Die Direct PCR hier vorgestellte Ansatz ermöglicht PCR-Amplifikation direkt von kleinen Mengen von ungereinigten pflanzlichen und tierischen Gewebe.
Die Direct PCR Ansatz erleichtert PCR-Amplifikation direkt von kleinen Mengen von ungereinigten Proben, und wird hier seit mehreren pflanzlichen und tierischen Geweben (Abbildung 1) gezeigt. Direkte PCR wird auf speziell dazu entworfen Thermo Scientific Phusion und Phire DNA-Polymerasen, die eine Doppelstrang-DNA-Bindungsdomäne, die ihnen einzigartige Eigenschaften, wie hohe Toleranz von Inhibitoren umfassen basiert.
PCR-basierte Target-DNA-Nachweis hat zahlreiche Anwendungen in der Pflanzenforschung, einschließlich Pflanzen Genotyp-Analyse und Verifikation von Transgenen. PCR aus Pflanzengeweben traditionell beinhaltet eine erste DNA-Isolierung Schritt, die teuer oder toxischen Reagenzien erfordern. Das Verfahren ist zeitaufwendig und erhöht das Risiko der Kreuzkontamination 1, 2. Umgekehrt, indem Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit die Ziel-DNA kann leicht erkannt werden, ohne vorherige DNA-Extraktion. In dem Modell hier gezeigt, einBeispiel abgeleitet gespalten verstärkt polymorphe Sequenzanalyse (dCAPS) 3,4 direkt aus Arabidopsis-Pflanze Blätter durchgeführt. dCAPS Genotypisierung Assays können verwendet werden, um single nucleotide polymorphisms (SNPs) von SNP-Allel-spezifische Restriktionsendonukleaseverdau 3 zu identifizieren.
Einige pflanzliche Proben sind in der Regel schwieriger, wenn mit Direct PCR-Methoden, wie sie Komponenten, die mit PCR stören, wie Phenol-Verbindungen enthalten. In diesen Fällen ist ein zusätzlicher Schritt, um die Verbindungen zu entfernen traditionell 2,5 erforderlich. Hier wird dieses Problem durch eine schnelle und einfache Verdünnung Protokoll Direkte PCR-Amplifikation (Abbildung 1), gefolgt überwinden. Fünfzehn Jahre alte Eiche Blätter werden als Modell für anspruchsvolle Anlagen eingesetzt, wie die Probe enthält hohe Mengen an phenolischen Verbindungen, einschließlich Tanninen.
Gentransfer in Mäusen ist breit verwendet, um die Rolle von Genen bei entwickelte studierenpment, Physiologie und Erkrankungen des Menschen. Die Verwendung dieser Tiere erfordert Screenen auf die Anwesenheit des Transgens, üblicherweise mit PCR. Traditionell beinhaltet dies eine zeitaufwendige DNA Isolation Schritt, währenddessen die DNA für die PCR-Analyse von Ohr, Schwanz oder Zehe Geweben 6,7 gereinigt wird. Allerdings kann mit den Thermo Scientific Phire Tiergewebe Direkte PCR Kit transgenen Mäusen ohne vorherige DNA-Aufreinigung genotypisiert werden. In diesem Protokoll transgenen Maus Genotypisierung wird direkt von Mausohr Gewebe erreicht, wie hier für ein anspruchsvolles Beispiel, wo nur ein Primer für die Amplifikation von zwei Fragmente unterschiedlicher stark in Größe verwendet wird demonstriert.
