Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

ECIS的/出租车细胞趋化测量

doi: 10.3791/3840 Published: April 1, 2012

Summary

企业家信心指数/出租车系统是一个自动化的,实时的检测,测量细胞趋化。在这个实验中,细胞的琼脂糖层到达目标电极下方移动。细胞运动耐交流电流0开始测量。

Abstract

在回应外界刺激细胞运动是许多细胞过程,包括伤口愈合,炎症和感染的反应的基础。一种常见的方法来衡量趋Boyden小室检测,其中由多孔膜分离细胞和细胞趋化。通过向趋化膜作为细胞迁移,他们坚持膜,或下降到底层媒体的底面,并随后染色和视觉计算1。在此方法中,细胞暴露在一个陡峭的和短暂的趋化因子梯度,这被认为是2组织中发现的梯度差表示。

另一个检测系统,琼脂糖下的趋化检测,3,4项措施,各地根据琼脂糖凝胶层形成薄薄的水膜,在固体基质细胞运动。梯度在琼脂糖开发的是浅层的,被认为是一个应用程序ropriate代表性的自然发生的梯度。可行驶距离的显微成像评价趋。 Boyden小室法和下琼脂糖检测通常配置为端点检测。

ECIS的/出租车自动化系统相结合的电动细胞基质阻抗遥感(ECIS)的5,6下琼脂糖方法。在这个实验中,目标电极位于8室。一个大型的反电极贯穿每8室( 图2)。每个室充满琼脂糖和两个小口井是在琼脂糖上削减目标电极的两侧。一个也充满了测试细胞的人口,而其他持有扩散的趋化因子的来源( 图3)。通过系统的电流可以被用来确定在发生细胞越过目标电极的电阻变化。对靶细胞的焊条é增加阻力系统6。此外,在抵抗快速波动代表在细胞与电极表面相互作用的变化和正在进行的细胞形状变化的指示。 ECIS的/出租车系统可以在多长时间实时测量细胞群体的运动,但也很敏感,足以探测到一个单细胞,在到达目标电极。

被称为粘菌discoidium迁移叶酸梯度7,8 ECIS的/出租车9可以准确测量其趋化反应的存在。白细胞趋化反应到SDF1α趋拮抗剂也被ECIS的10,11 /出租车测量。一个白细胞反应SDF1α的例子如图1所示。

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1。 ECIS的/出租车电极的制备

  1. ECIS的/的士电极的阵列(8%幻灯片商会组成)的金表面稳定在室温为15分钟,在无菌条件下用无菌去离子水(DH 2 O)的10毫米半胱氨酸的前处理。
  2. 从每个电极室吸半胱氨酸溶液,冲洗与消毒卫生署2 O的 3倍,并更换完全培养基250μL(RPMI 1640培养液,10%胎牛血清,25毫米的HEPES缓冲液)。
  3. 连接电极阵列联系仪器阵列支架引脚进行电极检查。
  4. 正确连接钱伯斯将在绿色突出显示在电脑屏幕上。如果商会以红色突出显示,它们没有连接电极阵列持有人应重新定位,以建立各商会的接触。
  5. 所有商会一旦连接后,点击“检查”按钮,在软件控制器,以防止在雷初阻力为每个室和电容值。电阻值应该是在1600年和2000年之间欧姆,电容值应该是一个8腔阵列5和6之间的纳法。如果没有在这些接受的参数,一腔室个别不应该被用来收集数据。
  6. 电极断开阵列持有的准备个别的琼脂糖商会。吸商会介质和清洗每个室用无菌DH 2 O 3倍

2。准备琼脂糖钱伯斯

  1. 在15毫升无菌聚丙烯锥形管,措施0.03 GTG琼脂糖Seakem g和添加1毫升无菌PBS。更换管帽松散,融化在高压灭菌器为2分液循环琼脂糖(微波炉融化此法有效)。这短暂的时间,不会融化的锥形管。对于不太讲究的细胞,不需要血清文化,(如粘菌 )0.5%琼脂糖凝胶可在适当的介质,在微波炉中融化。反应釜需要血清的细胞是必要的,因为这将变性如果在微波融化。
  2. 完整的RPMI水浴中预热的培养基中加入5毫升(55°〜60°C)的直接热琼脂糖的终浓度为0.5%琼脂糖和吸管了下来,轻轻地混合。
  3. 吸取300μl琼脂糖融化到每个室的中型的,取代ECIS的/的士阵列盖,并允许在室温下的凝胶。
  4. 吸取剩余琼脂糖到15毫升管帽评估琼脂糖凝胶。这样,多余的琼脂糖也将被用来在第4部分:切割井到琼脂糖。

3。建设和锐化套管井刀具

  1. 使用5/64“位。旋转的钻头,在每一个低速钻套管开幕尖端,使钻头降低整个室内每个套管运边缘锐化两个14针的钝端套管,ening形成一个锋利的切削刃( 图4A)。
  2. 通过1“×2”×¼“有机玻璃( 图4B - D)与5/64”位在钻床钻两个孔。插入每个削尖的14计套管,通过每个有机玻璃洞的距离相等,所以它突出。

4。到琼脂糖切割井

  1. 轻轻燃烧的秘诀,消毒14号套管。 ECIS的商会在切割井前,允许套管冷却至室温,或冷却触摸琼脂糖在15毫升管帽的套管。如果套管的温度过高,会熔化琼脂糖室井被切断,使井的畸形和缺陷。
  2. 将套管对上述两个黄金点周围的电极( 图2c和5)在每个室的目标。插入导管垂直之间的套管和温柔的接触后,没有任何横向移动,停止在电极表面。小心取出套管,再没有任何横向运动。额外井反对梯度安置,也可以用套管夹具的重新配置。
  3. 轻轻吸套管留下琼脂糖插件,使用无菌9“巴斯德吸管,连接到低真空压力,真空陷阱捕捉琼脂糖浪费。
  4. 加入300μL完整的RPMI媒体表面各室在37°C间,2分钟到饱和的琼脂糖,然后轻轻地吸不干扰琼脂糖从表面和媒体的水井。

5。载入井

  1. 每口井是持有7微升量的能力。在每个室以及一,增加7μL的细胞悬液。对于Jurkat T细胞,使用2×10 7细胞/ ml。这些细胞会回应7μL的200毫微克/毫升SDF-1α在不完整的RPMI稀释,缺乏血清。使用完整的媒体单独作为一个负续列伊。
  2. 加载井后,倒置显微镜查看每个阵列室,以确保所有井被切断,并填写正确。细胞应该是很好的边界​​的范围内。如果他们看到在两个井,或超出细胞以及边境蔓延,已形成一定的差距下的琼脂糖。注意设置不当的井,数据不能可靠地解释这些商会。

6。数据采集

  1. 将电极阵列中的持有人,并重新连接电极阵列上的金片,弹簧加载的POGO针持有人,并单击“设置”。井,已正确连接,将突出绿色。如果该井是红色的,它们没有连接和电极阵列持有人应重新定位。
  2. 软件面板中,从下拉菜单中选择“8WE1”(8以及1电极)来表示阵列配置。
  3. 选择“检查”软件CONTROL面板确定为每口井的初始电阻和电容值。电阻值应该是在1600年和2000年之间欧姆,电容值,而应该是5和6之间的纳法。
  4. 选择多个频率在几个频率来衡量的阻力。定制频率,或使用了一套推荐的频率有一个选择。标准的多频率采集设置捕获数据,在11个预先设定的频率在8孔/分钟的速度(52.5,125,250,500,1000,2000,4000,8000,16000,32000和64000赫兹)。也可以自定义的测量之间的时间间隔。多频数据收集允许电容,阻抗和阻力分析。收集在4000赫兹的电阻值通常是足够的哺乳动物细胞趋化研究,但可提供额外的频率在12,13其他情况下的信息。
  5. 总的实验时间可以设置,右手手动面板,可以停止实验,一旦细胞产生的阻力,表明在到达电极,通过点击“完成”。细胞到达电极所花费的时间取决于所用的细胞类型。
  6. 点击“开始”启动数据收集。

7。数据管理

  1. 虽然可以将数据导出到Excel,ECIS的1600R软件,其中伴随ECISθ系统是最有效的方法分析ECIS的/出租车数据。
  2. 软件的数据分析工具栏包含的单选按钮,Z,R和C,这些决定是否阻抗,电阻,电容,分别对x轴(经过时间)垂直轴绘制。
  3. ECIS的/出租车数据显示,随着时间的推移阻力位在4000赫兹是最有效的。快速波动性,或microtransients( 图1),在电极细胞运动的证据。编译,Oŕ分级的数据点,因此,并非所有的点绘制,不建议ECIS的/出租车,因为它的数据平均microtransients。
  4. 一旦图已与ECIS1600R软件,它可以从文件菜单中选择“出口图”,并保存。tif或jpg文件导出。

8。代表结果

细胞趋增加,阻力位在4000赫兹表示。到达目标电极上的细胞也被称为microtransients,或微动,奥普阻力迅速波动的外观表示。人,2009年( 1)14。阴性结果表示一致,或略有下降,在4000赫兹电阻,在红色如图1所示 。没有microtransients也是一个电极细胞运动的情况下的一个标志。在阻力增加是直接亲到细胞交叉电极10的数量成正比。单克隆抗体除了特定的趋化因子或毒素已知的干扰与G蛋白偶联受体可以阻断趋化11。

图1
图1。人Jurkat T细胞趋化反应SDF1α人 Jurkat T细胞(2.0x10 6细胞/毫升)被暴露在SDF-1α梯度(起始浓度为100毫微克/毫升)或RPMI 1640培养液作为阴性对照。在4000赫兹的规范化阻力绘制。人类Jurkat T细胞移动响应SDF-1α,增加阻力和microtransients证明,没有动静,而被曝光的RPMI 1640。

