Summary
שיטה immunostain ולדמיין איברים chordotonal ב זחלים וגלמים של
Abstract
הפרופריוספציה היא היכולת לחוש את התנועה, או מיקום של חלקי הגוף על ידי להגיב לגירויים שמקורם בתוך הגוף. בפריזבוב וחרקים אחרים הפרופריוספציה מסופק על ידי אברי החישה מיוחדות המכונות איברים chordotonal (ChOs) 2. כמו איברים רבים אחרים תסיסנית, ChOs לפתח פעמיים במהלך מחזור החיים של הזבוב. ראשית, ChOs הזחל לפתח במהלך embryogenesis. לאחר מכן, את ChOs מבוגרים מתחילים להתפתח הדיסקים דמותי הזחל ולהמשיך להבדיל במהלך המטמורפוזה.
הפיתוח של ChOs הזחל במהלך embryogenesis נחקרה בהרחבה 10,11,13,15,16. במרכזו של כל צ'ו היא יחידה חושית המורכבת נוירון ו תא scolopale. היחידה החושית נמתח בין שני סוגים של תאים אביזר זה לצרף לציפורן באמצעות תאים מיוחדים התקשרות אפידרמיס 1,9,14. כאשר זחל זבוב מהלכים, תזוזה יחסית של דוארתאים מצורפים pidermal מוביל מתיחה של יחידת חושי פתיחת הסוגר של ספציפיים חולפים פוטנציאליים הקולטן vanilloid (TRPV) ערוצים בקטע החיצוני של 8,12 דנדריט. האות עורר הוא הועבר לאחר מכן במעגל מחולל מרכזי של תנועה דפוס במערכת העצבים המרכזית.
ChOs מספר תוארו הזבוב הבוגר 7. אלה ממוקמים ליד המפרקים של הנספחים זבובים בוגרים (רגליים, כנפיים מטפחת) והן בית החזה והבטן. בנוסף, כמה מאות ChOs ביחד ליצור איברים של ג'ונסטון אנטנה הבוגרת כי אקוסטית transduce לאנרגיה מכנית 3,5,17,4.
בניגוד ידע רב על התפתחות ChOs בשלבים עובריים, מעט מאוד ידוע על המורפולוגיה של איברים אלה בשלבי הזחל. יתר על כן, למעט ChOs הירך 18 ועוגב של ג'ונסטון, knowled שלנוGE על התפתחות ומבנה ChOs של הזבוב הבוגר הוא חלקי מאוד.
כאן אנו מתארים שיטה מכתים באופן חזותי ChOs ב זחלים וגלמים instar השלישי. שיטה זו יכולה להיות מיושם יחד עם כלים גנטיים כדי לאפיין טוב יותר את המורפולוגיה ולהבין את התפתחותם של ChOs שונים לטוס.
Protocol
לפני שתתחיל
- לגדול התרבויות לטוס הרצויות. שמור את צלוחיות צפופות (כ 30 זבובים בכל בקבוקון 50 מ"ל). בואו הזבובים להטיל ביצים ליום אחד בלבד בבקבוקון אחד. זה יספק היצע מספיק זחלי המזון ולאפשר להם להגיע לגודל מקסימלי לפני לזחול החוצה של מזון. שמור את צלוחיות בטמפרטורה המתאימה עד 3 זחלים instar להתחיל לנדוד על הקיר את הבקבוקון.
- להכין מלאי חדש של פוספט בופר סליין (PBS) וכן PBT (0.1% ב Tween PBS). שמור על 10 מ"ל של PBS על הקרח.
- להכין 1-5 מ"ל של מקבע טרי (פורמלדהיד 4% PBT) ולשמור את זה על הקרח. אנו משתמשים פורמלדהיד 37-38% בבקבוקים כפתרון המניות.
1. דיסקציה ו קיבוע של הזחלים Instar השלישי
- בחר נדודים 3 הזחל instar מהקיר בקבוקון ולמקם אותו טיפה 50 μl של קר כקרח PBS על צלחת לנתיחה Sylgard (עשוי ערכת Sylgard 184 סיליקון אלסטומר, Dow Corning תאגידרקמת מנה התרבות).
- החזק, זחל בצד הגב למעלה, ליד הפה ווים, באמצעות מלקחיים עדינים (דומונט # 5 מלקחיים), ולתקוע סיכה חרק (minutien, 0.1 מ"מ, נירוסטה) דרך המוח של הזחל.
- תפוס את הקצה האחורי של הזחל עם המלקחיים, למשוך בעדינות למתוח את הזחל בעדינות לאורכו. מקל עוד סיכה חרק בין שני spiracles האחוריים.
- האביב מספריים חותכים שני חתכים אופקיים הקיר הגוף (בניצב לציר הקדמי, האחורי), קרוב סיכות הקדמי וגם האחורי.
- בעזרת מספריים חותכים האביב הקיר גוף הזחל לאורך קו האמצע של הגב הקדמי כדי החתך האחורי.
- הסרה של האיברים הפנימיים (המעיים, בלוטות הרוק, malpighian tubules וכו ') ואת קנה הנשימה באמצעות מלקחיים עדינים. לשטוף בעדינות פעם או פעמיים עם PBS.
- תפוס את קיר מדפים שתי הגוף עם מלקחיים, למתוח אותם ולהדק אותם לצלחת באמצעות שתי סיכות חרקים לכל צד.
- להסיר את PBS ולהוסיף 50 μl של פתרון תיקון (פורמלין 4% PBT). דגירה 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר מקבע. שטפו פעמיים עם PBS. משוך את הפינים חרקים. האביב מספריים חותכים את הראש והזנב הזחל ולהשאיר פילה מלבני. העברת רקמות קבוע צינור Eppendorf צונן עם PBS.
- לאחר מספר מספיק של הזחלים הם קבועים, אפשר להמשיך ישירות מכתים נוגדנים. אם מכתים מיידית אינו רצוי, הזחלים קבוע יש לשטוף 3 פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 95% אתנול ו מאוחסן אתנול 95% ב -20 ° C.
2. דיסקציה ו קיבוע של גלמים
חלק א
- כדי להשתתף את צלוחיות כמו קיבעון הזחלים, עד 3 זחלים instar מתחילים pupariate. לבחון את צלוחיות כל הזחלים שעה סימן כי יש pupariated. אפשר גלמים ניכרת לפתח השעות 30-40 ב 24 ° C, או 24-27 שעות ב 29 ° C.
- באמצעות מלקחיים עדינים לקחת 20-30 גלמים של הדואר בגיל המתאים ולשים אותם בצלחת חרסינה כהה רב גם לנתח. להיזהר לא לפגוע ברקמות של עניין.
- חלץ גלמים ממקרה גלמי. בגין על ידי קילוף operculum וממשיכים עד גולם ללא תשלום. שים את הגולם אל מלא גם עם PBT. המשך מיצוי כל גלמים. צעדים 2.4-2.6 צריך להיעשות בקבוצות קטנות של גלמים 5 בכל פעם.
- מניחים 5 גלמים על משטח ישר בין הבארות של צלחת לנתח. בעזרת סכין דיסקציה מיקרו לחתוך את קצה הראש וקצה האחורי של הבטן (לחילופין, ניתן להשתמש בשני זוגות של מלקחיים לקרוע חורים בשני הקצוות של גלמים).
- החזק את גולם במקום באמצעות מלקחיים עדינים ולהשתמש מזרק 1 מ"ל לשטוף את האיברים הפנימיים של גולם, על ידי הזרקת PBT דרך הפתח הקדמי.
- לשטוף בקצרה גזור גולם על ידי טבילה אותו מילא היטב עם PBS והעבר אותו לתוך מקבע קר בצינור Eppendorf כל הזמן על הקרח.
- דגירה בין לילה (ON) בשעה 4 ° C.
חלק ב '
- מחק מקבע ולשטוף את גלמים שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, עם PBT. שמור על גלמים דהוי על הקרח.
- מלא את שתי בארות של המנה לנתח עם PBT. שימוש פוליאתילן פסטר העברת פיפטה גלמים כמה לאחד הבארות.
- הזז 1 גולם בכל פעם אל הבאר 2. באמצעות שני זוגות מלקחיים חדות עם טיפים מיושר לגמרי, לקלף את העור המת גלמי שקוף של האגף: להבטיח את הגולם אל החלק התחתון של זוג 1 גם באמצעות מלקחיים, בעדינות לקרוע את העור המת באמצעות זוג נוסף של מלקחיים. לאחר לציפורן נקרע, לקלף אותו באגף. היזהר שלא לנתק את הזרוע מן הגולם. לאחר קילוף העור המת מן הלהב כנף, להמשיך פילינג לציפורן של ציר הזרוע (שם ChOs כנף נמצאים).
- לאחר קילוף העור המת האגף, אפשר לנסות לקלף את העור המת רגל באופן דומה.רגליים רבים עשויים ללכת לאיבוד בתהליך, אך למרות התשואה הנמוכה, שלב זה מומלץ ביותר שכן הוא משפר באופן משמעותי את צביעת ChOs הרגל. את ChOs של haltere והבטן ניתן דמיינו בלי יותר קילוף העור המת.
- מניחים את "קלופים" גולם בצינור Eppendorf מלא מתנול לשמור בטמפרטורת החדר. המשך לקלף את העור המת של גלמים הכל, ולהוסיף אותם הצינור אותו דבר. לפחות 10 גלמים קלופים יפה יש לאסוף את כל מכתים.
- הסר את מתנול לשטוף שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, עם 95% אתנול. גלמים קבוע יכולים להישמר במשך תקופות זמן ארוכות באתנול 95% ב -20 ° C.
3. Immunostaining של זחלים וגלמים
- שטפו את הרקמה קבוע עם PBT שלוש פעמים, 30 דקות כל אחד, בטמפרטורת החדר. הזחלים ניתן לכבס עם טלטול עדין על צלחת מסתובבת. גלמים נשטפים בלי לרעוד.
- החלף PBT עם חיץ חוסם (PBT + 5% nעז סרום ormal) ו דגירה על על 4 ° C.
- הסר חוצץ חסימת דגירה עם נוגדנים ראשוניים (מדולל חסימת חיץ) ביום ב 4 ° C.
- לשטוף ארבע פעמים עם PBT כמתואר בשלב 3.1.
- הסר את PBT ו דגירה עם נוגדנים משניים (מדולל חסימת חיץ) ביום ב 4 ° C.
- שטפו פעמיים עם PBT ופעם עם PBS כמתואר בשלב 3.1.
- החלף PBS עם הרכבה בינונית (Dako בינוני פלורסנט הרכבה (Dako Cytomation, Glostrup, דנמרק) ואת דגירה על 4 מעלות צלזיוס ב.
4. הרכבה של הזחלים
- הזחלים הם רכובים על שקופיות מיקרוסקופ בטיפת התקשורת גובר עם לציפורן שלהן פונה כלפי מטה וקיר שרירי הגוף כלפי מעלה. לשים טיפה קטנה של המדיום גובר על פיסת כיסוי נקי ולהשתמש בו כדי לכסות את ההכנה. אינן חלות על כל לחץ על זחלים עלה.
5. הרכבה של גלמים
- הכינו שתי שקופיות מיקרוסקופעם ירידה של המדיום גובר, 1 לנתיחה והשני עבור הרכבה.
- לשים כמה גלמים על אחת השקופיות.
- האביב באמצעות מספריים להסיר את הראש ואת חלקו האחורי של הבטן.
- להפריד 1/2 הגב של בית החזה מהמחצית הגחון על ידי חיתוך בין בכנפיים וברגליים.
- מניחים את חלקי גופות מבותרות של גולם בשקופית מיקרוסקופ השני ירידה של פתרון גובר. להבטיח את הכנפיים והרגליים מתוחות ולנסות למזער בכיסוי של רקמות ככל האפשר.
- מניחים ירידה של המדיום גובר על פיסת כיסוי ומניחים אותו על המדגם. אל תפעיל לחץ על מדגם רכוב.
6. נציג תוצאות
דוגמה חיסונית המוכתמים ChOs של הזחל instar 3 מוצג באיור 1. דוגמה זו מראה הבטן נמתח קטע יפה שבו 7 מתוך שמונת ChOs גלויים לעין. הנוירונים הם במעבדההופנו אליה עם MAb22C10 (01:20, המתקבל בנק Hybridoma מחקרים התפתחותית באוניברסיטת איווה), כובע, רצועה, מכסה, מצורף והקשר תאים ברצועות מסומנים עם אנטי αTub85E (01:10, קליין ואחרים. 2010). נוגדנים משנה של מכתים ניאון היו Cy3 או Cy5-מצומדות anti-mouse/rabbit (1:200, ג'קסון Immunoresearch מעבדות). דוגמאות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ confocal (LSM 510, Zeiss).
מקבץ של ChOs כנף על הווריד רדיאלי הגחון של 35 שעות בן גולם מוצג באיור 2.
איור 1 (א) איור סכמטי של ששת סוגי התאים המרכיבים איבר יחיד: Ch. קבצים מצורפים שוק (CA), שוק (C), scolopale (S), תא עצב (N), רצועה (L) מצורף רצועה (LA ). איבר LCh5, שבו חמש ChOs מקובצים, נמתח על פני קבוצה של שרירים רוחביים לרוחב (LT1-4). שריר האורך לרוחב (LL1), שרירי האורך הגחון (VL1-4) שרירים אלכסונית לרוחב (LO1) באים לידי ביטוי גם. תאים גיד באים לידי כמו כדורים חומים (מתוך קליין et al., 2010). (ב) קטע אחד הבטן של הזחל instar 3 הנצפים בהגדלה של 10X. שבעה מתוך שמונה ChOs הנוכחי בכל מגזר בטן ניכרים: איברים צדדיים חמש שיחד יוצרות איברים pentascolopidial (LCh5), איבר אחד לרוחב (LCh1) ואחד משני ChOs הגחון (VChB). הנוירונים (N) של ChOs את מסומנים בטוש העצבית MAB 22C10 (אדום). רצועה (L), שוק (C) ותאי צירוף קובץ (לוס אנג'לס, קליפורניה) מסומנים עם אנטי αTub-85E (כחול). התאים את המכסה רצועה מסומנים בנוסף עם כתב צ'ו ספציפי GFP מחסה אלמנט הרגולציה מן לוקוס dei (נחמן et al., נתונים שלא פורסמו).
איור 2. et al., נתונים שלא פורסמו).
Discussion
פרוטוקול המתואר בסרט הזה מספק דרך לדמיין ChOs פרופריוצפטיביות בשלבי הזחל ו גלמי. מחקרים על מבנה ופיתוח של ChOs פרופריוצפטיביות היה מוגבל עד כה בעיקר בשלבים עובריים וכן דיסקים דמותי הזחל. כך, היבטים רבים של בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות, של ChOs הן הזחל ומבוגרים, אינם ידועים ברובם. הפרוטוקול המתואר, בשילוב עם כלים גנטיים משותפים תסיסנית, יכול להיות מנוצל כדי ללמוד לזהות גנים חדשים ושבילים כי תפקיד בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות ChOs. פרוטוקול זה מותאם במיוחד להדמיה של צ 'ו, אבל זה יכול להיות מותאמים עבור צביעה של רקמות אחרות, כגון כנפיים גלמי 6.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות בנק מחקרים Hybridoma התפתחותית באוניברסיטת איווה לשליחת לנו נוגדנים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק (מס '29/08) מן הקרן הלאומית למדע. כפי נתמכת גם על ידי מענק מחקר של DFG (דויטשה Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
References
- Brewster, R., Bodmer, R. Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila. Development. 121, 2923-2936 (1995).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).
- Eberl, D. F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).
- Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. Development of Johnston's organ in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression. Dev Biol. 351, 99-109 (2011).
- Field, L. H., Matheson, T. Chordotonal organs of insects. Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).
- Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila. J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).
- Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors. Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).
- Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system. Cell. 73, 1307-1321 (1993).
- Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors. Development. 121, 2019-2030 (1995).
- Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. 424, 81-84 (2003).
- Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe. Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).
- Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells. Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).
- Okabe, M., Okano, H. Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis. Development. 124, 1045-1053 (1997).
- Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes. Development. 128, 711-722 (2001).
- Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ. Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).
- zur Lage, P., Jarman, A. P. Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors. Development. 126, 3149-3159 (1999).