Der direkte PCR-Ansatz hier gezeigt ermöglicht PCR-Amplifikation direkt von kleinen Mengen von ungereinigten Proben, wodurch die benötigte Zeit und vereinfacht den Workflow für pflanzliche und tierische Genotypisierung (Abbildung 7). Auch hier gezeigt, ist die Verwendung des Verdünnungs-Protokoll in Verbindung mit der direkten PCR Ansatz (Abbildung 3). Die Verdünnung Protokoll wird mit schwierigen Proben (z. B. ältere Blätter der Pflanze, Pflanzenarten, die störenden Verbindungen enthalten) oder mit langen (oder GC-reich) Amplikons empfohlen. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, wenn ein neues PCR-Experiment Direkte, so dass für die Optimierung der Reaktion. Das Protokoll kann als Werkzeug zur gelegentlichen Schwierigkeiten wie geringe Ausbeuten aufgrund der Unterschiede in Gewebematerial und / oder Primer verwendet adressieren dienen. Darüber hinaus, wenn Sie mehrere Reaktionen aus der gleichen Probe, die Verwendung von der Verdünnung Protokoll gewährleistet die gesamte Probe nicht in einer verbrauchtenReaktion.
Um DNA aus Pflanzen für die PCR zu reinigen, war die Konvention zur Zelllyse durch DNA-Isolierung mit verschiedenen Komponenten, die potenziell mit PCR-Analyse 8 stören könnten folgen durchzuführen. Für besonders anspruchsvolle Pflanzen mit hohem Gehalt an phenolischen Substanzen, Zusatz von Polyvinylpyrrolidon wurde traditionell verwendet, um die Verbindungen, die an DNA binden nach Zelllyse 2,5 entfernen. Wie hier deutlich, können diese komplizierte, zeitaufwendige Schritte durch Verwendung des Phire Plant Direct PCR Kit, um die Ziel-DNA zu erkennen vermieden werden. Zell-Lyse und DNA-Isolierung Schritte können ausgelassen mit empfindlicher dCAPS Techniken direkt aus Arabidopsis-Pflanze Blätter (Abbildung 2). Wie hier gezeigt, die Verdünnung Protokoll verwaltet effektiv das Vorhandensein von Komponenten, die mit problematischen PCR (Abbildung 3) eingreifen können.
Traditionell war eine Voraussetzung für die Tier-Genotypisierung isolatiauf genomischer DNA aus tierischem Gewebe durch einen toxischen, zeitaufwändiger Prozess durch einen langwierigen Inkubation mit Proteinase K bis Haut und Bindegewebe, durch organische Lösungsmittelextraktion, Alkoholfällung und Zentrifugationsschritte 6,9,10 gefolgt verdauen charakterisiert. Wie hier gezeigt, wird eine Vereinfachung des Prozesses, bei Verwendung des Phire Tiergewebe Direkt PCR Kit erzielt, so dass transgene Mäuse ohne vorherige DNA-Reinigung (Abb. 4) genotypisiert werden. Das Beispiel in diesem Artikel gezeigt wird besonders schwierig, da nur ein Primer für die Amplifikation von zwei Fragmenten wurde mit einer großen Größenunterschied verwendet. Trotz des Protokolls angeborenen Schwierigkeit der Direct PCR-Ansatz in Verbindung mit der einfachen Verdünnungsprotokoll in hohen Ausbeuten der beiden PCR-Produkte (Abb. 4) führte zu verwenden.
PCR-basierte Target-DNA-Nachweis hat viele Anwendungen in Forschung, einschließlich der Analyse des Genotyps zu identifizierendie Rollen von Genen in Entwicklung, Physiologie und Krankheiten. Aufgrund der Toleranz Inhibitor der spezialisierten DNA-Polymerasen können die Protokolle in kürzester Zeit ohne vorherige DNA-Aufreinigung erfolgen.
The authors have nothing to disclose.
Für die Arabidopsis Proben und den betroffenen PCR-Primer wir danken Professor Jaakko Kangasjärvi und seine Gruppe, die Pflanze Stress-Group, Plant Biology, Department of Biosciences, University of Helsinki. Die Experimente mit der traditionellen Methode wurden von Frau Airi Lamminmäki durchgeführt.
Transgene Maus Proben wurden durch Dr. Jaana Vesterinen, Institut für Biomedizin / Biochemie, Universität Helsinki vorgesehen.
Harris Uni-Core und Harris Cutting Mat sind Warenzeichen der Shunderson Communications Inc. Alle anderen Warenzeichen sind Eigentum von Thermo Fisher Scientific Inc. und ihrer Tochtergesellschaften.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |