Summary
Den ECIS / Taxa system er en automatiseret, real-time analyse, der måler cellulære kemotaksi. I dette assay flytte cellerne under et lag af agarose at nå frem til et mål elektrode. Cellulær bevægelse måles ved indtræden af resistens over for vekselstrøm 0.
Abstract
Cellulære bevægelse som reaktion på ydre stimuli er afgørende for mange cellulære processer, herunder sårheling, inflammation og respons på infektion. En almindelig metode til at måle kemotaksi er Boyden kammer assay, i hvilket celler og kemotiltrækkende er adskilt af en porøs membran. Som celler migrerer gennem membranen mod det kemotiltrækkende de klæber til undersiden af membranen eller kan opdeles i de underliggende mediet, og efterfølgende farvet og visuelt tælles 1. Ved denne fremgangsmåde celler eksponeres for en stejl og transient kemoattraktant gradient, hvilket menes at være en dårlig gengivelse af gradienter, der findes i væv to.
Et andet assaysystem, under-agarose-kemotaxi-assay, 3, 4 foranstaltninger cellebevægelse over et fast substrat med en tynd vandig film, der dannes under agarose lag. Den gradient, der udvikler i agarose er lavvandet, og menes at være en appropriate repræsentation af naturligt forekommende gradienter. Kemotaksi kan vurderes ved mikroskopisk afbildning af den tilbagelagte afstand. Både Boyden-kammer-assayet og under-agarose assay sædvanligvis udformet som slutpunkt assays.
Den automatiserede ECIS / Taxa system kombinerer under-agarose tilgang med Electric Cell-substrat Impedans Sensing (ECIS) 5, 6. I dette assay, er target elektroder placeret i hver af 8 kamre. En stor modelektrode løber gennem hver af de 8 kamre (figur 2). Hvert kammer er fyldt med agarose og to små brønde er snit i agarosen på hver side af målet elektroden. En brønd fyldes med prøven cellepopulation, medens den anden holder kilder spredende kemoattraktant (figur 3). Strøm ledes gennem systemet kan anvendes til at bestemme ændringen i modstand, der opstår som celler passerer hen over mål-elektroden. Celler på målet electrode forøge modstandsdygtigheden af systemet 6. Desuden udgør hurtige fluktuationer i modstanden ændringer i interaktioner af celler med elektrodeoverfladen og er indikative for løbende cellulære formændringer. Den ECIS / Taxis system kan måle bevægelsen af cellepopulationen i real-tid over længere tid, men er også følsom nok til at detektere ankomsten af en enkelt celle ved målet elektroden.
Dictyostelium discoidium vides at migrere i nærvær af en folat gradient 7, 8 og kemotaktiske respons kan måles nøjagtigt ved ECIS / Taxis 9. Leukocytkemotaxis, har som reaktion på SDF1α og kemotaxi antagonister også blevet målt med ECIS / Taxis 10, 11. Et eksempel på leukocyt respons på SDF1α er vist i fig 1.
Protocol
1. ECIS / Taxa Electrode Forberedelse
- Guld overflade ECIS / taxaer elektrodesæt (bestående af 8 kamre pr objektglas) først stabiliseres ved forbehandling med steril 10 mM cystein i deioniseret vand (dH2O) i 15 minutter ved stuetemperatur under sterile betingelser.
- Aspirer cystein opløsning fra hver elektrode kammer skylles 3 gange med sterilt dH2O, og erstat med 250 ul komplet medium (RPMI 1640, 10% FBS, 25 mM HEPES-puffer).
- Slut elektrodeopstillingen at kontakte ben på instrumentet række indehaveren til at udføre elektrode check.
- Chambers, der er tilsluttet korrekt, vil blive markeret med grønt på computerskærmen. Hvis kamrene er fremhævet med rødt, er de ikke tilsluttet, og elektroden skal omplaceres i rækken indehaveren ret til at etablere kontakter til alle kamre.
- Når alle kamre er forbundet, skal du klikke på "check"-knappen i software controller for at afskrækkeudvinde den første modstand og kapacitansværdier for hvert kammer. Modstandsværdier bør være mellem 1600 og 2000 ohm, og kapacitansværdier bør være mellem 5 og 6 nanofarads til en 8 kammer array. Hvis et kammer ikke er inden for disse acceptable parametre bør kamre ikke anvendes til at indsamle data.
