Summary
Bu yazıda, tayinlerde termal nosisepsiyon çalışma göstermek
Abstract
Bu yazıda, Drosophila larva termal nosisepsiyon okumak için testler göstermektedir. Ikinci en toptan (global) aktivasyonu veya bütün bu nöronlar 3 içerirken Bir tahlil termal nosiseptörleri 1,2 (yerel) mekansal kısıtlı stimülasyon içerir. Birlikte, bu teknikler Drosophila nosiseptif duyu nöronlarının davranışsal işlevlerin görüntülenmesi ve ölçümü sağlar.
Drosophila larva termal nosisepsiyon, evrimsel türler 1,2 arasında korunur zararlı sıcaklıklara duyusal yanıt çalışmak için kurulmuş bir modeli sistemidir. Bu tür çalışmaların Drosophila avantajları düzelen, tüm metazoans olduğu gibi, bu sinir sisteminin göreceli olarak basit ve Drosophila yatan biyolojisi 4-6 moleküler temeli incelemek için kullanılabilir genetik teknikler sofistike olanzehirli termal uyarılara e genellikle sunulan uyaran 7 için bir "nocifensive" itici çekilmesi içerir. Bu tür uyaranlar serbest sinir uçları veya nosiseptörleri aracılığı ile algılanır ve organizma yanıt genlik zararlı uyaranın 8 alma nosiseptörlerin sayısına bağlıdır edilir. Drosophila, bu fotoreseptör 10 olarak yeni keşfedilen rolüne ek olarak zararlı termal ve mekanik uyarıcılar 9 algılamak sınıf IV dendritik arborization duyusal nöronlar. Çok iyi gelişim düzeyinde incelenmiştir bu nöronlar, epidermal bariyer tabaka üzerine arborize ve 11,12 neredeyse tüm epidermal hücreler ile temas edin. Bu ikinci derece nöronlar bağlanabilir merkezi sinir sistemi 11 ventral sinir kordonu içine her sınıf IV nöron projelerin tek akson bu beyin projesi.
Bazal koşullar altında, nosiseptif duyu nöronispeten yüksek bir eşik ulaşılana kadar ns yanmaz. Burada anlatılan testler araştırmacı temel davranışsal tepkileri ya da, muhtemelen, aşağıdaki doku hasarı gelişir sensitizasyon. Ölçmek için izin Her test zararlı termal uyaranlara farklı ama ilişkili lokomotor davranışsal tepkileri kışkırtır ve Drosophila larva termal nosisepsiyon çeşitli yönleriyle görselleştirmek ve ölçmek için araştırmacı izin verir. Testler istenilen genotiplerinin larva veya nosisepsiyon etkileyebilecek farklı çevresel koşullar altında büyüdü larva uygulanabilir. Termal nosisepsiyon türler arasında korunmuş olduğundan, Drosophila da genetik ayrımında toplanan bulgular olasılıkla omurgalılar dahil, diğer türlerde de termal nosisepsiyon anlayışımızı bilgilendirecektir.
Protocol
İki termal nosisepsiyon deneyleri için normal veya UV-sensitize larvası hazırlanması için deney adımları tipik bir taslağı Şekil 1 'de gösterilmiştir.
1. Larvalar hazırlanması
- Istenen bir genotip Erkek ve dişi döl larvalarının doğrudan test edilebilir. Alternatif olarak, genetik bir çapraz ilgi tanımlanmış bir genotip döl larva elde etmek için ayarlanabilir. 20-30 bakire kadın ve erkeklerde 15-20 kullanarak sinek gıda içeren şişelerde haçlar ayarlayın.
- Yumurtayı 5 gün sonra, hasat ve Duygusal sinek yiyecekleri karıştırıyordu ve yavaşça bir 630 mikron (gözenek boyutu) örgü üzerinden akan su ile süzme temiz erken üçüncü evre larvaları. Açlık ve kuruma önlemek için gıda küçük bir nemli pad erken üçüncü evre larvaları (ön-arka eksen uzunluğu ~ 3-4 mm) aktarın. Nosiseptif sensitizasyon test edilecek olursa, sonraki basamaklar 2,1-2,11 izleyin. Larva absenc test edilecek isedoku hasarı e, 3.1 doğrudan adım devam edin.
2. Eterleştirme ve UV Işınlama
- Bir eterleştirme odası oluşturun.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü kapalı alt kesin.
- Sıcak metal spatula ile mikrosantrifüj tüpünün kesme kenarı eritin.
- Eke dayalı ince bir erimiş tüp yüzeyine örgü ve soğumasını bekleyin. Eterleştirme odası eter duman girişine izin vermek, ancak larva kaçmasını önlemek olacaktır.
- Forseps veya hafifçe bir ev yapımı eterleştirme odasının içinde 10 erken üçüncü evre larvaları yerleştirmek için bir fırça kullanın.
- Kapak ve yakın iç boyunca Yeri larva.
Not: Sonraki iki adım eter potansiyel olarak patlayıcı kimyasal ve onun dumanı bir insan gibi larva uyutmak gibi bir çeker ocak içinde yapılmalıdır.
- Bir taşıyan bir 10 ml beher içeren bir Coplin küpün içinde larva içeren eterleştirme odasına yerleştirinpamuk dietil eter ~ 1.5 ml ile ıslatılır.
- 2 ile 2,5 dakika eter buharlarına larva maruz Coplin kavanozun kapağını vidalayın. Uzun eterleştirme kez olumsuz larva davranış veya yaşam etkileyebileceğini unutmayın.
- Eterleştirme ardından, dağıtmak için eter dumanı için kaputun birkaç saniye vererek, Coplin kavanoz / kaptan eterleştirme odasına çıkarın. Şimdi laboratuara geri başlığa hareket edebilir.
- Yavaşça eterleştirme odasına küçük bir petri içine larva durulama için bir su püskürtme şişesi kullanın.
- Anestezi larvaları kuru ve 3 "x 1" cam mikroskop slayt tutturulmuş çift taraflı seloteyip bir şerit hafifçe yapıştırın bunları dorsal yüzü yukarı kaldırabilmesi için forseps ve Kimwipe kullanın.
- UV ışınlama odasının alt yüzeyinde slayt yerleştirin ve 20 mJ / cm 2 yoğunluğu az 6 saniye süreyle UV ışınlarına maruz larva.
- Yavaşça çift taraflı scotc larvaları off float su kaydırağı daldırınh bant.
- Nazikçe 25 zaman değişken bir süre (8 -24 saat) kurtarabilirsiniz sinek gıda ~ 1.0 ml içeren 15 x 45 mm bir dram cam kültürü şişe içinde ışınlanmış larva yerleştirmek için forseps veya bir fırça kullanın ° C veya Termal nosisepsiyon deneyleri için yeniden hasat öncesi istenen diğer kültür ısısı.
3. Yerel Isı Probe Assay
Biz Pro-Dev Mühendislik (malzemelerin bkz. Tablo) tarafından üretilen özel bir dahili ısı probu kullanarak Tek bir larva, vücut segmenti için zararlı bir termal uyaran sunmak. Bu prob optimum tasarım özelliklerine sahip olsa da (~ .07 mm 2 alan küçük bir metal uç ve tam 23 setli sıcaklık korumak için yeteneği ° C ile 65 ° C) prensip olarak ısıtılabilir küçük bir uç ile herhangi bir aracı 20 saniye kadar bir süre için tanımlanmış bir sıcaklıkta için yeterli olmalıdır. Prob ucu dorsal doğrusu erken 3. Larvalar uyarmak için kullanılırabdominal segmentinde A4 l orta hat (bkz. Şekil 2). Bu termal uyarana yanıt olarak, larvalar genellikle 360 derece veya daha fazla yanal haddeleme caydırıcı bir geri çekilme davranışı sergileyecek. Bu davranış genellikle kendi lokomotor aktivite 13 kısa bir duraklama içeren bir zararlı olmayan oda sıcaklığında metal prob onların hafif dokunma tepkisi farklıdır.
Isı probu test için protokol:
- Isı probu Öncesi ayarlanan sıcaklık set istenen.
- Yavaşça larvalar daha sonra teşvik edileceği bir düz platform (genellikle bir bağlayıcı vinil kesim küçük bir parça kullanın) üzerine bireysel bir larva transfer etmek için bir fırça veya forseps kullanın. Larva termal prob ile temas etmeden önce ince bir su filmi ile kaplanmış olmalıdır. Vinil dokunurken larva kuru olmadığını sağlarken larva kapsayan su filmi, mümkün olduğunca az ve tamamen larva kapağı olmalıdır.
- Yavaşça probu ve larva yüzey (bkz. Şekil 2) arasındaki yaklaşık bir 45 ° açıyla ucu ile hafif bir basınç uygulayarak segmentinde A4 larva karşı prob ucu basın. Basınç larva yüzeyinde hafif bir girinti yol gerekmektedir ve genellikle hareket önlemek için yeterli olacaktır. Larva hareket etmeye devam ederse, biraz daha fazla basınç uygulayın ve genellikle durur. Görüş veya hangi sabitini kişi için alanının ötesine taşımak yanıt veya 20 s kesme kadar elde edilemez larva veri kaydetmeyin.
- Para çekme yanıt sergilenmektedir kadar veya 20 saniyelik bir kesim ulaşılıncaya kadar larva uyararak devam, hangisi önce gerçekleşirse. Larvaları yanıt genellikle ilk baş ve kuyruk kaldırma ön davranışı göstermektedir. Bu, genellikle, en azından 360 ° haddeleme çekilmesi davranışı takip eder. 360 derece sadece tam bir rulo nocifensive davranış (ön hea olarak kaydedilecektird veya kuyruk yükseltme) değildir.
- Geri çekilme davranışı prob ile serbest temas başlattı ve çekilme için gecikme veya süreyi kaydetmek sonra. Hiçbir çekilme davranışı 20 saniye içinde görülürse, daha sonra larva olmayan bir cevap olduğunu. Yanıt verenlerin daha 2 kategoriye ayrılabilir. Geri çekilme davranışı 5 saniye içinde gösterilir, sonra larva hızlı cevap olduğunu. Çekilmesi davranışı 5-20 saniye arası gösterildiği edilirse, daha sonra yavaş bir larva-yanıtlayıcı (Babcock, et al. 2009 yılında bakınız Şekil 1) 1 'dir.
4. Küresel Isı Plaka Deneyi
Isı plakası testi bütün hayvan zararlı bir termal uyarıcı ile karşı karşıya iken Drosophila larva termal nosisepsiyon ölçmek için tasarlanmıştır. Bireysel ortalarında 3. Larvalar 60 x 15 mm Petri tabağına su 80 ul damla yerleştirilir - şematik ve deney seti fotoğraflar için bakınız Şekil 3kadar. Petri tabağı daha sonra katı bir ısıtma bloğu ("ısı plakası" olarak anılacaktır) üzerine yerleştirilir. Su damlası yükselir sıcaklık olarak, larva biz kafa thrash, rulo, kırbaç, nöbet, felç olarak adlandırdığı beş basmakalıp davranışlar bir dizi sergiler. Bu davranışları larva biz optimum koşullarda (95 ° C ısı plakası, 80 ul damla olduğunu gördüm ne burada mevcut dalmış olduğu bir ölçüde ısı plakasının istenen sıcaklık ve su hacminin bir fonksiyonu olduğu için su), aralarında en az örtüşme ile davranışların tüm 5 gözlemlemek için.
Isı plakası tahlil için Protokol:
- Larva görüntülemek için yeterli yüksek kontrastlı aydınlatma olmasını sağlamak için fiber optik ışık kılavuzları yerleştirin. Bir test larva gerekirse kullanın. Işık gücü test edilecek larva üzerine ortam ısı önlemek için düşük olmalıdır.
- Düz bir yüzeye kadar ısı plakası haline ısıtma bloğu yerleştirin ve ısı tabağa yerleştirinmikroskop tabanı. "Yüksek" konuma ısı plakası açın, sıcaklığı yaklaşık 15 dakika stabilize etmek için izin ve 95 ° C yüzey sıcaklığı elde etmek için buna göre ayarlamak
- Distile su 80 ul ölçün ve bir micropipettor ile 60 x 15 mm polistren Petri yemeğin ortasında su damlası yerleştirin.
- Yavaşça su damlası ortasına temiz bir orta 3. evre larva yerleştirmek için forseps kullanın. Mümkün olduğunca yakın orijinal 80 ul ile ısıtılacak damla kalır böylece suyun minimum olası hacmi ile larva transferi çalışın.
- Hafifçe ısı plakası üzerinde katı ısıtma bloğu üzerine su damlası ve larvalarını içeren petri yerleştirin. Tüm larva ve su damla görünümünde böylece hızla çanak yerini ayarlayın. Şekil 3 ve videolar 1-6 bakın.
- Şu anda zamanlayıcı başlayın Petri ısı plakası ve kayıt katı ısıtma bloğu yerleştirilirHer bir davranışa başlama zamanı. Eğer istenirse, davranış ayrıca video kayıt olabilir - her davranışın temsili örnekler için bakınız Video 1-5. Leica yazılım sürümü 3.7 film kaydetmek için kullanılan, kayıt modu "Sürekli" olduğunu, kameranın çözünürlüğü 3 Megapiksel oldu (biz hesaplanan görüntü çözünürlüğü 10 mikron / piksel olduğu ile 0.63x yakınlaştırma kullanılır) ve kare / saniye 44.5 idi.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Yerel Isı Probe Assay:
Termal prob ile temas ettiği zaman, larva tipik olarak baş ve kuyruk kaldırma ön davranışı gösterir. Tipik olarak kafa kaldırma kuyruk kaldırarak birinci takip görülmektedir. Birkaç saniye bu ön davranışı sonra larva genellikle biz olarak bakın hangi yanal haddeleme başlar "caydırıcı çekilme davranışı." Ön davranış veya çekilme davranışı gösterilir sonra zaman sıcaklık veya ge göre değişebilirmanyetik arka plan. Bizim ilk çalışmada farklı probu set sıcaklıklarda caydırıcı çekilmesi sergileyen larvaların yüzdesi ölçülür ve 48 ° C, tüm larva (<5 s) hızlı yanıt verdiği en düşük sıcaklık olduğunu gördüm. Burada, larva termal nosisepsiyon yanıt (Şekil 4A) bir tavan olduğunu bildirmektedir. % 100 hızlı bir yanıt 52 ° C arasında bir prob sıcaklığına kadar gözlenir Ancak, 54 ° C ve daha yüksek, larvaların% 90 veya daha fazla temas sonra bile 20 s yanıt vermezler. Bu larvalar 20 s kesim sonrası hareket devam yok.
Daha önce 1 de belirtildiği gibi, her bir sıcaklıkta çekilmesi davranış kategoriye çizilmiştir ve istatistiksel mukayese edilebilir. Bu davranışsal bir tahlil olduğu göz önüne alındığında larva gelen larva ve bireysel kullanıcılar arasında bazı farklılıklar bulunmaktadır. Bunu dikkate almak için biz genellikle test koşulu başına 30 larva 3 set ölçmek. Wi basit bir sınıflandırma ek olarakdaha önce bildirilen olduğunu thdrawal gecikme, biz genliği (rulo veya caydırıcı çekilmesi davranış harcanan zaman sayısı) da (Bakınız Şekil 4) ölçülebileceği sunulmaktadır. Şaşırtıcı bir şekilde, daha düşük sıcaklıklar rulo yüksek sayıda kışkırtmak için görünür (Şekil 4B) ve daha fazla zaman (veriler gösterilmemiştir) caydırıcı çekilmesi geçirdi çünkü giriş sıcaklık ve yanıt sağlamlığı arasında ters bir ilişki olduğu gözlenmektedir. Bu zararlı bir sıcaklığa maruz kalma süresi performanslarının ana belirleyicisi olabileceğini gösterebilir.
Isı Plaka Deneyi:
Beş kalıplaşmış lokomotor davranışlar ısı plakasına suya batırılmış larva transfer etmesi halinde gözlenir. Bunlar, aşağıda açıklanan ve su içinde bir ısıtılmamış larva tipik lokomotor davranışı ile birlikte video olarak gösterilmiştir. Bu davranış gözlenir hangi ortalama gecikme Şekil 5 de gösterilmiştirBir, her gecikme için ölçülen ortalama su damlası sıcaklıkları vardır. Optimum şartlarda çalışıldığında burada sunulan altında zaman zaman inişli çıkışlı ve kamçılama davranışları, örtüşme atlanmış, ya da ters sırada meydana olmasına rağmen, her farklı davranış gösteren larvaların yüzde 77 ila% 100 (Şekil 5B) arasında değişmekteydi. Gözlenen davranışları, kronolojik sırayla, şöyle açıklanmakta ve aşağıda belirtilen zamanlarda videoda izleyebilirsiniz:
- Isı yokluğunda normal hareketi: baş hareketleri arayarak eşlik Peristaltik hareket. 06:27 Video bakınız.
- Kafa Thrash: Larva hamle ileriye veya lateral hareket hızla gidiyoruz. Bu hareket su içinde normal hareket (Video 1) benzer ama daha sarsıla sarsıla ve ısrarla oluşur. 06:40 Video bakınız.
- Rulo: Larva yanal en az bir tam 360 ° yuvarlanıyor. 06:50 Video bakınız. Bu oluşabilirbazen bir değişken sayısı ve eksik rulo içerir. Biz sadece tam 360 ° rulo saymak davranış puanlama amaçları için. Bu davranış ısı prob lokal uygulama ile görülene kadar çok benzerdir.
- Whip: kuyruk yakın çok kısaca kafa getirmek ön-arka eksen boyunca Larva sergiler hızlı daralma-release hareketleri. 07:11 Video bakınız. Çırpma genellikle hızlı arkaya veya haddeleme gibi aynı zamanda görülmektedir.
- Nöbet: Larva ön-arka eksen boyunca uzanır ve bükmeden yüksek frekanslı tüm vücut sallayarak davranışı sergiler. 07:25 Video bakınız.
- Paralizi: Larva hareketi sona erer. Diğerleri sonra bir düşük frekanslı titreşim hareketi sergilemek ise bazı larvaları bu kalıcıdır. 07:36 Video bakınız.
Bu veriler göstermektedir ki beş char başlangıcı için su damlası ve gecikme sıcaklığılarva / su damlası küresel ısınma üzerine gözlenen acteristic davranışları son derece ilişkilidir.
Şekil 1.. Larva hazırlanması ve tahlil için deneysel adımlar Taslağı. Önce ısı probu veya ısı plakası ile nosisepsiyon içlin için belli bir hisse senedi veya genetik çapraz türetilen larva hasat ve gıda temizlenir. Nosiseptif duyarlılık (as bazal nosisepsiyon aksine) değerlendirilmesi gereken ise, hasat eterleştirme (eter maruz kalma), montaj, UV ışını ve sinek gıda toparlanma dönemi takip eder. Hasat veya kurtarıldı larva sonra da ısı probu (yerel) veya ısı plakası (global) testi kullanılarak zararlı testi sıcaklıklara maruz kalmaktadırlar. Sayılar gösterilen adım (lar) tarif yöntemleri metin bölümlerine bakın.
Figüre 2. Deneysel yerel ısı probu test için ayarlanmıştır. Isı prob prob sıcaklığı ayarlanır ve korumak için kullanılan bir ısı kontrol birimi tarafından kontrol edilir. Prob ön-arka eksenine dik tutulur ve yatay ila 45 ° lik bir açı ile larva uyarmak için kullanılır. Gösterildiği gibi Probe temas karın segmentinde A4 özellikle yapılır. Kullanıcı 20 saniye kesim kadar veya haddeleme davranış başlamadan kadar hafif basınç ile temas kadar korumak gerekir. Sıcaklık zararlı olarak algılanır ise, en azından bir larva 360 ° rulo ile karakterize edilen, bir itici çekilmesi davranışı gösterecektir. Rulo sayısı (Şekil 4B bakınız) tek veya birden çok olabilir.
