Direct PCR metod som presenteras här underlättar PCR-amplifiering direkt från små mängder orenat växter och djur vävnad.
Direct PCR-tillvägagångssätt underlättar PCR-amplifiering direkt från små mängder av orenade prover, och visas här för flera växt-och djur-vävnader (figur 1). Direkt PCR är baserad på speciellt framtagna Thermo Scientific Phusion och Phire DNA-polymeraser, som inkluderar ett dubbelsträngat DNA-bindande domän som ger dem unika egenskaper såsom hög tolerans av inhibitorer.
PCR-baserad mål-DNA upptäckt har många tillämpningar inom växtforskning, däribland anläggningar genotyp analys och verifiering av transgener. PCR från växtvävnader innebär traditionellt ett första steg DNA-isolering, vilket kan kräva dyra eller giftiga reagenser. Processen är tidsödande och ökar risken för korskontaminering 1, 2. Omvänt, genom att använda Thermo Scientific Phire Plantera direkt PCR Kit mål-DNA kan lätt upptäckas utan föregående DNA-extraktion. I modellen visas här, ettexempel på härledda förstärkt klyvd polymorf sekvensanalys (dCAPS) 3,4 sker direkt från Arabidopsis växtblad. dCAPS genotypningsförfaranden analyser kan användas för att identifiera enskilda nukleotidpolymorfismer (SNP) efter SNP allelspecifik restriktionsendonukleasdigestion 3.
Vissa växtprover tenderar att vara mer utmanande när du använder direkt PCR metoder eftersom de innehåller komponenter som stör PCR, såsom fenolföreningar. I dessa fall är ett ytterligare steg för att ta bort de föreningar som traditionellt krävs 2,5. Här, är detta problem övervinnas genom användning av en snabb och enkel utspädning protokollet följt av direkt PCR-amplifiering (figur 1). Femton år gamla eklöv används som modell för utmanande växter provet innehåller höga halter av fenolföreningar inklusive tanniner.
Genöverföring till möss i stort sett används för att studera rollerna gener i utveckngen, fysiologi och sjukdomar hos människor. Användningen av dessa djur kräver screening av förekomsten av transgenen, vanligtvis med PCR. Traditionellt innebär detta ett tidsödande steg DNA-isolering, under vilken DNA för PCR-analys renas från öra, svans eller tå vävnader 6,7. Däremot kan de Thermo Scientific Phire djurvävnad direkt PCR Kit transgena möss genotypas utan föregående DNA-rening. I detta protokoll transgen mus genotypning uppnås direkt från vävnader musöra, såsom visas här för en utmanande exempel där endast en primeruppsättning användes för amplifiering av två fragment skiljer mycket i storlek.
Direct PCR metoden visade här tillåter PCR-amplifiering direkt från små mängder orenade prover, vilket minskar den tid som behövs och förenkla arbetsflödet för växter och djur genotypning (Figur 7). Också visat här är användningen av den spädning protokollet i kombination med Direct PCR-metoden (figur 3). Utspädningen protokoll rekommenderas med svåra prov (t.ex. äldre växtblad, växtarter som innehåller störande föreningar) eller med långa (eller GC-rika) amplikoner. Detta protokoll är särskilt användbar när man startar en ny Direkt PCR-experiment, vilket möjliggör optimering av reaktionen. Protokollet kan fungera som ett verktyg för att hantera tillfälliga svårigheter som låga produktutbyten grund av skillnader i vävnadsmaterial och / eller använda primers. Dessutom när du kör flera reaktioner från samma prov, användning av utspädning protokoll säkerställs hela provet inte konsumeras i enreaktion.
För att rena DNA från växter för PCR var konventionen för att utföra cellys följt av DNA-isolering med olika komponenter som skulle kunna störa PCR-analys 8. För särskilt krävande växter med hög fenol innehåll, tillägg av polyvinylpyrrolidon var traditionellt används för att ta bort de föreningar som binder till DNA efter cellys 2,5. Som framgår här kan dessa komplicerade, tidskrävande steg undvikas genom användning av Phire växt direkt PCR Kit för att detektera mål-DNA. Cellys och DNA steg isolering kan utelämnas med användning av känsliga dCAPS tekniker direkt från Arabidopsis växtblad (figur 2). Som visas här, hanterar utspädning protokollet effektivt förekomsten av problematiska komponenter som kan störa PCR (Figur 3).
Traditionellt var en förutsättning för djur genotypning isolatipå av genomiskt DNA från djurvävnad genom en giftig, tidskrävande process som kännetecknas av en lång inkubation med proteinas K för att smälta hud och bindväv, följt av organiskt lösningsmedelsextraktion, alkoholutfällning, och steg centrifugeringssteg 6,9,10. Såsom visas här, är förenkling av denna process uppnås genom användning av Phire djurvävnaden Direkt PCR-kit, vilket transgena möss skall genotypas utan föregående DNA-rening (figur 4). Exemplet visat i denna artikel är speciellt utmanande då endast en primeruppsättning användes för amplifiering av två fragment med en stor storleksskillnad. Trots att protokollet medfödda svårigheter, användning av direkt PCR metoden i samband med enkla utspädning protokollet resulterade i höga utbyten av de två PCR-produkterna (Figur 4).
PCR-baserad mål-DNA upptäckt har många tillämpningar inom forskning, inklusive genotyp analys för att identifieraroller gener i utveckling, fysiologi och sjukdomar. På grund av inhibitorn tolerans av specialiserade DNA-polymeraser, kan protokollen fyllas i minimal tid utan föregående DNA-rening.
The authors have nothing to disclose.
För Arabidopsis prover och de berörda PCR primers vi tackar professor Jaakko Kangasjärvi och hans grupp, The Plant Stress Group Växtbiologi, Institutionen för biovetenskaper vid Helsingfors universitet. Experimenten med den traditionella metoden utfördes av Mrs Airi Lamminmäki.
Transgen mus prover från Dr Jaana Vesterinen, institutionen för biomedicin / biokemi vid Helsingfors universitet.
Harris Uni-Core och Harris skärmatta är varumärken som tillhör Shunderson Communications Inc. Alla andra varumärken tillhör i Thermo Fisher Scientific Inc. och dess dotterbolag.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |