Summary
方法免疫组织化学染色和可视化chordotonal机关在幼虫和蛹
Abstract
本体是能够感知的议案，或身体各部位的位置，身体内产生的刺激。在果蝇和其他昆虫的本体是由专门的感觉器官称为chordotonal机关（ChOs）的2。在果蝇中许多其他器官一样，ChOs发展在苍蝇的生命周期的两倍。首先，的幼虫ChOs发展胚胎发育过程中。然后，的成人ChOs开始发展幼虫的成虫盘和继续分化过程中变态。
的发展幼虫ChOs胚胎发育过程中已被广泛10,11,13,15,16研究。每个CHO的核心是一种感官的单位组成的神经元和scolopale细胞。感觉单位之间的两个辅助细胞类型，重视通过专门的表皮的依恋细胞1,9,14角质层被拉长。当一只苍蝇幼虫的动作，相对位移的电子pidermal附着细胞伸展的感觉单位和特定的瞬时受体电位香草（TRPV）的外段在枝蔓8,12的渠道也随之开放。在中枢神经系统，引起信号，然后转移到运动中枢模式发生器电路。
多个ChOs已被形容在成年果蝇7。这些都位于关节附近的成年果蝇的附加物（腿，翅膀和缰绳）和在胸部和腹部。此外，数百ChOs的成人天线共同构成约翰斯顿的器官，换能器声，机械能3,5,17,4。
相反，在胚胎阶段有关的ChOs的发展广泛的知识，很少有人知道这些器官的形态在幼虫期。此外，除了股ChOs的18和约翰斯顿的器官，我们knowled的GE有关的发展和成年果蝇ChOs结构是非常零碎的。
在这里，我们描述了染色和可视化ChOs在三龄幼虫和蛹的方法。这种方法可应用于遗传工具，以更好地描述的形态和了解，在飞行的各种ChOs发展。
Protocol
在您开始之前
- 成长所需的飞行文化。保持不拥挤的小瓶（约30苍蝇每毫升50瓶）。让苍蝇奠定只有一个每天在每个小瓶鸡蛋。这将提供幼虫充足的食物供应和之前爬出来的食物，使他们能够达到的最大大小。保持适当的温度小瓶，直到三龄幼虫开始小瓶墙壁上漫步。
- 准备新鲜的股票的磷酸盐缓冲液（PBS）和PBT（0.1％吐温的PBS）。 10毫升的PBS置于冰上。
- 准备1-5毫升的新鲜固定液（4％甲醛在PBT），并保持它在冰上。我们使用瓶装37-38％的甲醛，作为原液。
1。三龄幼虫的解剖及固定
- 拿起小瓶墙一溜的第三龄幼虫，并将其放置在冰冷PBS 50μL上Sylgard夹层板（Sylgard 184，道康宁公司的有机硅弹性体包在下降组织培养皿）。
- 举行的幼虫，一边背，口附近的钩子，用钳（杜蒙＃5镊子）的罚款，并坚持通过昆虫幼虫的大脑脚（minutien，0.1毫米，不锈钢）。
- 抢与镊子幼虫的后端，轻轻拉和纵向轻轻舒展幼虫。坚持另一种昆虫针后两者之间的气孔。
- 使用弹簧剪刀剪在体壁的水平切口（垂直于前后轴），接近前部和后部的引脚。
- 使用弹簧剪刀剪前幼虫体壁沿背中线后切口。
- 取出内脏（肠，唾液腺，马氏管等）和气管，用细镊子。轻轻洗一次或两次用PBS。
- 用钳子抓住两个体壁瓣，伸展出来和牵制他们每侧两个昆虫针板使用。
- 删除的PBS和添加50μL固定的解决方案（4％甲醛在PBT）。在室温下孵育20分钟。
- 删除的固定液。用PBS洗两次。拉出昆虫针。使用弹簧剪刀剪幼虫的头部和尾部留下一个长方形圆角。转让固定组织用PBS冷冻离心管。
- 一旦足够数量的幼虫是固定的，可以继续直接抗体染色。如果不希望立即染色，固定幼虫应与95％乙醇洗涤3次，每次5分钟，并存储在95％乙醇于-20°C
2。蛹的解剖和固定
第I部分
- 出席幼虫固定的小瓶，直到三龄幼虫开始pupariate。检查瓶幼虫已pupariated每隔一小时大关。允许的显着蛹发展在24°C，或24-27小时30-40小时29°C。
- 用细镊子挑20-30日蛹é适当的年龄，并把它们在一个黑暗的瓷器多井解剖菜。要小心，不要损坏利益的组织。
- 从蛹的情况下提取的蛹。开始脱落，鳃盖和继续下去，直到蛹是免费的。投入一个充满与PBT的蛹。继续提取所有的蛹。步骤2.4-2.6应做一次小批量五个蛹。
- 放置在平坦的表面之间的解剖盘井五蛹。用微型清扫刀，切尖的头部和腹部后尖（或者，它可以使用两双镊子撕孔两端的蛹）。
- 在使用罚款钳的地方举行蛹，用1毫升注射器，洗出蛹的内部器官，通过注射前开放PBT。
- 洗净，浸泡在用PBS充满解剖蛹简要移入Eppendorf管放在冰上冷固定液。
- 孵育过夜（ON）在4°C。
第二部分
- 倒掉固定液和蛹三次，每次5分钟，与PBT洗。保持冰洗蛹。
- 填写与PBT解剖盘的两个井。使用聚乙烯巴斯德吸管转让几个蛹井。
- 一次移动到第二口井的一个蛹。使用完全一致的提示两对锋利的钳子，透明的翅膀蛹角质层脱落：确保蛹以及使用钳子底部，轻轻撕角质层，使用产钳的第二对。一旦角质层被撕裂，把它剥开翼。要小心不要断开从蛹的翅膀。从机翼叶片角质层剥落后，继续剥离角质层翼铰链（位于翼ChOs）。
- 剥离翼角质层后，可以尝试以类似的方式腿角质层剥落。在这个过程中可能会失去很多腿，但尽管产量低，这一步强烈建议，因为它大大提高了腿ChOs的染色。没有进一步的角质层剥落的haltere和腹部ChOs可以可视化。
- “去皮”蛹放置在一个充满Eppendorf管中，以甲醇和保持在室温。继续所有蛹的表皮剥落，并把它们添加到同一管内。至少有10个很好的去皮蛹应收集每个染色。
- 除去甲醇洗三次，每次5分钟，用95％乙醇。固定蛹可以保持很长一段时间，在95％乙醇于-20°C
3。免疫组化的幼虫和蛹
- 洗与PBT的三次，每次30分钟，在室温下，固定的组织。幼虫可水洗，轻轻摇动旋转板。蛹洗净，无晃动。
- 封闭液（取代了PBT PBT + 5％列印ormal山羊血清）和4对孵化°C。
- 删除封闭液和抗体（封闭液稀释）孵育在4°C
- 与PBT清洗四次，在步骤3.1中描述。
- 卸下PBT孵育二次抗体（封闭液稀释）在4°C
- PBT和洗两次一次用PBS在步骤3.1中描述。
- PBS的安装介质（Dako公司荧光灯安装介质（Dako公司Cytomation，Glostrup，丹麦）和孵化在4°C的替换。
4。安装幼虫
- 幼虫被安装上了他们的角质层朝下体壁肌肉朝上安装媒体中的显微镜幻灯片。把一个干净的盖玻片上的安装介质中的小水滴，并用它来支付的准备。不适用任何安装幼虫上的压力。
5。安装蛹
- 准备两个载玻片下降的安装介质，清扫和安装第二。
- 几个蛹放在一个幻灯片。
- 使用弹簧剪刀除去头部和腹部的后部。
- 从腹侧半分开切割的翅膀和腿之间的胸部背侧一半。
- 在安装的解决方案中的第二显微镜幻灯片上放置解剖蛹的身体部位。确保翅膀和腿伸了出来，并尽量减少叠加尽可能组织。
- 将盖玻片上的安装介质下降，并将其放置在样本。并不适用于安装样品的压力。
6。代表结果
第三龄幼虫免疫染色ChOs的例子， 如图1所示。这个例子显示了一个很好的拉伸腹段，在这七个八个ChOs清晰可见。神经元是实验室ELED与MAb22C10（1:20，从发展研究杂交瘤细胞银行获得在美国爱荷华大学）;帽，韧带，帽，附件和韧带附着细胞标记与反αTub85E（1:10，克莱因等。 2010年）。中学抗体荧光染色Cy3标记，或Cy5的标记anti-mouse/rabbit（1:200，杰克逊Immunoresearch实验室）。使用共聚焦显微镜（LSM的510蔡司）查看样品。
HR-35岁的蛹径向腹侧静脉翼ChOs群集如图2所示。
图1六种类型的细胞构成单一CH机关：（一）示意图。帽附着（CA），帽（C）scolopale（），神经（N）的韧带（L）和韧带附着（洛杉矶）。被拉长，聚集在5 ChOs是，LCh5机关跨外侧横肌组（LT1-4）。外侧纵肌（LL1），腹纵肌（VL1-4）和横向斜肌（LO1），也说明。肌腱细胞是棕色球（Klein等。，2010）所示。 （二）第三龄幼虫腹段在10倍放大倍率观看。目前在每腹节的八个ChOs七是显而易见的：五个横向机关共同组成的机关（pentascolopidial LCh5），一个单一的横向器官（LCh1）和（VChB）腹侧ChOs之一。标记的ChOs（N）的神经元与神经元的标记单克隆抗体22C10（红色）。韧带（L）帽（C）和附着细胞（洛杉矶，加利福尼亚州）标记的抗αTub-85E（蓝色）。此外帽和韧带细胞标记与CHO特定的绿色荧光蛋白记者窝藏调控元件的，DEI轨迹（Nachman 等，未发表资料）。
图2。 等，未发表资料）。
Discussion
在这部影片中所描述的协议提供了一个可视化本体ChOs在幼虫和蛹的阶段。结构和本体ChOs的发展研究迄今已限制主要是胚胎阶段，幼虫的成虫盘。因此，既幼虫和成人ChOs的，更高的发展阶段，许多方面，仍是未知。所描述的协议，结合在果蝇中常见的遗传工具，可以用来确定和研究新的基因和途径，发挥作用，在后ChOs发展阶段。这个协议进行了优化，为CHO可视化，但它可以为其他组织，如6蛹两翼，染色适应。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
笔者想在美国爱荷华大学的感谢，向我们发送抗体杂交瘤细胞银行的发展研究。这项工作是由以色列科学基金会的资助（29/08号）的支持。还支持从东风集团（德意志研究联合会）的研究资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
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