图2
图2。顶视图的ECIS的/出租车电极withouţ琼脂糖。每个ECIS的/出租车电极的8个独立的室组成。各室共用一个大电极(一),并包含一个单独的目标电极(B)。每个分庭也有2金圆(C),用于切割时用的套管井在琼脂糖为指导。黄金广场(D)的接触焊盘连接到POGO引脚,以适用于交流电流的电极。个人目标的电极是在电路中的每个较大的反电极(E)。

图3
图3。两口井都切成室每个琼脂糖充满。当趋化以及被添加到一个创造最高最接近的趋化因子的趋化浓度梯度,在琼脂糖扩散。旅游下方琼脂糖对高浓度的趋化细胞,可以通过在目标电极。如细胞跨越的目标电极,阻力增加ECIS的1600R软件记录。

图4
图4。两个14计成有机玻璃套管插入。一)一个5/64“钻头是用来锐化导管尖端,B)两孔必须钻成有机玻璃,以适应14计套管,根据布局的射门。c)用钻床,以确保孔垂直的pleixglass表面D)两个削尖的插管插入6.3“有机玻璃,相隔2毫米(从内缘计算)。这些削尖套管仔细插入琼脂糖削减井。

图5
图5。 ECIS的/出租车室的黄金点对准套管。要削减井,的削尖套管必须ECIS的/出租车室的底部目标电极两侧的黄金点对齐。的套管应垂直插入,没有任何横向运动,并以同样的方式拆除。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ECIS的检测/出租车新颖等特点,包括其自动化实时数据的收集细胞以趋化因子的反应能力。虽然这项技术的最普遍的应用是测量细胞的反应,个别趋化梯度,或趋激动剂和拮抗剂的混合物组成的梯度,ECIS的/出租车方法的是服从这些配置的变化,这可能是非常有益的评估细胞的反应。有很好的证据,重叠或连续梯度可以影响细胞的行为,以新颖的方式。此外,它很可能是这些更为复杂的渐变是 12,13 原位规范。

ECIS的/出租车检测的方式,不与其他技术可能可以使这些不同的梯度配置的模型。例如,可以通过增加额外的井,定向分配的gradient(s)在有关的细胞以及和目标电极。它也可以配置检测细胞放置在井趋化因子的来源之一。

设立检测时,重要的是保持完全水化凝胶覆盖的目标,并在每个室的柜台电极,并削减井有正确的空间关系的目标电极。此外,细胞的底部需要连续的液体薄膜,根据琼脂糖层形成,它是在这部影片中,细胞会动议在回应覆梯度。要做到这一点,必须吸不留胶碎片背后所有琼脂糖插件。琼脂糖插头切移除插管,可以创建一个隧道之间的两口井,其中有变形梯度,使细胞间移动的目标电极自由的效果。这是至关重要的,用于真空压力的ASP发怒的凝胶插头是低,以避免损害的琼脂糖以及完整性。

我们已经发现,在琼脂糖凝胶中使用的比例的变化可以分化细胞表达野生型细胞的细胞骨架的缺陷,认为这种操作可以用来审问细胞的力量,可以发挥他们的环境。如果凝胶在培养过程中脱水,将发生变革,影响实验结果,包括凝胶的刚性相对增加,将减缓细胞运动和溶质浓度的增加,会降低系统总阻抗。

该法是兼容的白细胞和其他类型的细胞,不容许通过电流流过的细胞体运动测量。这不是一个普遍特征:细胞,神经细胞和上皮细胞(例如)可以传送电流通过细胞体,从而产生远远低于耐有价值每单个细胞的ES。

虽然这些方法的具体定义,检测细胞趋化梯度,很容易想象,同样适用于研究,涉及转移,提高转移性​​细胞运动和细胞外信号检测。此外,还有额外的阵列,可以在其他细胞基质的相互作用研究中使用的配置。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

大卫克内希特和迈克尔Lynes的ECIS的/出租车的技术,作为被许可康涅狄格大学应用生物物理学,公司颁发的专利

Acknowledgments

这项工作是由来自美国国立卫生研究院(ES07408和EB00208)的赠款支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECIS Zθ Applied Biophysics www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php
ECIS Electrode Array Applied Biophysics 8W Chemotaxis www.biophysics.com/cultureware.php
Seakem GTG agarose BioWhittaker 50070
RPMI1640 Cellgro 10-040
HyClone Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific, Inc. SH300703
Penicillin/Streptomycin MP Biomedicals 1670049 Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml
HEPES Buffer MP Biomedicals 1688449 1M solution, cell culture grade
14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch General Supply 5-8365-1 Blunt point

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  2. Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
  3. Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
  4. Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
  5. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
  6. Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
  7. Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
  8. Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
  9. Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
  10. Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
  11. Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
  12. Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
  13. Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
  14. Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
  15. Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
  16. Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
ECIS的/出租车细胞趋化测量
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pietrosimone, K. M., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis. J. Vis. Exp. (62), e3840, doi:10.3791/3840 (2012).More

Pietrosimone, K. M., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis. J. Vis. Exp. (62), e3840, doi:10.3791/3840 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter