Summary
Die ECIS / Taxis-System ist ein automatisiertes Echtzeit-Assay misst die zelluläre Chemotaxis. In diesem Assay verschieben Zellen unter einer Schicht aus Agarose auf ein Ziel Elektrode ankommt. Zelluläre Bewegung wird durch das Einsetzen des Widerstands in Wechselstrom 0 gemessen.
Abstract
Zelluläre Bewegung in Reaktion auf externe Stimuli ist von grundlegender Bedeutung für viele zelluläre Prozesse einschließlich Wundheilung, Entzündung und der Reaktion auf eine Infektion. Eine übliche Methode zur Chemotaxis messen, ist die Boyden-Kammer, in die Zellen und für chemische Lockstoffe durch eine poröse Membran getrennt sind. Wenn Zellen durch die Membran in Richtung der Lockstoff migrieren, sie an der Unterseite der Membran, oder fallen in die darunter liegenden Media zu halten, und anschließend gefärbt und visuell gezählt 1. Bei diesem Verfahren werden die Zellen in einem steilen Gradienten und vorübergehend für chemische Lockstoffe, die vermutlich eine schlechte Darstellung von Gradienten in Geweben 2 fanden sein ausgesetzt ist.
Ein weiterer Assay-System, das unter Agarose-Chemotaxis-Assay, 3, 4 Maßnahmen Zellbewegung über ein festes Substrat in einem dünnen flüssigen Film, der unter dem Agarose-Schicht bildet. Die Steigung, die in der Agarose entwickelt ist flach und wird gedacht, um eine App seinlich und sinnvoll Darstellung von natürlich vorkommenden Steigungen. Chemotaxis kann durch mikroskopische Abbildung der Strecke ausgewertet werden. Sowohl der Boyden-Kammer Assay und der unter-Agarose-Assay werden meist als Endpunkt-Assays konfiguriert.
Die automatisierte ECIS / Taxis System kombiniert die unter-Agarose-Ansatz mit Elektro-Zell-Substrat-Impedanzabtastung (ECIS) 5, 6. In diesem Assay werden Ziel-Elektroden in jeder von 8 Kammern. Eine große Gegenelektrode fließt durch jeden der 8 Kammern (2). Jede Kammer ist mit Agarose gefüllt und zwei kleine Vertiefungen sind die Senkung der Agarose auf beiden Seiten der Zielelektrode. Eine Vertiefung wird mit dem Test-Zellpopulation gefüllt, während die andere enthält die Quellen des Diffundierens chemoattraktive (Abbildung 3). Der Strom durch das System geleitet werden verwendet, um die Änderung des Widerstands, die als Zellen über die Zielelektrode übergeben tritt zu bestimmen. Die Zellen auf dem Ziel electrode um den Widerstand des Systems 6. Darüber hinaus vertreten schnellen Schwankungen im Widerstand Änderungen bei den Wechselwirkungen von Zellen mit der Elektrodenoberfläche und deuten auf anhaltende zelluläre Form ändert. Die ECIS / Taxis kann messen Bewegung des Zellpopulation in Echtzeit über längere Zeit, sondern auch empfindlich genug, um die Ankunft einer einzelnen Zelle in der Target-Elektrode zu erfassen.
Dictyostelium discoidium ist bekannt, dass in der Gegenwart eines Folat-Gradienten 7, 8 und die chemotaktische Reaktion lässt sich durch ECIS / Taxis 9 gemessen werden migrieren. Leukozyten Chemotaxis, als Reaktion auf SDF1α und Chemotaxis-Antagonisten können auch mit ECIS / Taxis 10, 11 gemessen. Ein Beispiel für die Leukozyten Reaktion auf SDF1α ist in 1 gezeigt.
Protocol
1. ECIS / Taxis Vorbereitung der Elektrode
- Die Goldoberfläche der ECIS / Taxis Elektrodenanordnung (bestehend aus 8 Kammern pro Folie) wird zuerst durch die Vorbehandlung mit sterilem 10 mM Cystein in entionisiertem Wasser (dH 2 O) 15 min bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen stabilisiert.
- Saugen Sie die Cystein-Lösung von jeder Elektrode Kammer, spülen Sie 3-mal mit sterilem dH 2 O, und ersetzen mit 250 ul Vollmedium (RPMI 1640, 10% FBS, 25 mM HEPES-Puffer).
- Verbinden Sie die Elektroden-Array zu Array Instrument Pins auf Inhaber zu kontaktieren, um Elektrode Prüfung durchzuführen.
- Chambers, die richtig angeschlossen sind, werden in grün auf dem Bildschirm hervorgehoben werden. Wenn die Kammern in rot hervorgehoben werden, sind sie nicht verbunden ist und die Elektrode in der Anordnung Halterung neu positioniert werden, um Kontakte für alle Kammern zu schaffen.
- Nachdem alle Kammern verbunden sind, auf dem "Check"-Button in der Software-Controller zur Abschreckungabzubauen des anfänglichen Widerstands und Kapazitätswerte für jede Kammer. Die Widerstandswerte sollten zwischen 1600 und 2000 Ohm sein, und Kapazitätswerte sollte zwischen 5 und 6 Nanofarad für eine 8-Kammer-Array sein. Wenn eine Kammer ist nicht akzeptabel innerhalb dieser Parameter sollte die einzelne Kammer nicht verwendet werden, um Daten zu sammeln.
- Trennen Sie die Elektrode aus Array Halter, um die einzelnen Kammern Agarose vorzubereiten. Aspirieren Medium aus den Kammern und waschen jeder Kammer 3 mal mit sterilem dH 2 O.
2. Vorbereiten Agarose Chambers
- In einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen aus Polypropylen, fügen Maßnahme 0,03 g Seakem GTG Agarose und 1 ml steriler PBS. Ersetzen Tubenkappe locker, und schmelzen die Agarose in Autoklaven für 2 min Flüssigkeit Zyklus (Schmelzen in einer Mikrowelle ist nicht für diesen Assay wirksam). Diese kurze Zeit nicht schmelzen wird das konische Rohr. Für weniger anspruchsvolle Zellen, die keine Serum für Kultur, (zB Dictyostelium discoideum) 0,5%Agarose kann im entsprechenden Medium hergestellt werden und in der Mikrowelle geschmolzen. Der Autoklav wird, die für Zellen, die Serum erforderlich, da dies denaturiert, wenn in der Mikrowelle geschmolzen werden.
- 5 ml vollständigem RPMI-Medium in einem Wasserbad erwärmt (55 ° -60 ° C) direkt an der heißen Agarose, bis zu einer Endkonzentration von 0,5% Agarose und Pipette nach oben und unten vorsichtig mischen.
- Jeweils 300 pl geschmolzener Agarose Medium in jede Kammer, ersetzen Sie die ECIS / Taxis Array Deckel und lassen Sie Gel bei Raumtemperatur.
- Pipettieren verbleibenden Agarose in die Kappe von 15 ml Tube zu Agarose Gelieren zu beurteilen. Dieses überschüssige Agarose wird auch in Teil 4 verwendet werden: Schneiden Brunnen in Agarose.
3. Der Bau und die Schärfung der Kanüle Nun Cutting Tool
- Schärfen zwei 14 Gauge Kanüle stumpfes Ende, mit einem 5/64 "-Bit. Drehen der Spitze des Bohrers in jedem Kanülenöffnung mit einer langsamen Geschwindigkeit bohren, dass bestimmte der Bohrer schneidet gesamten Innenkante jeder Kanüle opkung auf eine scharfe Schneidkante (Abbildung 4A) zu bilden.
- Bohren Sie zwei Löcher, durch ein "x 2" x ¼ "Plexiglas (4B-D) mit einem 5/64" Bit in einer Bohrmaschine. Legen Sie jede geschärft 14-Gauge-Kanüle so dass es einen gleichen Abstand durch jede Plexiglas Loch ragt.
4. Schneiden Wells in Agarose
- Sterilisieren Sie die 14-Gauge-Kanüle durch leichtes flammenden die Tipps. Vor dem Schneiden Vertiefungen in der Kammer ECIS, ermöglichen die Kanülen auf Raumtemperatur abkühlen, oder Kühlen des Kanülen durch Berühren des Agarose in der Kappe des 15 ml-Röhrchen. Wenn die Temperatur der Kanüle zu hoch ist, wird die Agarose zu schmelzen als die Kammer Vertiefungen geschnitten werden, wodurch die Vertiefungen verformt und beschädigt.
- Richten Sie die Kanüle Paar oberhalb der beiden Gold-Punkte rund um die Ziel-Elektrode in jeder Kammer (Abbildung 2c und 5). Legen Sie die Kanüle senkrecht, ohne horizontale Bewegung, Anhalten auf sanfte Berührung zwischen der Kanüle unddie Elektrodenoberfläche. Entfernen Sie vorsichtig die Kanüle wieder ohne horizontale Bewegung. Platzierung von zusätzlichen Bohrungen für den Widerstand gegen Gradienten ist auch eine Umgestaltung der Kanüle jig möglich.
- Vorsichtig absaugen der Agarose-Stecker von der Kanüle verließ, mit einem sterilen 9 "Pasteurpipette, verbunden mit geringen Unterdruck, mit einem Staubsauger zu fangen Agarose Abfall.
- Dann werden 300 ul vollständigem RPMI Medium auf die Oberfläche jeder Kammer bei 37 ° C, 2 min, um die Agarose zu sättigen, und dann sanft Absaugen der Medien von der Oberfläche und den Vertiefungen ohne die Agarose.
5. Das Laden des Wells
- Jedes der gut ist fähig, ein Volumen von 7 pl. Um ein gut in jeder Kammer werden 7 ul Zellen Suspension. Für Jurkat T-Zellen, verwenden Sie 2 x 10 7 Zellen / ml. Diese Zellen werden bis 7 ul 200 ng / ml SDF-1α nicht vollständig RPMI verdünnt, die Serum fehlt reagieren. Nur mit kompletter Medien allein als eine negative control.
- Nachdem die Brunnen geladen werden, sehen jede Kammer des Arrays mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, daß alle Vertiefungen geschnitten wurden und richtig ausgefüllt. Die Zellen sollten in innerhalb der Grenzen des Brunnens Grenze. Wenn sie in beiden Brunnen zu sehen sind, oder sind darüber hinaus auch Grenzstreuen Zelle, dann eine Lücke unter dem Agarose gebildet. Beachten Sie die falsch eingerichtet Brunnen, da die Daten nicht zuverlässig von den Kammern zu interpretieren.
6. Data Collection
- Legen Sie die Elektrode in der Anordnung Halter und wieder anschließen, die Gold-Pads auf der Elektroden-Array auf die federbelastete Pogostiften des Inhabers und klicken Sie auf "Setup". Die Brunnen, die richtig angeschlossen sind, werden grün markiert werden. Wenn die Vertiefungen rot sind, sind sie nicht miteinander verbunden und die Elektrode in der Anordnung Halter positioniert werden.
- Wählen Sie "8WE1" (8 und 1 Elektrode) aus dem Dropdown-Menü in der Software-Bedienfeld, um die Array-Konfiguration angeben.
- Wählen Sie "Check" in der Software control-Panel, um die anfängliche Widerstand und Kapazität für jeden gut zu bestimmen. Die Widerstandswerte sollte zwischen 1600 und 2000 Ohm betragen, während die Kapazitätswerte zwischen 5 und 6 Nanofarad sein sollte.
- Wählen Sie mehrere Frequenzen, um Widerstand bei mehreren Frequenzen zu messen. Es gibt eine Auswahl von Customizing-Frequenzen, oder mit einem Satz von empfohlenen Frequenzen. Die Standard-Einstellungen mit mehreren Frequenzen Erwerb erfassen Daten mit 11 voreingestellten Frequenzen (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 und 64.000 Hz) bei einer Rate von 8 Wells / min. Das Zeitintervall zwischen den Messungen können auch angepasst werden. Sammeln von Daten mit mehreren Frequenzen erlaubt die Analyse der Kapazität, Impedanz und Widerstand. Sammeln Widerstandswerte bei 4.000 Hz reicht meist für Säugetierzellen Chemotaxisstudien, aber die zusätzlichen Frequenzen können Informationen in anderen Zusammenhängen 12,13 liefern.
- Insgesamt Experiment Dauer eingestellt werden, auf der rechtenPanel, oder das Experiment kann manuell gestoppt werden, indem Sie auf "Fertigstellen", um Zellen Widerstand auf, die von der Ankunft an der Elektrode sind produziert haben. Die Zeit, die für die Zelle auf der Elektrode ankommt, ist abhängig von dem Zelltyp verwendet.
- Klicken Sie auf "Start" um die Datenerfassung zu starten.
7. Data Management
- Obwohl die Daten nach Excel exportiert werden können, ist die ECIS 1600R-Software, die das System ECISθ begleitet die effizienteste Methode, um ECIS / Taxis Daten zu analysieren.
- Die Software-Daten-Analyse-Tool-Bar enthält die Radio-Buttons Z, R und C. Diese bestimmen, ob Impedanz, Widerstand, Kapazität oder jeweils auf der vertikalen Achse gegen die x-Achse (verstrichene Zeit) aufgetragen ist.
- ECIS / Taxis Daten erfolgt am effektivsten als Widerstand im Laufe der Zeit bei 4.000 Hz angezeigt. Raschen Schwankungen im Widerstand oder microtransients (1), belegen zelluläre Bewegung über die Elektrode. Kompilieren, or Binning die Datenpunkte, so dass nicht alle Punkte grafisch dargestellt werden, ist nicht für die ECIS / Taxis zu empfehlen, da wird es durchschnittlich microtransients aus den Daten.