- Tag elektroden fra opstilling for at forberede de enkelte agarose kamre. Aspirer medium fra kamre og vask hver kammer 3 gange med sterilt dH 2 O.
2. Forberedelse Agarose Chambers
- I en steril 15 ml polypropylen konisk rør, og der tilsættes mål 0,03 g Seakem GTG agarose og 1 ml steril PBS. Sæt rør hætte løst, og smelte agarosen ved autoklavering i en 2 min væskecyklus (smeltning i en mikrobølgeovn er ikke effektivt for denne analyse). Dette kort tid vil ikke smelte konisk rør. Mindre kræsne celler, som ikke kræver serum for kulturen (f.eks Dictyostelium discoideum) 0,5%agarose kan foretages i det passende medium og smeltes i en mikrobølgeovn. Autoklaven er nødvendig for celler, der kræver serum, som det vil blive denatureret, hvis smeltes i mikrobølgeovn.
- Tilsættes 5 ml komplet RPMI-medium opvarmet i et vandbad (55 ° -60 ° C) direkte til den varme agarose, til en slutkoncentration på 0,5% agarose og pipetten op og ned forsigtigt til blanding.
- Pipette 300 gl af smeltet agarose medium i hvert kammer, erstatte de ECIS / taxier arrayet låget, og at gelere ved stuetemperatur.
- Pipette resterende agarose i hætten 15 ml rør til at vurdere agarose gelering. Dette overskud agarose vil også blive brugt i del 4: Skæring brønde i agarose.
3. Konstruktion og skarpere Kanyle Well Skære Værktøj
- Skarpere to 14 gauge stump ende kanyler under anvendelse af en 5/64 "bit. Roter spidsen af boret i hver kanyle åbning med en langsom hastighed boremaskine, idet man borekronen skærer hele den indre kant af hver kanyle opkelse for at danne en skarp skærende kant (fig. 4A).
- Bore to huller gennem en "x 2" x ¼ "plexiglas (figur 4B-D) med en 5/64" bit i en boremaskine. Sæt hver skærpet 14 gauge kanyle, så det stikker en lige stor afstand gennem hver plexiglas hul.
4. Skæring Wells i Agarose
- Steriliser 14 gauge kanyler ved let flammende tips. Før skæring brønde i ECIS kammeret tillader kanyler afkøle til stuetemperatur, eller afkøling af kanyler ved berøring af agarose i hætten 15 ml rør. Hvis temperaturen af kanylen er for høj, vil agarose smelte, når kammeret brøndene skæres, således at de brønde misdannelse og defekt.
- Bringe kanylen par over de to guld prikker omgiver målet elektroden i hvert kammer (fig. 2c og 5). Indsæt kanylen lodret uden nogen vandret bevægelse, standsning ved forsigtigt kontakt mellem kanylen ogelektrodeoverfladen. Fjern forsigtigt kanylen, igen uden nogen vandret bevægelse. Anbringelse af yderligere brønde til at modsætte gradienter er også muligt med en rekonfiguration af kanylen jig.
- Forsigtigt suge agaroseprop efterladt af kanylen ved hjælp af en steril 9 "Pasteur-pipette forbundet med lavt vakuum tryk med en vakuum-fælde fange agarose affald.
- Tilsæt 300 pi komplet RPMI medium på overfladen af hvert kammer ved 37 ° C i 2 min for at mætte agarose og derefter forsigtigt aspireres mediet fra overfladen, og brøndene uden at forstyrre agarose.
5. Ilægning af Wells
- Hver brønd er i stand til at holde et volumen på 7 ul. Til den ene godt i hvert kammer, 7 ul celler suspension tilføje. For Jurkat T-celler, anvendes 2 x 10 7 celler / ml. Disse celler responderer på 7 pi 200 ng / ml SDF-1α fortyndet i ufuldstændig RPMI, der mangler serum. Brug komplette medier alene som en negativ control.
- Efter at brøndene er indlæst, se hvert kammer af arrayet med et inverteret mikroskop for at sikre, at alle brønde blev skåret og fyldt korrekt. Cellerne bør være inden for rammerne af brøndens grænse. Hvis de bliver set i begge brønde, eller breder sig ud over celle godt grænse, så et hul har dannet under agarose. Bemærk forkert oprettet brønde, da data ikke kan opgøres pålideligt fortolkes fra disse kamre.
6. Dataindsamling
- Placer elektrode i sættet holderen og igen forbinde guld puder på elektroden array til de fjederbelastede Pogo stifter af holderen og klik på "setup". De brønde, der er tilsluttet korrekt, vil blive markeret med grønt. Hvis fordybningerne er røde, er de ikke er forbundet, og elektroden skal flyttes i arrayet holderen.
- Vælg "8WE1" (8 samt 1 elektrode) fra drop down menuen i softwaren panelet for at angive Array Configuration.
- Vælg "kontrollere" i softwaren control panel for at bestemme den oprindelige modstand og kapacitansværdier for hver brønd. Modstandsværdierne bør være mellem 1600 og 2000 ohm, mens kapacitansværdier bør være mellem 5 og 6 nanofarads.
- Vælge flere frekvenser for at måle modstanden på flere frekvenser. Der er en mulighed for at skræddersy frekvenser, eller ved hjælp af et sæt anbefalede frekvenser. Standard med flere frekvenser erhvervelse indstillinger opfange data på 11 forudbestemte frekvenser (52,5, 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000, 8.000, 16.000, 32.000 og 64.000 Hz) ved en hastighed på 8 brønde / min. Tidsintervallet mellem målingerne kan også tilpasses. Indsamling af flere frekvenser data giver mulighed for analyse af kapacitet, impedans, og modstand. Indsamling modstand værdier ved 4.000 Hz er normalt tilstrækkeligt til pattedyrscellelinier kemotaxi undersøgelser, men de ekstra frekvenser kan give oplysninger i andre sammenhænge 12,13.
- Samlet varighed af eksperimentet kan indstilles, på højre håndpanel, eller forsøget kan stoppes manuelt, ved at klikke på "finish", når cellerne har produceret modstand, der er vejledende for ankomsten til elektroden. Den tid det tager for celler at nå frem til elektroden, afhænger af den anvendte celletype.
- Klik på "Start" for at starte dataindsamlingen.
7. Data Management
- Selv om data kan eksporteres til Excel, ECIS 1600R software, som ledsager ECISθ systemet er den mest effektive metode til at analysere ECI / Taxaer data.
- Softwaren dataanalyseværktøj bar indeholder radioknapperne Z, R, og C. Disse bestemme, om impedansen, modstand eller kapacitans, henholdsvis, er afbildet på den lodrette akse i forhold til x-aksen (forløbet tid).
- ECIS / Taxaer data er mest effektivt vises som modstand over tid ved 4.000 Hz. Hurtige fluktuationer i resistens, eller microtransients (figur 1), er tegn på cellulær bevægelse over elektroden. Kompilering, or Binning datapunkter således at ikke alle punkter tegnes, anbefales ikke til ECIS / taxaer, da det vil det gennemsnitlige microtransients ud af data.
- Når grafen er lavet med ECIS1600R software, kan det eksporteres ved at vælge "eksport graf" fra menuen Filer, og gemt som en. Tif eller. Jpg-fil.
8. Repræsentative resultater
Cellulær kemotaksi er angivet ved en forøgelse i modstand på 4000 Hz. Ankomsten af celler på målet elektroden er også angivet ved fremkomsten af hurtige fluktuationer i modstand kaldet microtransients eller mikrobevægelse som beskrevet i Opp et. al., 2009 (figur 1) 14. Et negativt resultat er angivet med konsistent, eller et lille fald i modstanden ved 4.000 Hz som vist i rødt i figur 1. Fraværet af microtransients er også et tegn på fravær af cellebevægelse til elektroden. Stigningen i resistens er direkte proproportional med antal celler, der krydser elektroden 10. Tilsætningen af monoklonalt antistof specifikt for en kemoattraktant eller toksiner interfererer med G proteinkoblede receptorer kan blokere kemotaxi 11.
Figur 1. Kemotaksi af humane Jurkat T-celler i respons på SDF1α Humane Jurkat-T-celler (2.0x10 6 celler / ml) blev udsat for en gradient af SDF-1α (startkoncentration 100 ng / ml) eller RPMI 1640 som en negativ kontrol. Den normaliserede modstand på 4000 Hz er afbildet. Humane Jurkat T-celler bevæges i respons til SDF-1α, som vist ved stigningen i modstand og microtransients, medens ingen bevægelse sås med eksponering til RPMI 1640.
Figur 2. Set ovenfra af en ECIS / Taxaer Elektrode Uden b.t agarose. Hver ECIS / Taxis elektrode består af 8 individuelle kamre. Hvert kammer deler en stor elektrode (a), og indeholder en enkelt target elektrode (b). Hver afdeling har også 2 guld cirkler (c), der bruges som en guide, når der skæres brøndene i agarose med kanyler. De guld firkanter (d) er de kontaktpuder, der forbinder de Pogo stifter i at kunne anvende AC-strøm til elektroden. De individuelle mål elektroder er hver i kredsløb med større modelektrode (e).
Figur 3. To brønde skæres i hver agarose-fyldte kammer. Når kemoattraktant sættes til en brønd det diffunderer at skabe en gradient i agarose med den højeste koncentration af chemoattract nærmest kemoattraktant brønd. Cellerne bevæge under agarose mod højere koncentrationer af kemoattraktant og kan passere hen over mål-elektroden. Somcellerne passere målet elektrode, er en forøgelse af modstanden registreres af ECIS 1600R software.
Figur 4. Indsættelse af to 14 gauge kanyle i plexiglas. A) en 5/64 "borehoved anvendes til at skærpe kanylespids. B) To huller skal bores i plexiglas til at rumme 14 gauge kanyler ifølge indretning skud. C) Brug en boremaskine til at hullerne er vinkelrette til pleixglass overfladen. d) to tilspidset Kanyler indsættes gennem ¼ "plexiglas, 2 mm fra hinanden (målt fra inderkanten). Disse skærpet kanyler omhyggeligt indsat i agarose at skære brøndene.
Figur 5. Justering kanyler med guld prikker i ECIS / Taxis kammer. At skære brønde, skal skærpes kanylerbringes på linje med de guld prikker flankerer mål elektrode på bunden af ECIS / Taxis kammer. Kanylerne skal indsættes vertikalt uden nogen vandret bevægelse, og fjernes på samme måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nye egenskaber ECIS / Taxis analysen omfatter dens evne til at automatisere indsamling af data i realtid, som cellerne reagerer på chemoattraktant. Mens den mest almindelige anvendelse af denne teknologi er at måle cellulære responser til individuelle kemotaktiske gradienter eller gradienter sammensat af blandinger af kemotaksi agonister og antagonister, til ECIS / taxier fremgangsmåde er også egnet til variationer af disse konfigurationer, som kan være ganske nyttige i Vurderingen af cellulær respons. Der er god dokumentation for, at overlappende eller sekventielle forløb kan påvirke cellulære adfærd på nye måder. Endvidere er det sandsynligt, at disse mere komplekse gradienter er normen in situ 12, 13.
Den ECIS / Taxis analysen kan muliggøre modellering af disse forskellige gradient konfigurationer på måder, der ikke er muligt med andre teknologier. For eksempel ved tilsætning af yderligere brønde kan man fordele orientering gradient (s) i forhold til cellen godt og target elektrode. Det er også muligt at konfigurere assay til at placere celler i en af brøndene som kilde af kemotaktiske faktorer.
Ved opsætning af assayet, er det vigtigt at opretholde fuldstændig hydratisering af gelen, der overlejrer målet og modelektroderne i hvert kammer, og at skære brønde, der har den korrekte rumlige forhold til målet elektroden. Desuden bunden af cellen og skal være sammenhængende med den tynde film af væske, som dannes under agarose lag, det er i denne film, at cellerne vil bevæge sig i respons på den overliggende gradient. For at gøre dette, må man suge alle agaroseprop uden at forlade gelfragmenterne bag. Fjernelse af agaroseprop snit af kanylen kan skabe en tunnel mellem de to brønde, som har den virkning at deformere gradient og tillader cellerne at bevæge sig frit over målet elektrode. Det er afgørende, at undertrykket bruges til asphidsig gelen stikket er lav for ikke at kompromittere agarosen godt integritet.
Vi har fundet, at variationer i procentdelen af agarose, der anvendes i gelen, kan differentiere celler, der udtrykker cytoskeletale defekter fra vildtypeceller, antyder, at denne manipulation kan anvendes til at forespørge de kræfter, at celler kan udøve deres miljø. Hvis gelen tørrer under dyrkning, vil der forekommer ændringer, der påvirker de eksperimentelle resultater, herunder en relativ stigning i gelen stivhed, der vil forsinke cellebevægelse og en stigning i koncentration af opløst stof, som ville formindske den samlede impedans.
Assayet er kompatibel med måling af bevægelsen af leukocytter og andre celletyper, der ikke tillader strøm gennem cellen kroppen. Dette er ikke en universel er karakteristisk for celler: nerveceller og nogle epitelceller (for eksempel) kan overføre strøm gennem cellen kroppen og vil således frembringe meget lavere modstand værdifuldees per enkelte celle.
Mens disse fremgangsmåder specifikt er defineret til at detektere cellulære responser på kemotaktiske gradienter, er det let at forestille sig assayet som ligeledes anvendeligt til undersøgelser med metastase og de ekstracellulære signaler, der forbedrer metastatisk cellebevægelse. Endvidere er der yderligere array-konfigurationer, der kan anvendes i andre celle-substrat-interaktionsundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
David A Knecht og Michael A Lynes har udstedt patent for ECIS / Taxis teknologi, der som det er blevet licenseret af University of Connecticut til Applied Biofysik, Inc.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (ES07408 og EB00208).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ECIS Zθ | Applied Biophysics | www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS Electrode Array | Applied Biophysics | 8W Chemotaxis | www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarose | BioWhittaker | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300703 | |
| Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | Penicillin 5,000 IU/ml; Streptomycin 5 mg/ml |
| HEPES Buffer | MP Biomedicals | 1688449 | 1M solution, cell culture grade |
| 14 Gauge stainless steel Cannula (2) 4 inch | General Supply | 5-8365-1 | Blunt point |
References
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assays. Methods Enzymol. 162, 85-101 (1988).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115, 1650-1650 (1975).
- Newton-Nash, D. K., Tonellato, P., Swiersz, M., Abramoff, P. Assessment of chemokinetic behavior of inflammatory lung macrophages in a linear under-agarose assay. J. Leukoc. Biol. 48, 297-305 (1990).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 3761-374 (1984).
- Keese, C. G. I. A Whole Cell Biosensor bsed on Cell-Substrate Interactions. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 12, 500-501 (1990).
- Laevsky, G., Knecht, D. A. Cross-linking of actin filaments by myosin II is a major contributor to cortical integrity and cell motility in restrictive environments. J. Cell. Sci. 116, 3761-3770 (2003).
- Condeelis, J., Bresnick, A., Demma, M., Dharmawardhane, S., Eddy, R., Hall, A. L., Sauterer, R., Warren, V. Mechanisms of amoeboid chemotaxis: an evaluation of the cortical expansion. 11, 5-6 (1990).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31, 1130-1138 (2001).
- Hadjout, N., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurements of leukocyte chemotaxis. J. Immunol. Methods. 320, 70-80 (2007).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6, 21-21 (2005).
- Lundien, M. C., Mohammed, K. A., Nasreen, N., Tepper, R. S., Hardwick, J. A., Sanders, K. L., Van Horn, R. D., Antony, V. B. Induction of MCP-1 expression in airway epithelial cells: role of CCR2 receptor in airway epithelial injury. J. Clin. Immunol. 22, 144-152 (2002).
- Zudaire, E., Cuesta, N., Murty, V. The aryl hydrocarbon receptor repressor is a putative tumor suppressor gene in multiple human cancers. J. Clin. Invest. 118, 640-650 (2008).
- Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, 2625-269 (2009).
- Foxman, E. F., Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation. J. Cell. Biol. 147, 577-588 (1999).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J. Cell. Biol. 159, 91-102 (1999).
