Summary
En metode til at immunfarve og visualisere chordotonal organer i larver og pupper af
Abstract
Proprioception er evnen til at fornemme den bevægelse, eller placering af kropsdele ved at reagere på stimuli der opstår i kroppen. I bananfluer og andre insekter proprioception leveres af specialiserede sanseorganer betegnes chordotonal organer (chos) 2. Ligesom mange andre organer i Drosophila, udvikle chos to gange i løbet livscyklus fluen. Første af larvestadium chos udvikles under embryogenese. Så de voksne chos begynder at udvikle sig i de larver fantasiens diske og fortsætte med at differentiere under forvandling.
Udviklingen af larver chos under embryogenese er blevet omfattende undersøgt 10,11,13,15,16. Det centrale i hver Cho er en sensorisk enhed bestående af et neuron og en scolopale celle. Den sensoriske Enheden er udspændt mellem to typer af hjælpeceller, der lægger til neglebånd via specialiserede epidermale vedhæftede celler 1,9,14. Når en flue larver bevæger sig, den relative forskydning af epidermal vedhæftede celler fører til strækning af den sensoriske enhed og efterfølgende åbning af specifikke transiente receptor potentielle vanilloid (TRPV) kanaler på den ydre del af dendritceller 8,12. Den fremkaldte signal overføres derefter til den lokomotoriske centrale mønsterparti generator-kredsløbet i det centrale nervesystem.
Flere chos er blevet beskrevet i den voksne flue 7. Disse er placeret i nærheden af leddene af de voksne flyve vedhæng (ben, vinger og hovedtøj) og i thorax og abdomen. Hertil kommer, samlet flere hundrede chos danne Johnstons orgel i den voksne antenne, transducere akustisk til mekanisk energi 3,5,17,4.
I modsætning til omfattende viden om udviklingen af chos i fosterstadiet, er meget lidt kendt om morfologi af disse organer under larvestadier. Endvidere, med undtagelse af femorale chos 18 og Johnston organ, knowled vorge om udvikling og struktur af chos i den voksne flue er meget fragmenteret.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til farvning og visualisere chos i tredje stadiums larver og pupper. Denne fremgangsmåde kan anvendes sammen med genetiske værktøjer til bedre at karakterisere morfologi og forstå udviklingen af forskellige chos i flue.
Protocol
Før du begynder
- Vokser de ønskede flyve kulturer. Opbevar hætteglassene Uncrowded (ca. 30 fluer per 50 ml hætteglas). Lad fluerne lægger æg for kun én dag i hvert hætteglas. Dette vil give larverne tilstrækkelig fødevareforsyning og give dem mulighed for at nå maksimal størrelse, før kravle ud af maden. Opbevar hætteglassene i den rette temperatur, indtil tredje stadie larver begynder at vandre på hætteglasset væggen.
- Fremstilling af en ny beholdning af phosphatbufret saltvand (PBS) og PBT (0,1% Tween i PBS). Holde 10 ml PBS på is.
- Forbered 1-5 ml frisk fixativ (4% formaldehyd i PBT) og holde den på is. Vi anvender flaske 37-38% formaldehyd som en stamopløsning.
1. Dissektion og fiksering af tredje stadiums larver
- Vælg en omvandrende tredje stadie larve fra hætteglasset væggen og placere den i en 50 gl dråbe iskoldt PBS på en Sylgard dissektion plade (lavet af Sylgard 184 silikone elastomer kit, Dow Corning Corporation i envævskulturskål).
- Hold larve, dorsale opad, i nærheden af munden krogene, ved hjælp af fine pincet (Dumont # 5 pincet), og holde et insekt ben (minutien, 0,1 mm, rustfrit stål) gennem larve hjerne.
- Fat den bageste ende af larve med pincet, træk forsigtigt og strække larve forsigtigt længderetningen. Stick et andet insekt ben mellem de to bageste Spirakler.
- Anvender fjeder saks skære to vandrette snit i kropsvæggen (vinkelret på den anteriore-posteriore akse), tæt på de forreste og bageste stifter.
- Ved hjælp af fjederen saksen skære larvestadiet kropsvæggen langs den dorsale midtlinje fra den forreste til den bageste snit.
- Fjerne indre organer (tarmen, spytkirtler, malpighian tubuli etc.), og trachea ved hjælp af fine tænger. Vask forsigtigt én eller to gange med PBS.
- Fat i to kropsvæggen flapper med en pincet, strække dem og fastgøre dem til pladen ved hjælp af to insektceller stifter for hver side.
- Fjerne PBS og der tilsættes 50 ul fastsættelse opløsning (4% formaldehyd i PBT). Inkuber 20 minutter ved stuetemperatur.
- Fjerne fiksativ. Vaskes to gange med PBS. Træk ud insekt ben. Brug af foråret saks klippe larve hoved og hale efterlader en rektangulær filet. Overføre fikseret væv til en afkølet Eppendorf-rør med PBS.
- Når et tilstrækkeligt antal larver er fastgjort, kan man fortsætte direkte til antistoffarvning. Hvis omgående farvning ikke ønskes, bør det faste larverne vaskes 3 gange, 5 minutter hver, med 95% ethanol og opbevaret i 95% ethanol ved -20 ° C.