- Nachdem die Grafik wurde mit dem Software ECIS1600R gemacht worden, kann er durch Auswahl von "Export Graph" aus dem Menü Datei gespeichert und als. Tif oder. Jpg-Datei exportiert werden.
8. Repräsentative Ergebnisse
Zelluläre Chemotaxis wird durch eine Erhöhung des Widerstands bei 4.000 Hz angegeben. Die Ankunft der Zellen von der Zielelektrode wird auch durch das Auftreten des raschen Schwankungen im Widerstand als microtransients oder Bewegungsanalyse nach Opp et beschrieben angegeben. al., 2009 (1) 14. Ein negatives Ergebnis wird durch konsequente angegeben, oder eine leichte Abnahme im Widerstand bei 4000 Hz, in Rot in 1 zu sehen. Das Fehlen von microtransients ist auch ein Zeichen von fehlender Bewegung der Zellen auf der Elektrode. Die Zunahme des Widerstandes ist direkt proportionalproportional zur Anzahl der Zellen, die die Elektrode 10 zu überqueren. Die Zugabe des monoklonalen Antikörpers spezifisch für eine chemische Lockstoffe oder Toxine bekannt, mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren zu blockieren stören können Chemotaxis 11.
Abbildung 1. Chemotaxis von humanen Jurkat T-Zellen in Reaktion auf SDF1α. Humane Jurkat T-Zellen (2.0x10 6 Zellen / ml) wurden in einem Gradienten von SDF-1α ausgesetzt (Ausgangskonzentration 100 ng / ml) oder RPMI 1640 als negative Kontrolle. Die normierte Widerstand bei 4000 Hz wurde graphisch dargestellt. Humane Jurkat T-Zellen bewegt in Reaktion auf SDF-1α, wie durch die Zunahme des Widerstandes und microtransients nachgewiesen, während keine Bewegung mit der Exposition gegenüber RPMI 1640 zu sehen war.
Abbildung 2. Draufsicht auf einen ECIS / Taxis Elektrode without Agarose. Jeder ECIS / Taxis Elektrode besteht aus 8 einzelnen Kammern bestehen. Jede Kammer teilt eine große Elektrode (a), und enthält einen einzelnen Zielelektrode (b). Jede Kammer hat auch 2 Gold Kreise (c), die als Leitfaden verwendet werden, wenn das Schneiden der Brunnen in der Agarose mit der Kanülen. Die Gold-Quadrate (d) sind die Kontaktflächen, die zu den Pogo-Stifte verbinden, um den Wechselstrom an die Elektrode angewendet. Die einzelnen Ziel-Elektroden sind jeweils in der Schaltung mit größeren Gegenelektrode (e).
Abbildung 3. Zwei Vertiefungen werden in jede Agarose-gefüllte Kammer geschnitten. Wenn die chemische Lockstoffe einem zugegeben und es einen Gradienten in der Agarose zu schaffen, mit der höchsten Konzentration der chemoattract am nächsten zu der Lockstoff auch diffundiert. Die Zellen reisen unter der Agarose zu höheren Konzentrationen von Lockstoff und übergehen kann die Ziel-Elektrode. Alsdie Zellen kreuzen die Zielelektrode, wird eine Erhöhung des Widerstands der ECIS 1600R Software aufgezeichnet.
Abbildung 4. Insertion von zwei 14-Gauge-Kanüle in Plexiglas. A) A 5/64 "Bohrer wird verwendet, um die Kanülenspitze zu schärfen. B) Zwei Löcher müssen in Plexiglas gebohrt werden, um das 14-Gauge-Kanüle nach dem Schuss Layout unterzubringen. C) Verwenden Sie eine Bohrmaschine, um die Löcher zu gewährleisten sind senkrecht zum pleixglass Oberfläche. D) zwei geschliffenen Kanülen werden über ¼ "Plexiglas, 2 mm voneinander entfernt (gemessen vom inneren Kanten) eingefügt. Diese Kanülen geschärft werden vorsichtig in Agarose eingesetzt, um die Brunnen zu schneiden.
Abbildung 5. Ausrichten von Kanülen mit goldenen Punkten in ECIS / Taxis Kammer. Zum Brunnen ausfallen, muss das geschärfte Kanülenmit den flankierenden Goldpunkten das Ziel Elektrode an der Unterseite des ECIS / Taxis Kammer ausgerichtet werden. Die Kanülen sollten vertikal eingesetzt werden, ohne horizontale Bewegung, und entfernt in der gleichen Weise.
