하는 것으로 보인다. assays 사이에 흥미로운 차이는 aversive 동작이 시작되는 온도입니다. 이것은 열 프로브보다 열 플레이트 분석에서 훨씬 낮은 수 있습니다. 열 프로브 (머리와 꼬리 인상)으로 연락 애벌레가 전시 예비 동작 ° C 열 작은지면으로 ~ 27에서 관찰 헤드 록 음악의 한 형식으로 상관 관계를 수전자 분석. 그것은이 반응은 '고통'보다 더 '불편'을 반영하는 것이 가능합니다. 우리는 심지어 높은에서 압류를 흔든다의 상관 관계, 그리고 마비를 감찰하지 않은 (최대 48 ° C) 열 프로브 분석 기온 그리고 신체의 하나 이상의 지역에서 소성 감각 신경 세포의 중요한 대량임을있을 수 있습니다 이러한 행동을 가지고 필요했습니다. 그 세계 자극 로컬로 행동을 실행하는 데 충분하지가의 연결 응답 합산 포함됩니다 나타내는 열 프로브로 관찰 nociceptive 임계값의 하단 끝 아래 - 흥미롭게도, 발작과 마비 행동은 온도 (37 ° C ~ 34)에서 관찰된다 열 프로브의 응용. 이러한 온도 실제로 애벌레에 대한 유해으로 인식하고있는가 대부분의 경우하지 마비 동작을 시작하고 이후 플라이 음식을 복구하는 데 사용할 수 있습니다 애벌레는 (그림 5C) 살아남을 것을 관찰에 의해 지원됩니다. 또한 인수를 지원하는 그 열기 PL먹은 분석은 nociceptive 답변을 읽고있는 것은 잘 알려진 nociceptive 감각 뉴런에서 시냅스 전송을 차단하는 것이 관찰된 행동 (그림 6) 대부분의 대기 시간을 증가한다는 사실입니다. 높은 온도를 일으키는 행동을위한 대기 시간에는 증가가 없다는 것을 관찰 MD-Gal4을 표현하지 않는 감각 뉴런이 동작이 필요할 수 있습니다하는 것이 좋습니다.
글로벌 분석의 급속 가열 물 한 방울의 지역 분석 및 침수에 작은 금속 탐침의 핫 팁 - 요컨대, 두 assays는 정의된 온도의 유해 열 자극에 개별 애벌레를 노출하는 방식입니다. 유전 배경 및 / 변화 또는 환경 조건 (예 : 플러스 또는 마이너스 조직 손상에) 변화에 노출의 Drosophila의 유충의 행동 반응은, 공부하고 이러한 assays를 사용하여 계량하실 수 있습니다. 궁극적으로 이러한 assays 결과에서 우리가 더 NOC을 제어하는 유전자 네트워크를 이해하는 데 도움이됩니다Drosophila 및 기타 관련 종의 iception.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
우리는 원고의 비판적 읽기를 위해 열 플레이트 분석, 플라이 주식에 대한 블루밍턴 Drosophila 증권 센터, Galko 연구소 회원 제안에 대한 애벌레 열 프로브 분석, 숀 스위니을 개발하기 위해 열 프로브 설계, 다니엘 Babcock위한 기독교 랜드리 감사드립니다. 이 작품은 MJG 및 연구 경력 (AVG)에 소수 액세스를위한 NIH MARC U-STAR 교육 그랜트 (휴스턴 - 다운 타운 학자 아카데미 대학 T34GM079088)에 NIH R01 NS069828에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific | C-2170 |
References
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae. Fly (Austin). 5, 17810 (2011).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field. J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).
- Woolf, C. J., Ma, Q. Nociceptors--noxious stimulus detectors. Neuron. 55, 353-364 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis. Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell. 109, 485-495 (2002).
