Summary
Den ECIS / Taxis system er en automatisert, real-time metode som måler mobilnettet chemotaxis. I denne analysen, celler flytte under et lag av agarose å komme fram til et mål elektrode. Cellular bevegelse måles ved utbruddet av motstand mot vekselstrøm 0.
Abstract
Cellular bevegelse i respons til ytre stimuli er grunnleggende for mange cellulære prosesser inkludert sårtilheling, betennelser og responsen på infeksjon. En vanlig metode for å måle chemotaxis er Boyden kammeret analysen, der celler og chemoattractant er atskilt med en porøs membran. Som cellene vandrer gjennom membranen mot chemoattractant, overholde de til undersiden av membranen, eller falle inn i de underliggende media, og blir deretter farges og visuelt telles en. I denne metoden, er celler utsatt for en bratt og forbigående chemoattractant gradient, som antas å være en dårlig representasjon av gradienter i vev 2.
En annen assay system, under agarose chemotaxis analysen, 3, 4 tiltak celle bevegelse over et solid underlag i en tynn vandig film som danner under agarose laget. Stigningen som utvikler i agarose er grunne og er tenkt å være en appropriate representasjon av naturlig forekommende gradienter. Chemotaxis kan evalueres ved mikroskopisk avbildning av distanse. Både Boyden kammeret analysen og under agarose analysen er vanligvis konfigurert som endepunkt analyser.
Den automatiserte ECIS / Taxis system kombinerer under agarose tilnærming med Electric Cell-substrat impedans Sensing (ECIS) 5, 6. I denne analysen, er målet elektroder plassert i hver av 8 kamre. En stor counter-elektrode går gjennom hver av de 8 Chambers (figur 2). Hvert kammer er fylt med agarose og to små brønner er kutt i agarose på hver side av målet elektroden. En brønn er fylt med testen cellen befolkningen, mens den andre holder kildene spre chemoattractant (figur 3). Gjeldende passerte gjennom systemet kan brukes til å bestemme endringen i motstand som oppstår som cellene passerer over målet elektroden. Celler på målet electrode øke motstanden av systemet seks. I tillegg raske svingninger i motstanden representerer endringer i samspillet av celler med elektroden overflaten og indikerer pågående mobilnettet form endres. Den ECIS / Taxis system kan måle bevegelse av cellen befolkningen i sanntid over lengre tid, men er også følsom nok til å oppdage ankomsten av en enkelt celle på målet elektroden.
Dictyostelium discoidium er kjent for å migrere i nærvær av en folat 7 gradient, 8 og dens kjemotaktisk respons kan måles nøyaktig ved ECIS / Taxis 9. Leukocytter chemotaxis, har som svar på SDF1α og chemotaxis antagonister også blitt målt med ECIS / 10 Taxis, 11. Et eksempel på leukocytt respons på SDF1α er vist i Figur 1.
Protocol
1. ECIS / Taxis elektrode Forberedelse
- Den gull overflate ECIS / drosjene elektrode array (bestående av 8 kamre per lysbilde) er første stabiliseres av forbehandling med steril 10 mM cystein i avionisert vann (dH 2 O) for 15 minutter ved romtemperatur under sterile forhold.
- Aspirer cystein løsningen fra hver elektrode kammeret, skyll 3 ganger med steril dH 2 O, og erstatte med 250 mL av komplett medium (RPMI 1640, 10% FBS, 25 mm HEPES buffer).
- Koble elektrode array å kontakte pinnene på instrument rekke innehaver å utføre elektroden sjekk.
- Chambers som er riktig tilkoblet vil bli uthevet i grønt på dataskjermen. Hvis kamrene er uthevet i rødt, er de ikke koblet og elektroden bør flyttes i matrisen holderen til å etablere kontakter for alle kamrene.
- Når alle kamrene er tilkoblet, klikker du på "sjekk" knappen i programmet kontrolleren for å avskrekkeutvinne den innledende motstand og kapasitans verdier for hvert kammer. Motstanden må ligge mellom 1600 og 2000 ohm, og kapasitans verdier bør være mellom 5 og 6 nanofarads for en 8 kammer matrise. Hvis en kammer ikke er innenfor disse akseptable parametre, bør den enkelte kammeret ikke brukes til å samle inn data.
- Koble elektroden fra matrisen holderen for å forberede de enkelte agarose kamre. Sug medium fra kammer og vask hvert kammer 3 ganger med steril dH 2 O.
2. Forbereder agarose Chambers
- I en steril 15 ml polypropylen konisk rør, mål 0,03 g Seakem GTG agarose og tilsett 1 ml steril PBS. Bytt tube cap løst, og smelte agarose i autoklav for en 2 min væske syklus (smelting i en mikrobølgeovn er ikke effektiv for denne analysen). Denne kort tid vil ikke smelte den koniske røret. For mindre kresne celler som ikke krever serum for kultur, (f.eks Dictyostelium discoideum) 0,5%agarose kan gjøres i riktig medium og smeltes i en mikrobølgeovn. Autoklaven er nødvendig for celler som krever serum, da dette vil bli denaturert dersom smeltes i mikrobølgeovn.
- Tilsett 5 ml komplett RPMI medium varmet i vannbad (55 ° -60 ° C) direkte til den varme agarose, til en endelig konsentrasjon på 0,5% agarose og pipette opp og ned forsiktig å blande.
- Pipetter 300 mL av smeltet agarose medium i hvert kammer, erstatte ECIS / drosjer matrise dekker og la til gel ved romtemperatur.
- Pipet gjenværende agarose inn cap på 15 ml tube å vurdere agarose gelling. Dette overskuddet agarose vil også bli brukt i del 4: Cutting brønner i agarose.
3. Bygging og skarphet kanylen Well Cutting Tool
- Skjerp to 14 gauge butte enden kanyler, med en 5/64 "bit. Roter tuppen av boret i hver kanyle åpningen med en saktegående drill, gjør sikkert boret skjærer hele interiøret kanten av hver kanyle opening å danne en skarp cutting edge (Figur 4A).
- Bor to hull gjennom en "x 2" x ¼ "plexiglass (Figur 4B-D) med en 5/64" bit i en drill presse. Sett hver skjerpet 14 gauge kanyle slik at det stikker ut en lik avstand gjennom hver plexiglass hull.
4. Cutting Wells i agarose
- Steriliser 14 gauge kanyler ved lett flammende tipsene. Før kutte brønner i ECIS kammeret, la kanyler avkjøles til romtemperatur, eller kjøle den kanyler ved å berøre agarose i hetten på 15 ml tube. Hvis temperaturen på kanylen er for høy, vil agarose smelte som kammeret brønnene er kuttet, rendering brønnene misdannede og defekt.
- Juster kanylen paret over to gull prikker rundt målet elektroden i hvert kammer (Figur 2c og 5). Sett kanylen vertikalt, uten horisontal bevegelse, stopper ved skånsom kontakt mellom kanyle ogelektroden overflaten. Fjern forsiktig kanylen, igjen uten noen horisontal bevegelse. Plassering av ytterligere brønner for å motsette gradienter er også mulig med en rekonfigurering av kanylen pilken.
- Forsiktig aspirer den agarose pluggen igjen av kanylen, ved hjelp av en steril 9 "Pasteur pipette knyttet til lavt vakuum trykk, med et vakuum felle fange agarose avfall.
- Legg 300 mL av komplette RPMI media til overflaten av hvert kammer ved 37 ° C, for 2 min å mette den agarose, og deretter forsiktig aspirer media fra overflaten og brønnene uten å forstyrre agarose.
5. Sette i Wells
- Hver brønn er i stand til å holde et volum på 7 mL. For en brønn i hvert kammer, tilsett 7 mL av celler suspensjon. For Jurkat T-celler, bruk 2 x10 7 celler / ml. Disse cellene vil reagere på 7 mL av 200 ng / ml SDF-1α fortynnes i ufullstendige RPMI, som mangler serum. Bruk komplette media alene som en negativ fortsrol.
- Etter at brønnene er lastet, se hvert kammer av tabellen med en omvendt mikroskop for å sikre at alle brønner ble kuttet og fylt på riktig måte. Cellene skal være i innenfor rammen av brønnens grensen. Hvis de blir sett i begge brønnene, eller sprer seg utenfor cellen vel grensen, da et gap har dannet under agarose. Legg merke til feil satt opp brønner, som data ikke kan bli pålitelig tolkes fra disse kamrene.
6. Datainnsamling
- Plasser elektroden i matrisen holderen og koble de gull pads på elektroden array til de fjærbelastede Pogo pinnene i holderen og klikk "setup". Brønnene som er riktig tilkoblet vil bli uthevet i grønt. Dersom brønnene er røde, de er ikke tilkoblet og elektroden bør plasseres i matrisen holderen.
- Velg "8WE1" (8 vel en elektrode) fra nedtrekksmenyen i programvaren panelet for å indikere matrisen konfigurasjonen.
- Velg "sjekk" i programvaren kontrol panel for å bestemme innledende motstand og kapasitans verdier for hver brønn. De motstand verdier bør være mellom 1600 og 2000 ohm, mens kapasitansverdier bør være mellom 5 og 6 nanofarads.
- Velg flere frekvenser for å måle motstand på flere frekvenser. Det er et valg for å tilpasse frekvenser, eller ved hjelp av et sett med anbefalte frekvenser. Standarden flere frekvenser oppkjøp innstillinger fange data ved 11 forhåndsinnstilte frekvenser (52.5, 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000, 8000, 16000, 32000 og 64000 Hz) med en hastighet på 8 brønner / min. Tidsintervallet mellom målinger kan også tilpasses. Samle flere frekvens data muliggjør analyse av kapasitans, impedans, og motstand. Samle motstandsverdier ved 4000 Hz er vanligvis tilstrekkelig for pattedyrcelle chemotaxis studier, men de ekstra frekvensene kan gi informasjon i andre sammenhenger 12,13.
- Totalt eksperiment varighet kan stilles inn, på høyre håndpanel, eller eksperimentet kan stoppes manuelt, ved å klikke på "Finish" når cellene har produsert motstand som indikerer ankomst ved elektroden. Tiden det tar for cellene å komme fram til elektroden avhenger av celletype som brukes.
- Klikk "Start" for å starte datainnsamlingen.
7. Data Management
- Selv om dataene kan eksporteres til Excel, er det ECIS 1600R programvaren, som følger ECISθ systemet den mest effektive metoden for å analysere ECIS / Drosje data.
- Programvaren dataanalyse Verktøylinjen inneholder radioknappene Z, R og C. Disse avgjør om impedans, motstand, eller kapasitans, henholdsvis, plottes på den vertikale aksen mot x-aksen (medgått tid).
- ECIS / Taxis data er mest effektivt vises som motstand over tid ved 4000 Hz. Raske svingninger i motstand, eller microtransients (figur 1), er bevis på cellulær bevegelse over elektroden. Kompilering, or Binning datapunktene slik at ikke alle punkter er grafisk, ikke anbefales for ECIS / taxi, siden det vil gjennomsnittlig microtransients ut av dataene.
- Når grafen er gjort med den ECIS1600R programvare, kan det bli eksportert ved å velge "eksport graf" fra filmenyen, og lagres som en. TIF eller. Jpg-fil.
8. Representative Resultater
Cellular chemotaxis er angitt med en økning i motstand ved 4000 Hz. Ankomsten av celler på målet elektroden indikeres også av utseendet av raske svingninger i motstanden kalles microtransients eller micromotion som beskrevet i Opp et. al., 2009 (figur 1) 14. Et negativt resultat indikeres ved konsekvent, eller en svak nedgang, på motstand ved 4000 Hz, som sett i rødt i figur 1. Fraværet av microtransients er også et tegn på fravær av celle bevegelse til elektroden. Økningen i motstanden er direkte proportional til antall celler som krysser elektroden 10. Tilsetting av monoklonalt antistoff spesifikt for en chemoattractant eller giftstoffer kjent for å forstyrre G protein koblede reseptorer kan blokkere chemotaxis 11.
Figur 1. Chemotaxis of Human Jurkat T-cellene som svar på SDF1α Human Jurkat T-celler (2.0x10 6 cellers / ml) ble utsatt for en stigning på SDF-1α (start konsentrasjon 100 ng / ml) eller RPMI 1640 som en negativ kontroll. Den normaliserte motstand ved 4000 Hz ble tegnes. Humane Jurkat T-celler flyttet inn svar på SDF-1α, som dokumentert av økningen i motstand og microtransients, mens ingen bevegelse ble sett med eksponering for RPMI 1640.
Figur 2. Top visning av en ECIS / Drosje elektroden without agarose. Hver ECIS / Taxis elektrode består av 8 individuelle kamre. Hvert kammer deler en stor elektrode (a), og inneholder en individuell mål elektrode (b). Hvert kammer har også 2 gull sirkler (c), som brukes som en veiledning når du skjærer de brønnene i agarose med kanyler. Gullet rutene (d) er kontaktpunktene pads som kobler til Pogo pins for å bruke vekselstrøm til elektroden. De individuelle mål Elektrodene er hver i kretsen med større disk elektrode (e).
Figur 3. To brønner er kuttet i hver agarose-fylt kammer. Når chemoattractant legges til ett godt det diffunderer å lage en gradient i agarose, med høyest konsentrasjon av chemoattract nærmest chemoattractant godt. Cellene reise under agarose mot høyere konsentrasjoner av chemoattractant og kan passere over målet elektroden. Somcellene krysse målet elektroden, er en økning på motstand ble registrert av ECIS 1600R programvaren.