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Discussion
Neuartige Merkmale des ECIS / Taxis Assay in seiner Fähigkeit, die Sammlung von Daten in Echtzeit zu automatisieren, wenn die Zellen für chemische Lockstoffe reagieren. Während die banalsten Anwendung dieser Technologie ist es, zelluläre Antworten auf individuelle chemotaktischen Gradienten zu messen, oder an Steigungen von Mischungen von Chemotaxis Agonisten und-Antagonisten umfasst, ist die ECIS / Taxis Ansatz auch zugänglich für Abweichungen von diesen Konfigurationen, die sehr hilfreich sein in der EU noch Beurteilung der zellulären Reaktionsfähigkeit. Es gibt gute Belege, dass sich überschneidende oder sequentielle Gradienten können zelluläre Verhaltensweisen auf neuartige Weise zu beeinflussen. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass diese komplexeren Gradienten die Norm in situ 12, 13 sind.
Die ECIS / Taxis Assay kann Modellierung dieser verschiedenen Konfigurationen Gradienten in einer Weise, die nicht mit anderen Technologien möglich zu ermöglichen. Zum Beispiel, indem zusätzliche Vertiefungen, kann man verteilen die Ausrichtung der gStrahlungsenergie (en) in Bezug auf die Zelle gut und Zielelektrode. Es ist auch möglich, den Test zu konfigurieren, um Zellen in einer der Vertiefungen als Quelle von chemotaktischen Faktoren zu platzieren.
Beim Einrichten des Tests ist es wichtig, eine vollständige Hydratation des Gels, der das Ziel und Gegenelektroden in jeder Kammer überlagert zu halten und um Vertiefungen, die die korrekte räumliche Beziehung zu der Targetelektrode aufzuweisen. Darüber hinaus ist die Unterseite der Zelle muss auch angrenzend an dem dünnen Film aus Flüssigkeit, die unter dem Agarose-Schicht bildet, es ist in diesem Film, dass die Zellen in Reaktion auf die darüber liegenden Gradienten bewegen. Um dies zu tun, muss man alle von der Agarose-Stecker ohne Gelfragmente hinter absaugen. Die Entfernung des Agarosepfropfen Schnitt durch die Kanüle einen Tunnel zwischen den zwei Vertiefungen, die die Wirkung der Verformung des Gradienten und man die Zellen frei bewegen sich über den Ziel-Elektrode. Entscheidend ist, dass der Unterdruck auf ASP verwendetwütend das Gel Plug niedrig ist, um zu vermeiden, Kompromisse bei der Agarose und Integrität.
Wir haben herausgefunden, dass Variationen in der Prozentsatz der Agarose in dem Gel können Zellen, die Zytoskelett-Fehler Ausdruck von Wildtyp-Zellen, was darauf hindeutet, dass diese Manipulation verwendet werden, um die Kräfte, die Zellen auf ihre Umgebung ausüben kann abzufragen unterscheiden. Wenn das Gel trocknet während der Kultur, werden Änderungen auftreten, beeinflussen die experimentellen Ergebnisse, einschließlich einer relativen Zunahme der Steifigkeit, die Gel-Bewegung der Zellen und eine Zunahme der Konzentration an gelösten Stoffen, die insgesamt Netzimpedanz verringern würde verlangsamen würde.
Der Assay ist kompatibel mit der Messung der Bewegung von Leukozyten und anderen Zelltypen, in denen nicht Stromfluss durch die Zellkörper. Dies ist nicht eine universelle Eigenschaft der Zellen: Nervenzellen und einige Epithelzellen (zum Beispiel) konnte durch die Zelle übertragen Körper aktuellen und hätte damit weit geringeren Widerstand wertvollees pro Einzelzelle.
Während diese Ansätze spezifisch definiert die zellulären Reaktionen auf chemotaktische Gradienten zu erfassen, ist es einfach, die Assay, wie in ähnlicher Weise auf Studien mit Metastasierung und die extrazelluläre Signale, die metastatischen Zellbewegung erweitern vorstellen. Darüber hinaus gibt es zusätzliche Array-Konfigurationen, die in anderen Zell-Substrat-Wechselwirkung Studien verwendet werden können.
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Disclosures
Ein Knecht David und Michael A Lynes haben eine erteilte Patent für die ECIS / Taxis-Technologie, die wie von der University of Connecticut zu Applied Biophysics, Inc. lizenziert worden
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health (ES07408 und EB00208) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
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