여기에 제시된 직접 PCR의 접근 방식은 직접 unpurified 식물과 동물 조직의 작은 양의 PCR 증폭을 용이하게한다.
직접 PCR의 접근 방식은 직접 unpurified 샘플의 작은 양의 PCR 증폭을 용이하게하고, 여러 식물과 동물의 조직 (그림 1)은 여기를 증명하고 있습니다. 직접 PCR은 그들에게 이러한 억제제의 높은 내성 등의 고유 속성을 제공하는 이중 좌초 된 DNA 결합 도메인을 포함 특별히 설계 열 과학 Phusion 및 Phire의 DNA Polymerases에 따라 달라집니다.
PCR 기반 대상 DNA 검출은 공장 유전자형 분석 및 transgenes의 인증 등의 식물 연구에 많은 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 식물 조직에서 PCR은 전통적으로 고가 또는 독성 시약을 필요로 할 수 있습니다 초기 DNA 절연 단계를 포함한다. 이 과정은 많은 시간이 소요됩니다 및 교차 오염 1, 2의 위험을 증가시킵니다. 반대로, 열 과학 Phire 공장 직접 PCR 키트를 사용하여 대상 DNA 쉽게 전에 DNA 추출없이 검색 할 수 있습니다. 모델에서 여기 시연파생 흘리고 증폭 다형성 서열 분석 (dCAPS) 3,4의 예제는 Arabidopsis 식물 잎에서 직접 수행됩니다. dCAPS genotyping의 assays는 SNP allele 특정 제한 endonuclease의 소화 3 단일 염기 polymorphisms (SNPs)를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
일부 식물 샘플은 이러한 페놀 화합물 등의 PCR 방해 요소를 포함로 직접 PCR 방법을 사용하는 경우 더 많은 도전이 될 경향이 있습니다. 이러한 경우에는 화합물을 제거 할 추가 단계는 전통적으로 2,5 필요합니다. 여기,이 문제는 직접 PCR 증폭 (그림 1) 다음 빠르고 쉽게 희석 프로토콜을 사용하여 극복 할 수 있습니다. 표본이 tannins 등의 페놀 화합물의 높은 양의가 포함되어 열 다섯 살 참나무 잎은 어려운 식물의 모델로 사용됩니다.
마우스에 유전자 송금이 크게 develo의 유전자의 역할을 연구하는 데 사용됩니다pment, 생리학 및 인간 질병. 이 동물의 사용은 일반적으로 PCR과 함께 transgene의 존재에 대한 검사가 필요합니다. 전통적으로,이 귀, 꼬리 나 발가락 조직 6,7에서 정화되어 PCR 분석을위한 DNA되는 동안 시간이 소요 DNA 절연 단계를 포함한다. 그러나, 열 과학 Phire 동물의 조직 직접 PCR 키트 유전자 변형 마우스로 전에 DNA 정화없이 genotyped 할 수 있습니다. 이 프로토콜 유전자 변형 마우스 genotyping에서와 같이 하나의 프라이머 세트의 크기는 크게 서로 다른 두 조각의 증폭에 사용되는 도전 예를 들어 여기 시연, 마우스 귀 조직에서 직접 이루어집니다.
여기를 입증 직접 PCR의 접근 방법은 시간이 필요한 줄이고 식물과 동물의 genotyping (그림 7)의 워크 플로우를 간소화 직접 unpurified 샘플 소량의 PCR 증폭 할 수 있습니다. 또한 여기에 증명하면 직접 PCR 방식 (그림 3)와 함께 희석 프로토콜의 사용이다. 희석 프로토콜은 어려운 샘플 (화합물을 방해 포함 된 예를 들면 노인 식물 잎, 식물 종) 또는 긴 (또는 GC 풍부한) amplicons으로 권장합니다. 반응의 최적화를 허용하는 직접 PCR 실험을 시작할 때이 프로토콜은 특히 유용합니다. 프로토콜은 조직 물질 및 / 또는 사용 프리 머의 차이로 인해 낮은 제품 수율로 가끔씩 문제를 해결하기위한 도구로 제공 할 수 있습니다. 희석 프로토콜은 전체 샘플은 하나에서 소비되지 않은 보장에 또한, 동일한 샘플에서 여러 반응을 실행할 때 사용반응.
PCR을위한 식물에서 DNA를 정화하기 위해 대회는 잠재적으로 PCR 분석 8 영향을 줄 수 있습니다 다양한 구성 요소를 사용하여 DNA 절연 다음 세포 용해를 수행하는 것이 었습니다. 높은 페놀 콘텐츠, polyvinylpyrrolidone의 추가로, 특히 도전 식물 전통적으로 세포 용해 2,5에 따라 DNA에 바인딩 화합물을 제거하는 데 사용되었다. 분명 여기, 이러한 복잡하고, 시간이 많이 단계는 대상 DNA를 감지 할 수있는 Phire 공장 직접 PCR Kit의 사용을 통해 방지 할 수 있습니다. 세포 용해와 DNA의 분리 단계는 직접 Arabidopsis 식물 잎 (그림 2)에서 민감한 dCAPS 기술을 사용하여 생략 할 수 있습니다. 여기에 시연으로, 희석 프로토콜은 효율적으로 PCR (그림 3)를 방해 할 수 있습니다 문제가 구성 요소의 존재를 관리합니다.
전통적으로, 동물 genotyping에 대한 전제 조건은 isolati했습니다유기 용매 추출, 알코올 강수량, 그리고 원심 분리 단계 6,9,10 다음 피부와 결합 조직을 소화 할 수 proteinase K와 긴 부화 특징으로 독성, 시간이 소요되는 과정을 통해 동물의 조직에서 게놈 DNA의 있습니다. 여기를 시연,이 과정의 단순화는 유전자 변형 마우스는 이전에 DNA 정화 (그림 4)없이 genotyped 할 수 있도록, Phire 동물 조직 직접 PCR Kit의 사용을 통해 달성된다. 이 문서에서 보여준 예는 특히 하나의 프라이머 세트는 대형의 차이에 두 조각 증폭에 사용 된로 도전하고 있습니다. 프로토콜의 본래 어려움에도 불구하고, 간단한 희석 프로토콜은 두 PCR 제품 (그림 4)의 높은 수율의 결과와 함께 직접 PCR 방식 중 하나를 사용하십시오.
PCR 기반 대상 DNA 검출 식별 할 수 유전자형 분석 등의 연구에 많은 응용 프로그램이 있습니다개발, 생리학과 질병의 유전자의 역할. 전문의 DNA polymerases의 억제제 허용으로 인해, 프로토콜은 이전 DNA 정화없이 최소한의 시간에 완료 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
Arabidopsis 샘플 및 관련 PCR의 프리 머 위해 우리는 교수 Jaakko Kangasjärvi와 그의 그룹, 식물 스트레스 그룹 식물 생물학, Biosciences학과, 헬싱키 대학 감사드립니다. 기존의 방법의 실험은 부인의 Airi Lamminmäki에 의해 실시되었다.
유전자 변형 마우스 샘플은 박사 Jaana Vesterinen, 생물 의약 / 생화학 연구소, 헬싱키 대학에서 제공되었습니다.
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Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |