पिछले डीएनए शोधन के बिना संयंत्र और पशु नमूने की जीनोटाइपिंग

Summary

प्रत्यक्ष पीसीआर यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण unpurified संयंत्र और पशु ऊतक की छोटी मात्रा से सीधे पीसीआर प्रवर्धन की सुविधा है.

Abstract

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.

PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination^{1, 2}. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)^3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion³.

Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required^2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins.

Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues^6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

Protocol

1. प्रत्यक्ष प्रोटोकॉल साथ Arabidopsis प्लांट व्यक्तियों की जीनोटाइपिंग Arabidopsis संयंत्र पत्ते पर dCAPS जीनोटाइपिंग परख सीधे शुरू, पहले 20 या 50 μl पीसीआर Phire संयंत्र प्रत्यक्ष पीसीआर के रूप में तालिका 1 में वर्णित किट का उपयोग प्रतिक्रियाओं तैयार. अगले, एक 0.50 विश्वविद्यालय कोर हैरिस और हैरिस काटना चटाई का उपयोग कर एक Arabidopsis संयंत्र पत्ती से मिमी पंच में कटौती. छेदने का शस्र मजबूती से पकड़े हुए, ऊतक में अत्याधुनिक प्रेस और आगे और पीछे से रोटेट छिद्रकार. सवार प्रेस एक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण में पंच डिस्क बेदखल. सुनिश्चित करें कि नमूना पीसीआर समाधान में चला जाता है और ट्यूब दीवारों के लिए छड़ी नहीं करता. प्रत्येक नमूना बीच छिद्रकार के काटने के किनारे करने के लिए यह 2% NaClO समाधान में सूई से पार प्रदूषण को रोकने के लिए साफ. सवार प्रेस और नीचे एक बार कुछ और एक साफ कागज तौलिया के साथ काटने के किनारे पोंछे. काटने चटाई भी होना चाहिएनमूने के बीच rinsed. अगले, एक थर्मो वैज्ञानिक रोजगार Piko 24-Cycler और थर्मो वैज्ञानिक Piko पीसीआर प्लेट पीसीआर साइकिल तालिका 2 में वर्णित शर्तों का उपयोग प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए थर्मल. पीसीआर प्रतिक्रियाओं भी पारंपरिक पीसीआर थर्मल cyclers में प्रदर्शन किया जा सकता है. पीसीआर के बाद, नीचे संयंत्र सामग्री स्पिन. एक नया microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला के 5 μl. पानी के 4 μl और प्रतिबंध एंजाइम, SSPI 1 μl जोड़ें. धीरे मिक्स और नीचे संक्षिप्त स्पिन करने के लिए ट्यूब के नीचे सामग्री एकत्र. 37 पर एक घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेते डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा प्रतिबंध एंजाइम निष्क्रिय. जब डीएनए संयंत्र के ऊतकों से सीधे amplifying, पीसीआर उत्पादों संयंत्र और पीसीआर व्युत्पन्न घटक है कि प्रतिबंध पाचन एंजाइम के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं शामिल हैं. इसलिए, यह आवश्यक हो सकता है या तो (जैसे 1:02 या 1:03 पानी में) जलमिश्रित या टी पहले पीसीआर उत्पाद को शुद्ध कर सकते हैंउन्होंने उदाहरण के लिए बाद, थर्मो वैज्ञानिक GeneJET पीसीआर शोधन किट के रूप में इस तरह के एक उपयुक्त वाणिज्यिक किट का उपयोग कर से पाचन. प्रतिबंध एंजाइम पाचन के बाद, जिसके परिणामस्वरूप एक agarose जेल पर टुकड़े का विश्लेषण. प्रतिक्रिया के लिए 5x लोडिंग बफर के 2.5 μl जोड़ें और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन परिणामस्वरूप मिश्रण के 10 μl के साथ करते हैं. 2. 15 वर्षीय ओक से विशिष्ट डीएनए टुकड़े amplifying मन्दन प्रोटोकॉल का उपयोग पत्तियां शुरू करने के लिए, ओक पत्ती के 2 मिमी पंच में कटौती. मन्दन Phire संयंत्र प्रत्यक्ष पीसीआर किट के साथ आपूर्ति की बफर के 20 μl में नमूना रखें. साफ छिद्रकार की धार और पहले के रूप में चटाई काटने. संक्षेप में यह ट्यूब की दीवार के खिलाफ दबाकर एक 100 μl विंदुक टिप के साथ पत्ता नमूना क्रश. संयंत्र सामग्री पर निर्भर करता है, कभी कभी कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल नमूना कुचल बिना बेहतर काम करता है. टी जब तक एक microcentrifuge में नमूने संक्षेप में स्पिनवह प्रतिक्रियाओं ट्यूबों के तल में हैं. तैरनेवाला पीसीआर में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है, या यह 1:10 या बाँझ पानी में 1:100 पतला किया जा सकता है नमूना प्रकार पर निर्भर करता है. या एक 20 μl पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सतह पर तैरनेवाला और कमजोर पड़ने की 1 μl 0.5 μl का प्रयोग करें. प्रतिक्रिया तैयार तालिका 1 में वर्णित के रूप में. एक बार प्रतिक्रियाओं तैयार कर रहे हैं, एक थर्मो वैज्ञानिक रोजगार Piko 24-Cycler और थर्मो वैज्ञानिक Piko पीसीआर प्लेट पीसीआर साइकिल तालिका 2 में वर्णित शर्तों का उपयोग प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए थर्मल. पीसीआर प्रतिक्रियाओं भी पारंपरिक पीसीआर थर्मल cyclers में प्रदर्शन किया जा सकता है. पीसीआर के बाद, प्रतिक्रिया 5x लोडिंग बफर के 5 μl जोड़ने और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन परिणामस्वरूप मिश्रण के 15 μl के साथ करते हैं. 3. ट्रांसजेनिक मन्दन प्रोटोकॉल का उपयोग चूहे की जीनोटाइपिंग ट्रांसजेनिक चूहों पर कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल मीटर की 2 मिमी पंच रखने शुरू करोमन्दन DNARelease Phire पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट के साथ आपूर्ति Additive के 0.5 μl युक्त बफर के 20 μl में ouse कान. 2 मिनट, 98 में 2 मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा किया डिग्री सेल्सियस के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सेते नमूने संक्षेप में एक microcentrifuge में स्पिन प्रतिक्रियाओं ट्यूबों के तल में हैं जब तक. तैयार तालिका 3 में वर्णित के रूप में एक 20 μl पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में सतह पर तैरनेवाला के 1 μl का प्रयोग करें. किसी भी सतह पर तैरनेवाला है कि नहीं होना चाहिए तुरंत इस्तेमाल एक नया ट्यूब के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अगले, एक थर्मो Piko 24-अच्छी तरह से थर्मल cycler और थर्मो वैज्ञानिक Piko पीसीआर प्लेट वैज्ञानिक पीसीआर साइकिल तालिका 4 में वर्णित शर्तों का उपयोग प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए रोजगार. फिर, पीसीआर प्रतिक्रियाओं भी पारंपरिक पीसीआर cyclers में प्रदर्शन किया जा सकता है. पीसीआर के बाद, प्रतिक्रिया 5x लोडिंग बफर के 5 μl जोड़ने और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन w प्रदर्शनपरिणामस्वरूप मिश्रण के ith 15 μl. 4. प्रतिनिधि परिणाम DCAPS तकनीक में ब्याज की SNP भीतर प्रतिबंध साइट शुरू की है या एक या एक से अधिक लक्ष्य डीएनए बेमेल के साथ एक प्राइमर पीसीआर का उपयोग कर नष्ट कर दिया है. Arabidopsis संयंत्र व्यक्तियों की जीनोटाइपिंग पत्ती घूंसे से सीधे dCAPS तकनीक के साथ प्रदर्शन किया गया था. प्रवर्धित उत्पादों पचा किया गया और जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक व्यक्ति के जीनोटाइप खुलासा टुकड़े जेल वैद्युतकणसंचलन (2 चित्रा) से विश्लेषण किया गया. इस उदाहरण में, 160 बीपी पीसीआर Arabidopsis जीनोम में ब्याज की SNP साइट (जी या एक एलील) युक्त उत्पादों संयंत्र पत्ती घूंसे से Phire संयंत्र प्रत्यक्ष पीसीआर किट के साथ परिलक्षित किया गया. आगे प्राइमर 3 'के अंत में एक बेमेल निहित है, डीएनए लक्ष्य एक SSPI विशिष्ट प्रतिबंध साइट है, जो ब्याज की SNP (एक एलील), लेकिन नहीं बनानेSNP (चित्रा 2B) के अन्य एलील में. मन्दन प्रोटोकॉल ओक पत्ती जैसे चुनौतीपूर्ण संयंत्र सामग्री, phenolic यौगिकों के उच्च एकाग्रता के कारण के लिए आवश्यक हैं. कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल का प्रयोग यहाँ वर्णित, 297 chloroplastic डीएनए के बीपी टुकड़ा 3 कदम प्रोटोकॉल का उपयोग प्रवर्धित किया गया था. सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के अलावा, ओक विभिन्न dilutions के साथ पत्ता नमूनों 3 चित्र में दिखाया जाता है. Phire पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट एक चुनौतीपूर्ण प्रोटोकॉल जहां केवल एक प्राइमर सेट दो टुकड़े के प्रवर्धन के लिए एक बड़े आकार के अंतर के साथ इस्तेमाल किया गया था, के लिए ट्रांसजेनिक चूहों के लिए 1,500 बीपी और 200 बीपी के दोनों सही आकार उत्पादों के प्रचुर मात्रा में पैदावार में जिसके परिणामस्वरूप के साथ नियुक्त किया गया था जंगली प्रकार चूहों (4 चित्रा). कमजोर विषम युग्मज चूहों के साथ ऊपरी बैंड समान प्राइमर जोड़ी के लिए दोनों टेम्पलेट्स (alleles) की प्रतिस्पर्धा की वजह से है, तथापि, genotypआईएनजी परिणाम सुस्पष्ट हैं. कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार नमूनों की स्थिरता भी परीक्षण किया गया था. परिणाम बताते हैं कि कमजोर पड़ने के नमूने -20 डिग्री सेल्सियस में कम से कम एक वर्ष के लिए भंडारित किया जा सकता है. इसके अलावा, दोहराया स्थिर / गल चक्र काफी प्रतिक्रिया (5 चित्रा) को प्रभावित नहीं किया था. इसके अलावा माउस कान ऊतक Phire डीएनए पोलीमरेज़ और प्रत्यक्ष पीसीआर गर्म शुरू Taq पोलीमरेज़ और शुद्ध डीएनए (6 चित्रा) की तुलना में विधि का उपयोग कर के नमूनों से मजबूत प्रवर्धन दिखाया गया है. अवयव 20 μl प्रतिक्रिया 50 μl प्रतिक्रिया अंतिम सान्द्र. एच 2 हे 20 μl जोड़ें 5 करने के लिए जोड़0 μl 2x Phire संयंत्र पीसीआर बफर 10 μl 25 μl 1x एक प्राइमर Μl एक्स Μl एक्स 0.5 सुक्ष्ममापी प्राइमर बी Μl एक्स Μl एक्स 0.5 सुक्ष्ममापी Phire गर्म प्रारंभ द्वितीय डीएनए पोलीमरेज़ 0.4 μl 1 μl नमूना / प्रत्यक्ष प्रोटोकॉल 0.50 मिमी पंच नमूना / प्रोटोकॉल कमजोर पड़ने 0.5-1 μl तालिका 1. संयंत्र के लिए पीसीआर रिएक्शन की स्थिति इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. साइकिल चरण अस्थायी. समय साइकिल प्रारंभिक विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट 1 Denaturing * एनीलिंग विस्तार 98 डिग्री सेल्सियस एक्स ° C 72 डिग्री सेल्सियस 5 सेकंड 5 सेकंड 20 सेकंड 40 अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट पकड़ 1 तालिका 2 संयंत्र के लिए पीसीआर साइकिल की स्थिति इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. * Tm में कैलकुलेटर"लक्ष्य =" / oscientific.com pcrwebtools> www.thermoscientific.com / pcrwebtools _blank "जब Phire गर्म प्रारंभ डीएनए पोलीमरेज़ द्वितीय के साथ प्रयोग किया जा प्राइमरों के लिए Tm का निर्धारण करने की सिफारिश की है प्राइमरों के लिए सिफारिश की annealing तापमान ≤ 20 NT करने के लिए बराबर है. कम webtool द्वारा दिए गए Tm प्राइमरों> 20 NT के लिए, एक annealing तापमान 3 डिग्री सेल्सियस कम webtool द्वारा दिए गए Tm की तुलना में अधिक है. अवयव 20 μl प्रतिक्रिया अंतिम सान्द्र. एच 2 हे 20 μl जोड़ें 2x Phire पशु ऊतक पीसीआर बफर 10 μl 1x एक प्राइमर Μl एक्स 0.5 सुक्ष्ममापी प्राइमर बी Μl एक्स 0.5 सुक्ष्ममापी पीएचडीगुस्सा गर्म प्रारंभ द्वितीय डीएनए पोलीमरेज़ 0.4 μl नमूना / प्रोटोकॉल कमजोर पड़ने 1 μl टेबल पशु ऊतक पीसीआर के लिए 3. प्रतिक्रिया की स्थिति इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. साइकिल चरण अस्थायी. समय साइकिल प्रारंभिक विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट 1 Denaturing * एनीलिंग विस्तार 98 डिग्री सेल्सियस एक्स ° C 72 डिग्री सेल्सियस 5 सेकंड 5 सेकंड 20 सेकंड ≤ 1 केबी 20 सेकंड /> 1 केबी केबी 40 अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट पकड़ 1 तालिका 4 पशु ऊतक पीसीआर के लिए साइकल चलाना शर्तों इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. * Tm कैलकुलेटर / www.thermoscientific.com pcrwebtools जब Phire गर्म प्रारंभ डीएनए पोलीमरेज़ द्वितीय के साथ प्रयोग किया जा प्राइमरों के लिए Tm का निर्धारण करने की सिफारिश की है. ≤ 20 NT के प्राइमरों के लिए सिफारिश की annealing तापमान कम webtool द्वारा दिए गए Tm के बराबर है. प्राइमरों> 20 NT के लिए, एक annealing तापमान 3 डिग्री सेल्सियस कम Tm webtool द्वारा दिए गए की तुलना में अधिक है. चित्रा 1. प्रत्यक्ष पीसीआर कार्यप्रवाह प्रत्यक्ष पीसीआर दो वैकल्पिक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है. प्रत्यक्ष प्रोटोकॉल में नमूना की एक छोटी राशि सीधे पीसी के लिए जोड़ा जाता हैप्रतिक्रिया आर. पीसीआर से पहले कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल एक संक्षिप्त कदम पूर्व ऊष्मायन नमूना सामग्री से डीएनए जारी कार्यरत हैं. चित्रा 2. DCAPS तकनीक के साथ Arabidopsis संयंत्र व्यक्तियों के सीधे जीनोटाइपिंग पत्ती घूंसे से. ए) चित्रा 2A dCAPS परख के सिद्धांत से पता चलता है प्रदर्शन. ब्याज की SNP भीतर प्रतिबंध साइट या शुरू की है डीएनए लक्ष्य के लिए एक या अधिक बेमेल के साथ एक प्राइमर का उपयोग पीसीआर द्वारा हटा दिया. पीसीआर उत्पादों और पचा रहे हैं जिसके परिणामस्वरूप टुकड़े प्रत्येक व्यक्ति के जीनोटाइप से पता चलता है जब वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण बी.) 0.50 संयंत्र के पत्तों से मिमी घूंसे सीधे 50 μl पीसीआर प्रतिक्रियाओं में रखा गया है. 160 बीपी पीसीआर SNP साइट (जी या एक एलील) युक्त उत्पादों प्राइमरों एक एलील एक अद्वितीय SSPI साइट शुरू करने के साथ परिलक्षित किया गया. unpurified पीसीआर उत्पादों diges थेटेड SSPI प्रतिबंध एंजाइम के साथ. परिणामस्वरूप टुकड़े 3% agarose जेल पर विश्लेषण किया गया. लेन एम आकार मार्कर है, गलियों एक और जी प्रत्येक नमूने की SNP alleles के अनुरूप. प्राप्त परिणामों डीएनए निष्कर्षण के पारंपरिक विश्लेषण पीसीआर और प्रतिबंध पाचन (नहीं दिखाया डेटा) द्वारा पीछा द्वारा पुष्टि की गई है. टेम्पलेट डीएनए बिना नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं सेट अप परीक्षण में शामिल थे और digestions (नहीं दिखाया डेटा) के प्रदर्शन से पहले वास्तविक पीसीआर प्रतिक्रियाओं के साथ समानांतर में एक अलग agarose जेल पर चला. चित्रा 3. मन्दन प्रोटोकॉल ओक पत्ता नमूने का उपयोग करते हुए कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल अलग dilutions में 297 chloroplastic डीएनए के ओक पत्ता नमूने (3 कदम प्रोटोकॉल, 62 डिग्री सेल्सियस पर annealing) में बीपी टुकड़ा बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (1:100, 1:10, 1. : 1 और 2:1) और सकारात्मक और नकारात्मक चुनावtrols [सी +: सी: कोई टेम्पलेट डीएनए के साथ नकारात्मक नियंत्रण शुद्ध (Arabidopsis) डीएनए से सकारात्मक नियंत्रण]. नमूना नामकरण नमूना संग्रह (फिनलैंड में शहरों) साइट और नंबरिंग नमूना का प्रतिनिधित्व करता है. चित्रा 4. कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक प्राइमर जोड़ी के साथ ट्रांसजेनिक चूहों की जीनोटाइपिंग नौ व्यक्तिगत चूहों (1-9 गलियों) के कान के ऊतकों. मन्दन DNARelease Additive सहित बफर के 20 μl में रखा गया. कमरे के तापमान पर incubations के बाद और 98 डिग्री सेल्सियस, तैरनेवाला के 1 μl 20 μl पीसीआर प्रतिक्रिया में एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था. Fragment आकार: 1,500 (ट्रांसजेनिक) बीपी और 200 बीपी (wildtype). चित्रा 5. नमूने कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार दीर्घकालिक भंडारण के लिए स्थिर रहे हैं. माउस कान ऊतकों के नमूने inc थे मन्दन DNARelease Additive सहित बफर के 20 μl में ubated और दोहराया ठंड / विगलन (1 लेन) के लिए किया जाता है, एक साल (2 लेन) के लिए ° -20 सी में संग्रहीत, या पीसीआर (3 लेन) के लिए तुरंत इस्तेमाल किया. प्रवर्धित टुकड़ा आकार 900 बीपी, 1500 बीपी और 3200 बीपी थे. 6 चित्रा. Phire पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट एक वाणिज्यिक डीएनए एक गर्म शुरू Taq डीएनए पोलीमरेज़ के साथ संयुक्त शोधन प्रणाली outperforms चार amplicons (0.5-1.5 केबी) माउस कान Phire पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट के कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल का उपयोग ऊतकों से परिलक्षित किया गया. तुलना के लिए, डीएनए पहले एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर शुद्ध किया गया था और एक ही टुकड़े 'निर्माताओं की सिफारिशों के अनुसार एक गर्म शुरू Taq डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग प्रवर्धित थे. Phire पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट के साथ ही सभी चार सफलतापूर्वक प्रवर्धित amplicons थे. "टी> चित्रा 7. बार / भस्म अभिकर्मकों. के आकलन के साथ कार्यप्रवाह के यूनिवर्सल तुलना थर्मो वैज्ञानिक प्रत्यक्ष पीसीआर दृष्टिकोण डीएनए अलगाव दृष्टिकोण, निष्कर्षण बफर दृष्टिकोण, और पीसीआर बफर दृष्टिकोण की तुलना में है. पीसीआर कदम से पहले प्रत्येक दृष्टिकोण के लिए अनुमानित समय लाल पाठ में सूचीबद्ध है. थर्मो वैज्ञानिक प्रत्यक्ष पीसीआर दृष्टिकोण नमूना पीसीआर पूर्व तैयारी के लिए केवल 0-4 मिनट लगते हैं. प्रत्येक विधि के नीचे, भस्म अभिकर्मकों सूचीबद्ध हैं. थर्मो वैज्ञानिक प्रत्यक्ष पीसीआर दृष्टिकोण अभिकर्मकों के अन्य तरीकों की तुलना में कम से कम राशि का उपयोग करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

प्रत्यक्ष पीसीआर का प्रदर्शन यहां दृष्टिकोण unpurified नमूनों की छोटी मात्रा से सीधे पीसीआर प्रवर्धन के लिए अनुमति देता है, कम समय की जरूरत है और पौधे और पशु जीनोटाइपिंग (7 चित्रा) के लिए वर्कफ़्लो को सरल बनाने. इसके अलावा यहाँ का प्रदर्शन प्रत्यक्ष पीसीआर दृष्टिकोण (चित्रा 3) के साथ संयोजन में कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल का उपयोग है. कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल मुश्किल नमूने (जैसे आयु वर्ग के संयंत्र पत्ते, संयंत्र प्रजातियों कि हस्तक्षेप यौगिकों होते हैं) के साथ या लंबे समय के amplicons (या जीसी – अमीर) के साथ की सिफारिश की है. इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोगी है जब एक नया प्रत्यक्ष पीसीआर प्रयोग शुरू, प्रतिक्रिया के अनुकूलन के लिए अनुमति देता है. प्रोटोकॉल एक कम उत्पाद ऊतक सामग्री और / या इस्तेमाल किया प्राइमरों में मतभेद के कारण पैदावार के रूप में कभी कभी कठिनाइयों को संबोधित करने के लिए एक उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं. इसके अलावा, जब एक ही नमूना से कई प्रतिक्रियाओं चल रहे हैं, के कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल का उपयोग सुनिश्चित करता है पूरे नमूना एक में नहीं भस्म हो जाता हैप्रतिक्रिया.

आदेश में पीसीआर के लिए पौधों से डीएनए को शुद्ध करने के लिए, सम्मेलन डीएनए अलगाव का उपयोग कर विभिन्न घटकों है कि संभावित पीसीआर ⁸ विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है के द्वारा पीछा करने के लिए सेल lysis प्रदर्शन था. उच्च phenolic सामग्री, polyvinylpyrrolidone के अलावा के साथ विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण संयंत्रों के लिए पारंपरिक यौगिकों कि सेल lysis ^2,5 के बाद डीएनए के लिए बाध्य को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. स्पष्ट यहाँ के रूप में, इन जटिल, समय गहन कदम Phire संयंत्र प्रत्यक्ष पीसीआर किट का उपयोग करने के लिए लक्ष्य डीएनए का पता लगाने के माध्यम से बचा जा सकता है. सेल और डीएनए अलगाव कदम Arabidopsis संयंत्र के पत्तों (2 चित्रा) से सीधे संवेदनशील dCAPS तकनीक का उपयोग कर छोड़ा जा सकता है. जैसा कि यहाँ का प्रदर्शन, कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से समस्याग्रस्त घटक है कि पीसीआर (3 चित्रा) के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं की उपस्थिति का प्रबंधन.

परंपरागत रूप से, पशु जीनोटाइपिंग के लिए एक शर्त isolatiएक जहरीले, समय लेने वाली त्वचा और संयोजी ऊतक, कार्बनिक विलायक निष्कर्षण, शराब वर्षण की संभावना है, और centrifugation ^6,9,10 चरणों का पीछा पचा ​​proteinase कश्मीर के साथ एक लंबी ऊष्मायन द्वारा विशेषता प्रक्रिया के माध्यम से पशु ऊतक से जीनोमिक डीएनए के. यहाँ के रूप में प्रदर्शन किया, इस प्रक्रिया के सरलीकरण Phire पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट के प्रयोग के माध्यम से हासिल की है, ट्रांसजेनिक चूहों पूर्व डीएनए शुद्धि (4 चित्रा) के बिना genotyped करने के लिए अनुमति देता है. इस लेख में प्रदर्शन उदाहरण विशेष रूप से चुनौती दे रहा है, के रूप में केवल एक प्राइमर सेट दो टुकड़े के प्रवर्धन के लिए एक बड़े आकार के अंतर के साथ इस्तेमाल किया गया था. प्रोटोकॉल जन्मजात कठिनाई के बावजूद, के साथ संयोजन के रूप में प्रत्यक्ष पीसीआर दृष्टिकोण सरल कमजोर पड़ने प्रोटोकॉल दो पीसीआर उत्पादों (4 चित्रा) की उच्च पैदावार में उपयोग करें.

पीसीआर आधारित लक्ष्य डीएनए का पता लगाने के अनुसंधान में कई आवेदन किया है जीनोटाइप की पहचान करने के लिए विश्लेषण सहित,विकास, शरीर विज्ञान, और बीमारी में जीन की भूमिका. विशेष डीएनए पीसीआर की अवरोध करनेवाला सहिष्णुता के कारण, प्रोटोकॉल पूर्व डीएनए की शुद्धि के बिना कम से कम समय में पूरा किया जा सकता है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Phire Plant Direct PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F-130	200 reactions (50 μl each)
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	F-140	200 reations (50 μl each)
Harris Uni-Core 0.35 mm (pink)	Thermo Fisher Scientific	F-180S/L	Qty: 5/25
Harris Uni-Core 0.50 mm (blue)	Thermo Fisher Scientific	F-185S/L	Qty: 5/25
Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm	Thermo Fisher Scientific	F-190	Qty: 5
SspI	Thermo Fisher Scientific	ER0771	100 μl (100 reactions)
Piko 24-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	TCP0024
24-Well Piko PCR Plates	Thermo Fisher Scientific	SLP0241
GeneJET PCR Purification Kit	Thermo Fisher Scientific	K0701 K0702	50 preps 250 preps