Figur 4. Innsetting av to 14 gauge kanyler i plexiglass. A) En 5/64 "boret brukes til å skjerpe kanylen tips. B) To hull må bores inn i plexiglass for å imøtekomme den 14 gauge kanyler i henhold til oppsettet skudd. C) Bruk en drill trykk for å sikre hullene er vinkelrett til pleixglass overflaten. D) To skjerpet Kanyler blir satt inn gjennom ¼ "plexiglass, 2 mm fra hverandre (målt fra indre kanter). Disse skjerpet kanyler er nøye satt inn i agarose å kutte brønnene.
Figur 5. Samkjøre kanyler med gull prikker i ECIS / Taxis kammeret. Å klippe brønner, må skjerpet kanylervære på linje med gull prikker flankerer målet elektrode på bunnen av ECIS / Taxis kammer. Den kanyler skal settes inn vertikalt, uten horisontal bevegelse, og fjernet på samme måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Novel egenskaper ECIS / Taxis analysen inkluderer evnen til å automatisere innsamling av sanntidsdata som celler reagerer på chemoattractant. Mens det mest vanlig anvendelse av denne teknologien er å måle cellulære responser til individuelle kjemotaktisk gradienter, eller gradienter som består av blandinger av chemotaxis agonister og antagonister, er det ECIS / Taxis tilnærming også mottagelig for variasjoner i disse konfigurasjonene som kan være ganske nyttig i vurdering av cellulær respons. Det er god dokumentasjon på at overlappende eller sekvensiell gradienter kan påvirke mobilnettet atferd på nye måter. Videre er det sannsynlig at disse mer komplekse gradienter er normen i situ 12, 13.
Den ECIS / Drosjene analysen kan aktivere modellering av disse ulike gradient konfigurasjonene på måter som ikke er mulig med andre teknologier. For eksempel, ved å legge til flere brønner, kan man fordele orienteringen av gradient (s) i forhold til cellen godt og målet elektroden. Det er også mulig å konfigurere analysen å plassere celler i en av brønnene som kilden til kjemotaktisk faktorer.
Når du setter opp analysen, er det viktig å opprettholde full hydrering av gel som overlegg målet og skranke elektroder i hvert kammer, og å kutte brønner som har den riktige romlige forholdet til målet elektroden. Videre må bunnen av cellen godt å være sammenhengende med den tynne filmen av væske som utgjør under agarose laget, det er i denne filmen at cellene vil bevege seg i respons til den overliggende gradient. For å gjøre dette, må man aspirere alle agarose pluggen uten å forlate gel fragmenter bak. Fjerning av agarose pluggen kuttet av kanylen kan lage en tunnel mellom de to brønnene, som har effekten av deformeres gradient og tillater cellene å bevege seg fritt over målet elektroden. Det er avgjørende at vakuum trykk brukes til ASPså hissig gelen pluggen er lav for å unngå at det går agarose brønnintegritet.
Vi har funnet at variasjoner i andelen av agarose som brukes i gel kan skille celler som uttrykker cytoskeletal defekter fra villtype celler, noe som tyder på at denne manipulasjonen kan brukes til å avhøre de kreftene som cellene kan øve på sitt miljø. Hvis gelen dehydrates under kultur, kan det oppstå endringer som påvirker de eksperimentelle resultatene, inkludert en relativ økning i gel stivhet som ville bremse celle bevegelse og en økning i stoff konsentrasjon som ville redusere total system impedans.
Den analysen er kompatibel med måling av bevegelse av leukocytter og andre celletyper som ikke tillater strøm gjennom cellen kroppen. Dette er ikke en universell egenskap av celler: nerveceller og noen epitelceller (for eksempel) kunne overføre strøm gjennom cellen kroppen og vil derfor gi langt lavere motstand verdifullees per enkelt celle.
Mens disse tilnærmingene er nærmere definert til å oppdage cellulære responser til kjemotaktisk gradienter, er det lett å forestille seg at analysen som tilsvarende gjelder for studier som involverer metastasering og de ekstracellulære signaler som forbedrer metastatisk celle bevegelse. Dessuten er det flere utvalg konfigurasjoner som kan brukes i andre celle-substrat interaksjonsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
David A Knecht og Michael A Lynes ha en utstedt patent for ECIS / Taxis teknologi, som så er lisensiert av University of Connecticut til Applied biofysikk, Inc.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (ES07408 og EB00208).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
