Den direkte PCR strategi, der fremlægges her, letter PCR-amplifikation direkte fra små mængder af urenset plante-og animalsk væv.
Direct PCR strategi letter PCR-amplifikation direkte fra små mængder urensede prøver, og påvises her i flere vegetabilske og animalske væv (figur 1). Direkte PCR er baseret på specielt udviklet Thermo Scientific Phusion og Phire DNA-polymeraser, som omfatter en dobbeltstrenget DNA-bindende domæne, der giver dem unikke egenskaber såsom høj tolerance over for inhibitorer.
PCR-baseret mål-DNA påvisning har talrige anvendelser i anlæg forskning, herunder plante genotype analyse og efterprøvning af transgener. PCR fra plantevæv traditionelt omfatter et første DNA-isolering trin, der kan kræve kostbare eller toksiske reagenser. Fremgangsmåden er tidskrævende og forøger risikoen for krydskontaminering 1, 2. Omvendt, ved anvendelse af Thermo Scientific Phire Plant Direkte PCR Kit mål-DNA'et let kan detekteres, uden forudgående DNA-ekstraktion. I modellen vist her, eneksempel på afledt spaltet amplificeret polymorft sekvensanalyse (dCAPS) 3,4 udføres direkte fra Arabidopsis planteblade. dCAPS genotypebestemmelse assays kan anvendes til at identificere single nucleotide polymorphisms (SNP) efter SNP allelspecifik restriktionsendonucleasefordøjelse 3.
Nogle plante prøver tendens til at være mere udfordrende, når du bruger Direct PCR-metoder, da de indeholder komponenter, der interfererer med PCR, såsom phenolforbindelser. I disse tilfælde er et yderligere trin til fjernelse af forbindelserne traditionelt krævet 2,5. Her er dette problem overvindes ved at anvende en hurtig og let fortynding protokol efterfulgt af direkte PCR-amplifikation (figur 1). Femten år gamle egeblade bruges som model for udfordrende planter som prøven indeholder store mængder phenolforbindelser, herunder tanniner.
Genoverførsel til mus er bredt anvendt til at undersøge geners rolle i udvikpment, fysiologi og human sygdom. Anvendelsen af disse dyr kræver screening for tilstedeværelsen af transgenet, sædvanligvis med PCR. Traditionelt er dette involverer en tidskrævende DNA-isolering trin, hvor DNA for PCR-analyse oprenses fra øret, hale eller tå væv 6,7. Imidlertid kan med Thermo Scientific Phire dyrevæv direkte PCR Kit transgene mus skal genotypebestemmes uden forudgående DNA-oprensning. I denne protokol transgen mus genotypebestemmelse opnås direkte fra muse øres væv, som vist her for en udfordrende eksempel, hvor kun en primersæt anvendes til amplifikation af to fragmenter afviger meget i størrelse.
Den direkte PCR metode demonstreret her giver mulighed for PCR-amplifikation direkte fra små mængder af urenset prøver, hvilket reducerer den nødvendige tid og forenkle arbejdsgangen for planter og dyr genotypebestemmelse (fig. 7). Også vist her er anvendelsen af fortynding protokol i kombination med direkte PCR-fremgangsmåde (fig. 3). Fortyndings protokol anbefales med vanskelige prøver (f.eks alderen planteblade, plantearter, der indeholder interfererende forbindelser) eller med lange (eller GC-rig) ampliconer. Denne protokol er især nyttig, når en ny Direkte PCR-forsøg, der giver mulighed for optimering af reaktionen. Protokollen kan tjene som et redskab til at håndtere lejlighedsvis problemer såsom lavt produktudbytter grund af forskelle i vævsmateriale og / eller anvendte primere. Endvidere, når køre flere reaktioner fra den samme prøve, anvendelse af fortyndingen protokol sikrer hele prøven ikke forbruges på enreaktion.
For at oprense DNA fra planter til PCR, konventionen var at udføre cellelyse efterfulgt af DNA-isolering ved hjælp af forskellige komponenter, der potentielt kan interferere med PCR-analyse 8. For særligt udfordrende planter med højt fenolindhold, tilsætning af polyvinylpyrrolidon blev traditionelt anvendt til at fjerne de forbindelser, der binder til DNA efter cellelyse 2,5. Som det fremgår her, kan disse komplicerede, tidskrævende trin kan undgås ved anvendelse af Phire Plant Direkte PCR Kit til påvisning af mål-DNA. Cellelyse og DNA-isoleringstrin kan udelades ved hjælp af følsomme dCAPS teknikker direkte fra Arabidopsis blade (figur 2). Som påvist her, fortyn-protokol effektivt håndterer tilstedeværelsen af problematiske komponenter, som kan forstyrre PCR (figur 3).
Traditionelt er det en forudsætning for dyrs genotypebestemmelse var isolatiden af genomisk DNA fra dyrevæv gennem en toksisk, tidskrævende proces karakteriseret ved en langvarig inkubation med proteinase K for at nedbryde hud og bindevæv, efterfulgt af organisk opløsningsmiddel, alkoholpræcipitation og centrifugeringstrin 6,9,10. Som demonstreret her, er en forenkling af denne proces opnås ved anvendelse af Phire Animal Tissue Direkte PCR Kit, så transgene mus, der skal genotypebestemmes uden forudgående DNA-oprensning (figur 4). Eksemplet vist i denne artikel er særligt udfordrende som kun én primer sæt blev anvendt til amplificering af to fragmenter med en stor størrelsesforskel. Trods protokollen medfødte problemer, anvendelse af direkte PCR-fremgangsmåde i forbindelse med den simple fortynding protokol resulterede i høje udbytter af de to PCR-produkter (Figur 4).
PCR-baseret mål-DNA påvisning har mange anvendelser i forskning, herunder genotype analyse for at identificeregeners rolle i udvikling, fysiologi og sygdom. På grund af inhibitoren tolerance af de specialiserede DNA-polymeraser, kan protokollerne være afsluttet i minimal tid uden forudgående DNA-oprensning.
The authors have nothing to disclose.
For de Arabidopsis prøver og de berørte PCR primere vi takke professor Jaakko Kangasjärvi og hans gruppe, The Plant Stress Group, Plantebiologi, Institut for Biosciences, University of Helsinki. Forsøgene med den traditionelle metode blev udført af Mrs Airi Lamminmäki.
Transgene mus prøver blev leveret af Dr. Jaana Vesterinen, Institut for Biomedicin / Biokemi, University of Helsinki.
Harris Uni-Core og Harris Cutting Mat er varemærker tilhørende Shunderson Communications Inc. Alle andre varemærker ejes af Thermo Fisher Scientific Inc. og dets datterselskaber.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |