Summary
Dans cet article, nous démontrons essais pour étudier la nociception thermique
Abstract
Dans cet article, nous démontrons essais pour étudier la nociception thermique larves de drosophile. Un test implique une stimulation spatialement restreint (local) de 1,2 nocicepteurs thermiques tandis que le second implique un gros (global) d'activation de la plupart ou tous les neurones de ces 3. Ensemble, ces techniques permettent de visualiser et de quantifier les fonctions comportementales de Drosophila neurones sensoriels nociceptifs.
La larve drosophile est un système modèle établi pour étudier la nociception thermique, une réponse sensorielle à des températures potentiellement dangereux qui est évolutif conservés entre espèces 1,2. Les avantages de la drosophile pour de telles études sont la relative simplicité de son système nerveux et de la sophistication des techniques génétiques qui peuvent être utilisés pour disséquer la base moléculaire de la biologie sous-jacente 4-6 dans la drosophile, comme dans tous les métazoaires, les responsabe à des stimuli thermiques nocifs implique généralement une "nocifensive« retrait aversion pour le stimulus présenté 7. Ces stimuli sont détectés par les terminaisons nerveuses libres ou nocicepteurs et l'amplitude de la réponse organismique dépend du nombre de nocicepteurs recevant le stimulus nociceptif 8. Chez la drosophile, ce sont les neurones de classe IV arborisation dendritique sensoriels qui détectent des stimuli nocifs thermiques et mécaniques 9 en plus de leur rôle récemment découvert que les photorécepteurs 10. Ces neurones, qui ont été très bien étudiés au niveau de développement, s'arborisent sur la feuille de la barrière épidermique et établir des contacts avec presque toutes les cellules épidermiques 11,12. Le seul axone de chaque neurone projets de classe IV dans la moelle épinière ventrale du système nerveux central 11 où ils peuvent se connecter à neurones de second ordre que le projet vers le cerveau.
Dans des conditions de base, neuro nociceptif sensorielns ne se déclenche pas jusqu'à un seuil relativement élevé est atteint. Les tests décrits ici permettent au chercheur de quantifier les réponses comportementales de base ou, vraisemblablement, la sensibilisation qui en découle des dommages aux tissus qui suit. Chaque test provoque distincts mais connexes locomotrices réponses comportementales aux stimuli nocifs thermiques et permet au chercheur de visualiser et de quantifier les différents aspects de la nociception thermique larves de drosophile. Les tests peuvent être appliqués pour les larves de génotypes désirés ou larves élevées dans différentes conditions environnementales qui pourraient avoir une incidence nociception. Depuis la nociception thermique est conservé à travers les espèces, les résultats glanés dans la dissection génétique chez la drosophile sera probablement notre compréhension de la nociception thermique dans d'autres espèces, y compris les vertébrés.
Protocol
Un contour typique des étapes expérimentales pour la préparation larves normale ou UV-sensibilisée pour les deux dosages nociception thermique est représenté sur la figure 1.
1. Préparation des larves
- Larves descendance mâle et la femelle d'un génotype désiré peut être testé directement. Alternativement, un croisement génétique peut être mis en place pour obtenir des larves descendance d'un génotype d'intérêt défini. Mettre en place des croix dans des bouteilles contenant de la nourriture volée en utilisant 20-30 femelles vierges et les hommes 15-20.
- 5 jours après la ponte, la récolte et propre au début des larves du troisième stade larvaire en creusant la nourriture volée molle et légèrement tendu à l'eau courante à travers un 630 um (taille des pores) mailles. Transférer le début de larves de troisième stade (~ 3-4 mm de longueur selon l'axe antéro-postérieur) à un petit tampon humide des aliments pour prévenir la famine et la dessiccation. Si la sensibilisation nociceptive est à tester, suivez les étapes suivantes de 2,1 2.11. Si les larves sont à tester dans le absence de dommages aux tissus, passez directement à l'étape 3.1.
2. Éthérisation et l'irradiation UV
- Construire une chambre éthérisation.
- Coupez le fond d'un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
- Avec une spatule en métal à chaud faire fondre le bord coupé du microtube.
- Apposer une maille fine à la surface du tube fondu et laisser refroidir. La chambre éthérisation permettra l'entrée de fumées d'éther, mais empêcher l'évasion des larves.
- Utilisez une pince ou d'un pinceau à placer doucement 10 larves au début troisième stade intérieur d'une chambre éthérisation home-made.
- Larves lieu le long de la face intérieure du couvercle et fermer.
Remarque: Les deux prochaines étapes doivent être effectuées sous une hotte que l'éther est un produit chimique est potentiellement explosive et ses vapeurs peuvent anesthésier un être humain ainsi que d'une larve.
- Placez la chambre éthérisation contenant des larves de l'intérieur d'un tube de Coplin contenant un bécher de 10 ml portant unboule de coton imbibée de ~ 1,5 ml d'éther diéthylique.
- Vissez le bouchon du tube de Coplin pour exposer les larves à des vapeurs d'éther de 2 à 2,5 minutes. Notez que les délais éthérisation plus susceptibles de nuire à la survie ou le comportement des larves.
- Après éthérisation, retirez la chambre de l'éthérisation Coplin jar / bécher, donnant quelques secondes dans la hotte pour les vapeurs d'éther de dissiper. Vous pouvez maintenant déplacer de la hotte de retour au laboratoire.
- Utilisez un vaporisateur d'eau pour rincer doucement larves de la chambre de éthérisation dans une petite boîte de Petri.
- Utilisez une pince et un Kimwipe pour effacer les larves anesthésié sec et délicatement les apposer côté dorsal sur une bande de scotch double-face fixée à un 3 "x 1" lame de microscope en verre.
- Placer la lame sur la surface inférieure d'une chambre d'irradiation UV et exposer les larves à une lumière UV pendant 6 secondes à 20 mJ / cm 2 d'intensité.
- Immerger la lame dans l'eau pour flotter doucement les larves hors du scotc recto-versobande h.
- Utilisez une pince ou d'un pinceau à placer délicatement les larves irradiées dans un 15 x 45 mm un flacon en verre contenant la culture dram ~ 1,0 ml de nourriture volée où ils peuvent récupérer pour une période de temps variable (8 -24 heures) à 25 ° C ou autre température de la culture désirée avant de re-récolte pour les essais thermiques nociception.
3. Local test sonde thermique
Nous livrons un stimulus nociceptif thermique à un segment de corps de la larve individuelle à l'aide d'une sonde thermique sur mesure fabriqué par Pro-Dev génie (voir le tableau des matériaux). Bien que cette sonde possède des caractéristiques de conception optimales (une pointe en métal petite ~ 0,07 mm 2 de surface et la capacité de maintenir avec précision une température de consigne de 23 ° C à 65 ° C), en principe, n'importe quel outil avec une petite astuce qui peut être chauffée à une température définie pendant une période pouvant aller jusqu'à 20 secondes devrait suffire. La pointe de la sonde est utilisée pour stimuler début 3 ème stade larvaire précisément sur la face dorsaleligne médiane à l A4 segment abdominal (voir Figure 2). En réponse à ce stimulus thermique, les larves se présentent généralement un comportement de retrait du matériel aversif latéralement par 360 degrés ou plus. Ce comportement est distinct de leur réponse au toucher la lumière à une sonde non-nocive à température ambiante en métal ce qui implique généralement une courte pause dans leur activité locomotrice 13.
Protocole pour le dosage sonde thermique:
- Température pré-réglée de la sonde thermique pour point de consigne désiré.
- Utilisez un pinceau ou une pince doucement transférer une larve individuelle sur une plate-forme plane (nous avons l'habitude d'utiliser un petit morceau de coupe de vinyle à partir d'un liant) sur lequel les larves seront ensuite stimulé. La larve doit être couvert par une mince pellicule d'eau avant le contact avec la sonde thermique. Le film d'eau recouvrant la larve doit être aussi peu que possible et couvrir complètement la larve, tout en s'assurant que la larve n'est pas sèche lorsque vous touchez le vinyle.
- Appuyez doucement sur le bout de la sonde contre la larve au segment de A4 appliquant une légère pression avec le bout à environ un angle de 45 ° entre la sonde et la surface de la larve (voir Figure 2). La pression devrait provoquer un léger renfoncement sur la surface de la larve et sera généralement suffisante pour empêcher la locomotion. Si la larve continue à se déplacer, appliquer une pression un peu plus et il sera généralement arrêter. Ne pas enregistrer les données de larves qui se déplacent au-delà du champ de vision ou pour lesquels sonde de contact constante ne peut pas être obtenus jusqu'à ce qu'une réponse ou de coupure de 20 s.
- Continuer à stimuler la larve jusqu'à ce qu'une réponse de retrait est exposée ou jusqu'à ce que le seuil de 20 secondes est atteint, selon la première éventualité. Répondant larves généralement d'abord montrer un comportement préliminaire de soulever la tête et la queue. Ceci est généralement suivi par le comportement de retrait du matériel au moins 360 degrés. Seul un rouleau complet de 360 degrés est marqué comme un comportement nocifensive (la HEA préliminaired ou relance la queue n'est pas).
- Une fois que le comportement de retrait est amorcé le contact avec la sonde communiqué et d'enregistrer le temps de latence ou le temps de retrait. Si aucun comportement de retrait est observé dans les 20 secondes, puis la larve est un non-répondeurs. Les intervenants peuvent être divisés en 2 catégories. Si le comportement de retrait est montré dans les 5 secondes, puis la larve est un fast-répondeur. Si le comportement de retrait est indiqué entre 5-20 secondes, puis la larve est un répondeur lente (voir la figure 1 dans l'affaire Babcock, et al. 2009) 1.
4. Mondial dosage de chaleur à plaques
Le dosage de chaleur à plaques a été conçu pour mesurer la nociception thermique larves de drosophile où l'animal entier est confronté à un stimulus nociceptif thermique. Individuelle 3 ème mi stade larvaire sont placés dans une baisse de 80 pi d'eau sur un plat de 60 x 15 mm Petri - voir la figure 3 pour schéma et des photos de l'ensemble testvers le haut. La boîte de Pétri est ensuite placé sur un bloc de chauffage solide (dénommé le "plaque chauffante"). Comme la température des hausses de goutte d'eau, la larve présente une série de cinq comportements stéréotypés que nous avons appelées thrash tête, rouleau, le fouet, la saisie, et la paralysie. Comme ces comportements sont dans une certaine mesure en fonction de la température de consigne de la plaque de la chaleur et le volume d'eau dans laquelle la larve est immergé nous présentons ici ce que nous avons trouvé pour être les conditions optimales (95 ° C de chaleur à plaques, 80 pl baisse de l'eau) pour l'observation de tous les 5 des comportements avec un chevauchement minimal entre eux.
Protocole pour le dosage de chaleur à plaques:
- Positionnez les guides éclairage à fibres optiques pour assurer qu'il y ait suffisamment d'éclairage à haut contraste pour l'affichage de la larve. Utilisez une larve de test si nécessaire. La puissance doit être allumé basse pour éviter la chaleur ambiante sur la chenille à tester.
- Placez le bloc de chauffage dans la plaque de la chaleur avec une surface plane et placez la plaque de la chaleur surla base du microscope. Tournez sur la plaque chauffante à la position «HIGH», prévoir environ 15 minutes pour la température se stabilise, et ajuster en conséquence pour atteindre une température de surface de 95 ° C.
- Mesurer 80 ul d'eau distillée et placer la goutte d'eau dans le milieu de la 60 x 15 mm boîte de Pétri en polystyrène avec une micropipette.
- Utilisez une pince pour déposer délicatement un chiffon propre 3 ème mi stade larvaire dans le milieu de la goutte d'eau. Tenter de transférer la larve avec le volume minimal possible de l'eau de sorte que la goutte d'être chauffé reste aussi proche que possible de l'original 80 pl.
- Placez délicatement la boîte de Petri contenant la goutte d'eau et la larve sur le bloc de chauffage solide sur la plaque chauffante. Ajuster rapidement l'emplacement de la cuvette afin de la chenille et toute goutte d'eau sont en vue. Voir Figure 3 et vidéos 1-6.
- Démarrer le temporisateur au moment de la boîte de Petri est placé sur le bloc de chauffage solide de la plaque thermique et enregistrermoment de l'apparition de chaque comportement. Si vous le souhaitez, les comportements peuvent aussi être vidéo enregistrée - Voir Vidéos 1-5 pour des exemples représentatifs de chaque comportement. Logiciel Leica version 3.7 a été utilisé pour enregistrer les films, mode d'enregistrement était «en continu», un appareil photo 3 mégapixels de résolution a été (nous avons utilisé 0.63x zoom avec lequel la résolution de l'image calculée est de 10 um / pixel) et images / seconde s'établissait à 44,5.
5. Les résultats représentatifs
Local test de la sonde de chaleur:
En contact avec la sonde thermique, une larve montre typiquement un comportement préliminaire de la levée de sa tête et la queue. Typiquement, le soulèvement de la tête est considérée en premier, suivi par la levée de la queue. Quelques secondes après ce comportement préliminaire de la larve commence habituellement rouler latéralement que nous appelons le «comportement de retrait aversif." Le temps au bout duquel le comportement préliminaire ou le comportement de retrait est présentées peuvent varier selon la température ou gefond magnétique. Dans notre étude initiale, nous avons mesuré le pourcentage de larves présentant un retrait aversif à des températures différentes sondes de point de consigne et a constaté que 48 ° C était la plus basse température à laquelle toutes les larves ont répondu rapidement (<5 s). Ici, nous disent qu'il ya un plafond à la réponse nociception thermique des larves (figure 4A). 100% plus rapide intervenants sont observés jusqu'à une température de la sonde de 52 ° C. Cependant, à 54 ° C et plus, 90% ou plus des larves ne réagissent pas, même après 20 s de contact. Ces larves ne continuera à faire progresser la suite de la coupure de 20 s.
Comme indiqué précédemment 1, les catégories de comportement de retrait à chaque température peuvent être tracées et comparées statistiquement. Étant donné qu'il s'agit d'un test comportemental existe une certaine variabilité de la larve à la larve et entre les utilisateurs individuels. Pour tenir compte de ce que nous mesurons habituellement 3 ensembles de 30 larves par condition de test. En plus de la catégorisation simple de witemps de latence thdrawal que nous avons indiqué précédemment, nous rapportons ici que l'amplitude (nombre de rouleaux ou de temps passé dans le comportement de retrait aversif) peut également être mesurée (voir figure 4). Étonnamment, il semble y avoir une relation inverse entre la température d'entrée et de la robustesse de la réponse, parce que des températures plus basses semblent provoquer un plus grand nombre de rouleaux (figure 4B) et plus de temps passé en retrait aversif (données non présentées). Cela peut indiquer que la durée d'exposition à une température nocif peut être le principal déterminant de la robustesse.
Essai de chaleur à plaques:
Cinq comportements stéréotypés locomoteurs sont observés lors du transfert de la larve immergée dans l'eau à la plaque de la chaleur. Elles sont décrites ci-dessous et montré dans la vidéo avec le comportement typique d'une larve de locomotion non chauffé dans de l'eau. Les latences moyennes au cours de laquelle ces comportements sont observés sont présentés dans la figure 5A, comme le sont les températures moyennes mesurées goutte d'eau pour chaque temps de latence. Dans les conditions optimales de dosage présentées ici le pourcentage de larves montrant chaque comportement distinct variait de 77 à 100% (figure 5B), bien que de temps en temps les comportements de roulement et le fouet sont omis, le chevauchement, ou se produire dans l'ordre inverse. Les comportements observés, dans l'ordre chronologique, sont décrites comme suit, et peut être regardé dans la vidéo aux heures indiquées ci-dessous:
- Mouvement normal en l'absence de la chaleur: la locomotion péristaltique accompagnée par la recherche des mouvements de tête. Voir la vidéo de 6:27.
- Thrash chef: se déplace la tête de Larve rapidement dans un mouvement vers l'avant ou latérale. Ce mouvement est similaire à leur locomotion normale dans l'eau (voir vidéo 1), mais se produit plus par à-coups et de façon persistante. Voir la vidéo de 6:40.
- Rouleau: Larve roule latéralement au moins à 360 °. Voir la vidéo de 6:50. Cela peut se produireun nombre variable de fois et se traduit parfois par des rouleaux incomplètes. Pour les fins du codage du comportement nous ne comptons pleins rouleaux à 360 °. Ce comportement est le plus similaire à celle observée avec l'application locale de la sonde thermique.
- Fouet: Larve expositions rapides de contraction de libération des mouvements le long de l'axe antéro-postérieur qui apportent la tête très brièvement à proximité de la queue. Voir la vidéo de 7:11. Correction est souvent observée dans la succession rapide ou dans le même temps que le laminage.
- Saisie: Larve s'étend le long de l'axe antéro-postérieur et présente une fréquence élevée de tout le corps en secouant le comportement sans se plier. Voir la vidéo de 7:25.
- Paralysie: Larve cesse le mouvement. Dans certaines larves de cette est permanente tandis que d'autres présentent alors un mouvement de basse fréquence de pulsation. Voir la vidéo de 7:36.
Ces données suggèrent que la température de la goutte d'eau et de la latence d'apparition du char cinqcomportements observés sur ristique réchauffement de la planète de la chute de la larve / eau sont fortement corrélés.
Figure 1. Aperçu des étapes expérimentales pour la préparation et le dosage des larves. Avant de doser la nociception avec la sonde thermique ou la chaleur à plaques, les larves provenant d'un stock particulier ou croisement génétique sont récoltés et nettoyés de la nourriture. Si la sensibilisation nociceptive (par opposition à la nociception de base) doit être évaluée, la récolte est suivie par éthérisation (exposition à l'éther), le montage, l'irradiation UV, et une période de récupération sur les denrées alimentaires à la mouche. Larves récoltés ou récupérés sont ensuite soumis à des températures d'essai nocives en utilisant soit la sonde thermique (local) ou la plaque chauffante (global) du test. Les chiffres renvoient aux sections du texte qui décrivent les méthodes de l'étape (s) affichés.
Figure 2. Expérimental mis en place pour le dosage de la chaleur à sonde locale. La sonde de chaleur est contrôlée par une unité de commande thermique qui est utilisée pour régler et maintenir la température de la sonde. La sonde est maintenue perpendiculaire à l'axe antéro-postérieur et utilisé pour stimuler la larve à un angle de 45 ° à l'horizontale. Sonde de contact est faite spécifiquement au A4 segment abdominal, comme indiqué. L'utilisateur doit maintenir ce contact avec une légère pression jusqu'à ce que le seuil de 20 secondes ou jusqu'à ce que le comportement de roulement commence. Si la température est perçue comme nuisible, la larve se montrent un comportement de retrait aversif caractérisé par au moins un rouleau 360 °. Le nombre de rouleaux peut être unique ou multiple (voir la figure 4B).