Şekil 3. Isı plakası tahlil için set-up Deneysel. (A) 60 x 15 mm Petri tabağı yatay bir bakış Çizgi in bir ara 3. içeren80 ul su damlası yıldızı larva. (B) larva bir üst görünüşüdür ve Çizgi olarak mikroskop aracılığıyla görüntülenebilir su damla ortasına yerleştirilir. Bu deney için çalışma istasyonu bir yatay bir bakış (C) Fotoğraf. (D) larva Fotoğraf olarak mikroskop aracılığıyla görüntülenebilir.
Şekil 4. Isı probu testi ile davranışsal yanıtın belirlenmesi. (A) cevap verenlerin yüzde Arsa her kategoride (hızlı-yavaş ve cevaps) sıcaklığa göre ait. (B) her bir larva artan zararlılığını dört farklı test sıcaklıkları (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C ve 52 sergilendi rulo sayısının karşılık itici çekilmesi davranışına gecikme Plot ° C).
Şekil 5. Isı plakası deneyi: Gecikme ve Sıcaklık vs BehAvior. (A) 95 arasındaki en iyi şartlar altında her davranışsal yanıta gecikmesi ve ortalama su damla ° C (sıcak plaka yüzey sıcaklığı) ve su 80 ul damla (n = 150). Her davranışı, belirli bir zaman aralığında görülmektedir unutmayın. Su damla sıcaklıkları ortalaması alınmıştır üst veya alt damla (her konum için n = 10 damla) ve bu ölçümlerin ya takılan bir termokupl kullanılarak ölçüldü. (B) larva Yüzde optimum deney koşullarında, her davranış sergileyerek tepki. Haddeleme ve çırpma sırasıyla 77 ve zaman% 80, gözlenir ise, dayak ele geçirdi ve felç zamanın neredeyse% 100 gözlenmektedir. Düşük yüzey sıcaklığı ayar noktaları nöbet ve felç de haddeleme ve kırbaçlanan atlanabilir veya aynı anda oluşabilir 200 s içinde ve daha yüksek ayar noktaları gözlenmez. n = 150. (C) felç davranış aşağıdaki başlaması hayatta larvaların yüzdesi. Olduğu kadar Larva ısıtılırçırçırlama felç ve daha sonra kurtarmak için standart kültür koşulları kaldırıldı. Mock-tedavi larvaları ısıya maruz dışında eşdeğer tedavisi uygulandı. Pupa ve canlı yetişkin Oluşumu gün 7-13 ölçüldü. n = 120.
Şekil 6. Larva nosiseptif duyu nöronlarının inaktivasyonu davranışsal yanıt gecikmeleri artırır. Belirtilen genotipleri için her bir davranış için gecikme Konu: 1118 w, gal4 109 (2) 80 = md-gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / +, UAS-Ork1.Δ-NC / +, md- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C ve md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. multidendritic periferik duyusal nöronların her dört sınıfta UAS düzenlenmiş transgenlerin md-gal4 sürücüler ifade; UAS-Ork1.Δ-C 14 sinaptik iletimi için gerekli Drosophila açık düzeltici K + kanal değiştirilmiş bir sürümünü ifade eder, ve U AS-Ork1.Δ-NC 14 sinaptik iletim engel değildir, bu aynı kanal daha değiştirilmiş bir sürümü ifade eder. Md-gal4 sürücüsü 6 ve UAS-Ork1.Δ-C transgenlerin hem taşıyan sadece larva beş gözlemlenen davranışları (thrash, rulo, nöbet ve felç) dört için artan gecikmeleri gösterir unutmayın. Not Ayrıca, çünkü onlar rulo önce bu hayvanların kırbaç haddeleme için artan gecikme. Asterisk Student t-testi ile p <0.05 gösterir. n = genotip başına 30 larva.
Ek Video 1. video izlemek için tıklayın .
Ek Video 2. video izlemek için tıklayın .
Ek Video 3."Target =" _blank "> video izlemek için tıklayın.
Ek Video 4. video izlemek için tıklayın .
Ek Video 5. video izlemek için tıklayın .
Ek Video 6. video izlemek için tıklayın .
Discussion
Burada anlatılan deneyleri kalitatif ve kantitatif olarak zararlı termal uyaranlara yanıt için farklı genotipleri larvaları değerlendirmek için kullanılabilir. Isı prob assay of bir ana özelliği uyaran yalnızca tek bir loküsündeki verilir olmasıdır. Bu, muhtemelen belki de sadece küçük bir prob ile iletişim segmentinde sınıf IV nöronlar-olanlar alt ve hemen komşu segment 11 bulunanların ateş neden olur. Çünkü yerel stimülasyon, ısı probu test bölgeye böyle bir sıcak soba başvurmadan bir el gibi belirli bir vücut için lokalize bir zararlı uyaran tespit ortak duyusal deneyimi taklit eder. I)) kullanıcı larva için prob uygulandığı ile basınç, ii prob hassas konum: ısı probu testin dezavantajı ise muhtemelen şu üç faktörden kaynaklanıyor olabilir bazı kullanıcı kullanıcıya değişkenlik olmasıdır altta yatan nosiseptif nöronlar, ve, iii) hassas ang göre larva onle hangi prob temas larva yüzeyinde.
Biz daha önce verilen bir sıcaklıkta 1 olarak çekmede gecikme dayalı cevaps, yavaş yanıt ve hızlı yanıt kategorize larvalarının nicel bir strateji bildirdi. Burada da yüksek sıcaklıklarda larva yanıt rapor. İlginçtir, biz larva termal nosiseptif yanıtları için bir tavan olduğunu bulmak ve bu tavan 52 ve 54 arasında yattığını ° C Bu geçici bir reseptör potansiyeli (TRP) 52 daha yüksek sıcaklıklarda yolluk yeteneğine kanal ° C'ye sahip olmadığı larva gösterebilir Alternatif olarak, kullanılan nöronlar veya kasları başlatmak veya onlar bile caydırıcı yoksunluk içinde çalışabilmesi için önce motor yanıt hasar yürütmek olduğunu hatırlatıyoruz. Ayrıca, geri çekme amplitüd cevabı farklı bir analizi kullanılarak-yanıt "sağlamlığı" göstergesi olarak rulo sayısını da sunulmaktadır. Saf, birBu parametrelerin stimülasyon artan sıcaklık veya zamanla artacağı beklenebilir. Hayret, biz bu durumda olmadığını bulmak. Larva zararlı aralığı (42 ° C) düşük sonunda bir sıcaklıkta uzun süre uyarılmış daha rulo göstermek ve daha fazla zaman larvaların yüksek sıcaklıklarda (48-52 ° C) probed daha haddeleme geçirdi. Bu zehirli sıcaklığında pencere içerisinde öncelikle amplitüd cevabı belirler maruz kalma süresi olduğunu göstermektedir. Larvaları son derece zararlı sıcaklıklara maruz beri (48-52 ° C) çok hızlı bir şekilde ortalama yanıt, onlar uzun bir süre boyunca daha az zararlı sıcaklığa maruz larva gibi birçok rulo şeklinde göstermezler. Burada bildirilen yanıt genlik analizi farklı genotipleri veya çevresel manipülasyonlar göre edilebileceği birlikte başka bir nicel boyut katıyor.
Isı plakası testin bir diğer temel özelliği, zararlı bir küresel maruz içeriyor olmasıısı. Bunun gibi, bir sıcak soba dokunmadan daha ısıtma kazanı oturan hayvan daha yakındır. Bir larva bu küresel maruz davranışsal tepkileri, yerel stimülasyonu üzerine gözlenen bu daha karmaşık laboratuar, vahşi bir küresel zararlı uyaranın yaşayabilirsiniz zaman net olmamakla beraber. Ayrıca diğer 3 kaydetti ısı plakası testin bir gücü, larva dokunmadan protokolünün bir parçası değildir çünkü az kullanıcı kullanıcıya değişkenlik olmasıdır. Sadece önemli varyans her bir davranış başlar ve bu tekrarlanan görüş / aşinalık ile minimize edilebilir tanımlarken gibi görünüyor. Testleri arasında ilginç bir farklılık caydırıcı davranışlar başlaması hangi sıcaklıkları. Bu ısı probu ile daha ısı plakası tayininde daha düşüktür. Isı probu (baş ve kuyruk yükseltme) ile temas larva tarafından sergilenen davranış, bir ön ° C ısı plat yılında ~ 27 gözlenen baş thrash bağlılaşığı olabilire testi. Bu yanıt "acı" daha "rahatsızlık" yansıtıyor olması mümkündür. Biz bile yüksek de, nöbet kırbaçlanan bağlılaşığı ve felç gözlenen değil (en fazla 48 ° C) ısı probu test sıcaklıkları ve vücudun birden fazla bölgeden ateş duyu nöron kritik bir kütle olduğunu olabilir Bu davranışları getirmek gerekiyordu. Küresel stimülasyon yerel davranışı tetiklemek için yeterli değildir nöronal yanıtlar toplanarak içerebilir gösteren ısı probu ile gözlenen nosiseptif eşik alt ucunun altına - İlginçtir, nöbet ve felç davranışları sıcaklıklarda (37 ° C ~ 34) gözlemlenmiştir ısı probu uygulaması. Bu sıcaklıklarda aslında larvaları için zararlı olarak algılanan bu çoğu durumda değilsiniz felç davranışı başlar ve daha sonra sinek gıda kurtarmak için izin verilen larvaları (Şekil 5C) hayatta olduğu gözlem tarafından desteklenmektedir. Ayrıca argümanı destekleyen bu ısı plyedik tahlil nosiseptif tepkiler okuyor bilinen nosiseptif duyu nöronlar sinaptik iletimi bloke gözlemlenen davranışları (Şekil 6) çoğunun gecikme artırdığı bir gerçektir. Yüksek sıcaklık kırbaçlanan davranış için gecikme hiçbir artış olmadığını gözlem md-gal4 ifade değil diğer duyusal nöronları bu davranışı için gerekli olabileceğini düşündürmektedir.
Küresel tayininde hızlı ısıtma suyu bir damla yerel tahlil ve daldırma küçük bir metal prob tüyosu - Özetle, her iki çalışma tanımlanan sıcaklık bir zararlı termal uyarana bireyin larva açığa içerir. Genetik geçmişleri ve / veya değişen çevre koşulları (örneğin artı ya da eksi doku hasarı için) değişen maruz kalan Drosophila larva davranışsal tepkiler, okudu ve bu testler kullanılarak ölçülebilir. Sonuçta, bu testlerin sonuçlarının daha iyi noc kontrol genetik ağları anlamanıza yardımcı olacaktırDrosophila ve ilgili diğer türler iception.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz yazının eleştirel okuma için ısı plakası tayini, sinek hisse senetleri için Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve Galko laboratuar üyeleri öneren larva ısı probu tayini, Sean Sweeney geliştirmek için ısı probu tasarımı, Daniel Babcock için Hıristiyan Landry teşekkür ederim. Bu çalışma MJG ve araştırma kariyerleri (AVG) azınlık erişim için bir NIH MARC U-STAR Eğitim Grant (Houston-Downtown Alimler Akademisi Üniversitesi T34GM079088) ile NIH R01 NS069828 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific | C-2170 |
References
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae. Fly (Austin). 5, 17810 (2011).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field. J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).
- Woolf, C. J., Ma, Q. Nociceptors--noxious stimulus detectors. Neuron. 55, 353-364 (2007).
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis. Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell. 109, 485-495 (2002).