Figure 3. Expérimentale mis en place pour le dosage de chaleur à plaques. (A) Caricature d'un point de vue horizontal de la 60 x 15 mm plat de Petri contenant un milieu de 3 èmelarve étoiles à une goutte d'eau ul 80. (B) de dessin animé d'une vue de dessus de la chenille placé au milieu de la goutte d'eau telle que vue à travers le microscope. (C) Photographie d'un point de vue horizontal de la station de travail pour cet essai. (D) Photographie de la larve comme on le voit à travers le microscope.
Figure 4. Quantification de la réponse comportementale à l'aide du test sonde thermique. (A) Représentation graphique de la pour cent des répondants appartenant à chaque catégorie (rapide, lente, et les non-répondeurs) fonction de la température. (B) Représentation graphique de la latence à un comportement de retrait par rapport aversif le nombre de rouleaux chaque larve exposées à quatre différentes températures d'essai de nocivité augmente (42 ° C, 44 ° C, 46 ° C, 48 ° C, 50 ° C, et 52 ° C).
Figure 5. Dosage de chaleur à plaques: temps de latence et de la température par rapport à BehAvior. (A) de la latence et la température moyenne goutte d'eau à chaque réponse comportementale dans les conditions optimales de 95 ° C (température de surface de la plaque chaude) et 80 pi d'eau baisse (n = 150). Notez que chaque comportement est observé dans un intervalle de temps particulier. Les températures chutent eau ont été mesurés à l'aide d'un thermocouple inséré dans la partie supérieure ou inférieure de la goutte (n = 10 gouttes pour chaque emplacement) et ces mesures ont été en moyenne. (B) Pourcentage de larves présentant chaque réaction comportementale dans des conditions optimales de dosage. Se débattant, la saisie, et la paralysie sont observées de près de 100% du temps en roulant et le fouet sont observées 77 et 80% du temps, respectivement. À la surface de jeu inférieure saisie des points de température et de la paralysie ne sont pas observées à moins de 200 s et à des points de consigne supérieur de roulement et le fouet peut être ignorée ou peut se produire simultanément. n = 150. (C) Pourcentage de larves qui survivent après l'initiation du comportement paralysie. Les larves ont été chauffés jusqu'à ce que soitla paralysie de l'égrenage et ensuite retiré pour des conditions de culture standard pour récupérer. Mock-traité les larves ont reçu un traitement équivalent, sauf pour l'exposition de la chaleur. Formation des adultes pupes et viable ont été quantifiés les jours 7-13. n = 120.
Figure 6. L'inactivation de larves nociceptives des neurones sensoriels augmente les latences de réponse de comportement. Terrain de la latence à chaque comportement pour les génotypes indiqués: w 1118, Gal4 109 (2) 80 = md-Gal4 / +, UAS-Ork1.Δ-C / +, UAS-Ork1.Δ-NC / +, md- Gal4/UAS-Ork1.Δ-C, et md-Gal4/UAS-Ork1.Δ-NC. md-Gal4 expression disques de HES régulés transgènes dans les quatre classes de multidendritic périphériques neurones sensoriels; UAS-Ork1.Δ-C 14 exprime une version modifiée de la drosophile ouverte redresseur canal K + pour la transmission synaptique requis, et U AS-Ork1.Δ-NC 14 exprime en outre une version modifiée de ce même canal qui n'interfère pas avec la transmission synaptique. Notez que seules les larves portant à la fois le driver md-Gal4 6 et les transgènes UAS-Ork1.Δ-C montrent latences accrues pour quatre des cinq comportements observés (thrash, rouleau, à la saisie, et la paralysie). Notez également qu'en raison de la latence accrue au roulement de ces animaux fouet avant qu'ils roulent. Astérisque indique p <0,05 par t de Student-test. n = 30 larves par génotype.
Vidéo supplémentaire 1. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
Vidéo supplémentaire 2. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
Vidéo supplémentaire 3."Target =" _blank "> Cliquez ici pour visionner la vidéo.
Vidéo supplémentaire 4. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
Vidéo supplémentaire 5. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
Vidéo supplémentaire 6. Cliquez ici pour visionner la vidéo .
Discussion
Les tests décrits ici peuvent être utilisés pour évaluer qualitativement et quantitativement les larves de différents génotypes de la réactivité aux stimuli nocifs thermiques. Une caractéristique principale de l'essai sonde thermique, c'est que le stimulus est donnée uniquement à un seul locus. Cela conduit sans doute à des tirs de seulement un petit sous-ensemble de la classe IV des neurones les plus dans le segment contactés par la sonde et peut-être ceux immédiatement les segments adjacents 11. En raison de la stimulation locale, le dosage sonde thermique imite l'expérience sensoriel commun de détection d'un stimulus nociceptif qui est localisée à un organe particulier la région comme une main en contact d'un poêle chaud. Un inconvénient de l'essai sonde thermique, c'est qu'il a une certaine variabilité d'utilisateur à utilisateur qui peut probablement être attribuée à trois facteurs: i) la pression avec laquelle l'utilisateur applique la sonde à la larve, ii) l'emplacement précis de la sonde sur la chenille par rapport aux neurones sous-jacentes nociceptives, et iii) l'précise angle auquel la sonde en contact avec la surface de la chenille.
Nous avons précédemment fait état d'une stratégie quantitative des larves dans les catégories des non-répondeurs, répondeurs lents, et les intervenants rapides en fonction de leur temps de latence de retrait à une température donnée 1. Ici, nous rapportons sur la réactivité des larves à des températures encore plus élevées. Fait intéressant, nous trouvons qu'il ya un plafond pour les larves thermiques réponses nociceptives et que ce plafond se situe entre 52 et 54 ° C. Cela peut indiquer que les larves ne possèdent pas un potentiel récepteur transitoire (TRP) canal capable de déclenchement à des températures supérieures à 52 ° C. Alternativement, il pourrait suggérer que les neurones ou les muscles utilisés pour initier ou mener à bien la réponse du moteur est endommagé avant même de pouvoir fonctionner en retrait aversif. Groupe présente également une analyse différente de l'amplitude du retrait de réponse en utilisant-soit le nombre de rouleaux en tant qu'indicateur de la "robustesse" de la réponse. Naïvement, ons'attendrait à ce que ces paramètres augmentent avec la température augmente ou moment de la stimulation. Étonnamment, nous constatons que ce n'est pas le cas. Les larves stimulé pendant une longue période à une température à l'extrémité inférieure de la fourchette nocive (42 ° C) montrent plus de rouleaux et de passer plus de temps que les larves de roulement sondé à des températures élevées (48-52 ° C). Cela donne à penser que, dans la fenêtre de température nocive c'est surtout la durée de l'exposition qui détermine l'amplitude de la réponse. Depuis que les larves exposées à des températures très nocives (48-52 ° C) de répondre, en moyenne, très rapidement, ils ne présentent pas sous forme de rouleaux plus grand nombre de larves exposées à une température moins nocive pour une plus longue période de temps. L'analyse de l'amplitude de réponse rapportés ici ajoute une autre dimension quantitative le long de laquelle différents génotypes ou des manipulations de l'environnement peuvent être comparés.
Une caractéristique principale de l'essai de chaleur à plaques est qu'il s'agit d'une exposition globale à l'nocivesthermique. En tant que tel, il s'apparente davantage à l'animal assis dans un chaudron de chauffage que de toucher un poêle chaud. Même s'il n'est pas clair quand une larve peut vivre un stimulus nocif au niveau mondial à l'état sauvage, dans le labo, les réponses comportementales à cette exposition globale sont plus complexes que ceux observés lors d'une stimulation locale. Un des points forts de l'essai de chaleur à plaques, a également noté par d'autres 3, c'est qu'il a peu d'utilisateur à utilisateur la variabilité, car tout contact de la larve n'est pas une composante du protocole. L'écart ne semble être importante dans la définition de chaque comportement quand commence et cela peut être minimisé avec visualisation répétée / familiarité. Une différence intéressante entre les tests est la température à laquelle les comportements d'évitement commencer. Ce sont beaucoup plus faibles dans l'essai de chaleur à plaques de la sonde thermique. Le comportement préliminaire présenté par les larves en contact avec la sonde thermique (tête et queue relance) peut être un corrélat de la tête de thrash observée à ~ 27 ° C dans le plat de la chaleure dosage. Il est possible que cette réponse reflète «malaise» plus que «la douleur». Nous n'avons pas observé une corrélation entre la flagellation, la saisie, et la paralysie, même à doses élevées (jusqu'à 48 ° C) la température dans le dosage de la sonde thermique et il se peut que d'une masse critique de neurone sensoriel de tir de plus d'une région du corps est nécessaires pour mettre sur ces comportements. Fait intéressant, les comportements de saisie et de la paralysie sont observées à des températures (~ 34 à 37 ° C) ci-dessous l'extrémité inférieure du seuil nociceptif observé avec la sonde thermique indiquant que la stimulation globale peut impliquer sommation des réponses neuronales qui sont insuffisantes pour déclencher un comportement avec les autorités locales application de la sonde thermique. Que ces températures sont effectivement perçu comme nocif pour les larves est soutenue par l'observation que les larves qui commencent le comportement paralysie et sont ensuite autorisés à récupérer la nourriture volée ne pas survivre à la plupart des cas (figure 5C). En outre soutenir l'argument selon lequel la chaleur pldosage est mangé lire les réponses nociceptives est le fait que le blocage de la transmission synaptique dans les neurones sensoriels nociceptifs connus augmente la latence de la plupart des comportements observés (Figure 6). L'observation selon laquelle il n'y a pas augmentation de la latence pour le comportement à plus haute température à fouetter suggère que d'autres neurones sensoriels qui n'expriment pas md-Gal4 peut être nécessaire pour ce comportement.
En somme, les deux tests implique d'exposer une larve individu à un stimulus nociceptif thermique de la température définie - la pointe chaude d'une petite sonde métallique dans le dosage locale et l'immersion dans une goutte de rapidement chauffer l'eau dans le dosage global. Les réponses comportementales de larves de drosophile de divers horizons génétiques et / ou exposés à des conditions environnementales variables (par exemple plus ou moins des dommages aux tissus), peuvent être étudiés et quantifiés à l'aide de ces tests. En fin de compte, les résultats de ces essais nous aideront à mieux comprendre les réseaux génétiques qui contrôlent la CNPiception chez la drosophile et d'autres espèces apparentées.
Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Nous remercions Christian Landry pour réchauffage de la sonde de conception, Daniel Babcock pour le développement du dosage de la chaleur des larves de la sonde, Sean Sweeney pour suggérer le dosage de chaleur à plaques, la drosophile Bloomington Stock Center pour les stocks de mouches, et Galko membres du laboratoire pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH R01 NS069828 à MJG et une NIH MARC U-STAR de subventions de formation (T34GM079088 à l'Université de Houston-Downtown Scholars Academy) pour l'accès des minorités à des carrières de recherche (AVG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| 1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
| 10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
| Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
| Microcentrifuge tube | Denville Scientific | C-2170 |
References
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).
- Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae. Fly (Austin). 5, 17810 (2011).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
- Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology. Science. 297, 1355-1358 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
- Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field. J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).
- Woolf, C. J., Ma, Q.
- Hwang, R. Y. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).
- Xiang, Y. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis. Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12, 1195-1206 (1994).
- Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell. 109, 485-495 (2002).