2. Dissektion og fiksering af Pupper
Del I
- Deltag til de hætteglas som for larver fiksering, indtil tredje stadie larver begynder at pupariate. Undersøg glassene hver time og mærke larver, der har pupariated. Tillade den mærkede pupperne at udvikle 30-40 timer ved 24 ° C eller 24-27 timer ved 29 ° C.
- Ved hjælp af fine tænger pick 20-30 pupper af the passende alder og læg dem i en mørk porcelæn multi-godt dissekere fad. Pas på ikke at beskadige væv af interesse.
- Ekstrahere pupper af puppe tilfældet. Begynd med peeling off Laag og fortsætte, indtil puppen er gratis. Sæt puppe i en brønd fyldt med PBT. Fortsætte ekstrahere hele pupperne. Trin 2,4-2,6 bør ske i små portioner på fem pupper ad gangen.
- Anbring fem pupper på en flad overflade mellem brøndene af dissekere skålen. Ved anvendelse af en mikro dissektion kniv skære spidsen af hovedet og den bageste spids af maven (alternativt er det muligt at anvende to par tænger til at rive huller i begge ender af pupperne).
- Holde puppe på plads ved hjælp af fine tænger og anvende en 1 ml sprøjte for at vaske de indre organer af puppe, ved at injicere PBT gennem den forreste åbning.
- Vask dissekeret puppe kort ved at dyppe det i en brønd fyldt med PBS og flytte det til den kolde fikseringsmiddel i et Eppendorf-rør holdes på is.
- Inkuber natten over (ON) ved 4 ° C.
Part II
- Kassér fiksativ og vaskes pupperne tre gange, 5 minutter hver, med PBT. Hold vaskede pupper på is.
- Fyld to brønde i dissekere fad med PBT. Ved anvendelse af en polyethylen Pasteur-pipette overføre flere pupper til en af brøndene.
- Flytte en puppe ad gangen i den anden brønd. Ved hjælp af to par skarpe pincet med perfekt afstemt spidser, skrælle åben puppe kutikula af vingen: fastgøre puppe til bunden af brønden ved hjælp af en tang, og forsigtigt rive kutikula hjælp af det andet par tænger. Når skællaget er revet, flå det af vingen. Pas på ikke at afbryde vingen fra puppe. Efter afrivning kutikula fra vingen bladet, fortsætter afskalning overhuden af vingen hængslet (hvor vingen chos er placeret).
- Efter afrivning vingen kutikula, kan man forsøge afskrælning benet cuticula på lignende måde.Mange ben er sandsynligvis gå tabt i processen, men trods det lave udbytte, er dette trin stærkt anbefales, da det i høj grad forbedrer farvning af ben chos. De chos af haltere og maven kan visualiseres uden yderligere peeling off neglebånd.
- Placere "skrælles" puppe i en Eppendorf-rør fyldt med methanol og holde ved stuetemperatur. Fortsæt peeling off neglebånd af alle pupper, og tilføje dem til det samme rør. Mindst 10 pænt skrællet pupper skal indsamles for hver farvning.
- Fjerne methanolet og vaskes tre gange, 5 minutter hver, med 95% ethanol. Fast pupper kan opbevares i lange perioder i 95% ethanol ved -20 ° C.
3. Immunfarvning af larver og pupper
- Vaske det faste væv med PBT tre gange, 30 minutter hver ved stuetemperatur. Larver kan vaskes med forsigtig omrystning på en roterende plade. Pupper vaskes uden at ryste.
- Udskift PBT med blokerende buffer (PBT + 5% normal gedeserum) og inkuberes ved 4 ° C.
- Fjerne den blokerende puffer og inkuberes med primære antistoffer (fortyndet i blokeringsbuffer) OM ved 4 ° C.
- Vaskes fire gange med PBT som beskrevet i trin 3.1.
- Fjerne PBT og inkuberes med sekundære antistoffer (fortyndet i blokeringsbuffer) OM ved 4 ° C.
- Vaskes to gange med PBT og en gang med PBS som beskrevet i trin 3.1.
- Udskift PBS med montering medium (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) og inkuber ved 4 ° C ON.
4. Montering af larver
- Larverne er monteret på et objektglas i en dråbe montering medier med deres neglebånd nedad og kroppens væg muskler opad. Læg en lille dråbe montering medium på et rent cover slip og bruge den til at dække præparatet. Må ikke anvendes nogen form for pres på den monterede larver.
5. Montering af Pupper
- Forbered to objektglasmed en dråbe montering medium, en for dissektion og det andet til montering.
- Sætte flere pupper på en af siderne.
- Brug af foråret saks fjerne hovedet og den bageste del af maven.
- Adskille den dorsale halvdel af thorax fra den ventrale halv ved at skære mellem vingerne og benene.
- Anbring de dissekerede kropsdele af puppe på den anden mikroskopobjektglasset med en dråbe montering opløsning. Sørg for, at vinger og ben er strakt ud og forsøge at minimere overlapning af væv så meget som muligt.
- Placer en dråbe montering medium på et dækglas, og placer det over prøven. Må ikke lægge pres på den monterede prøven.
6. Repræsentative resultater
Et eksempel på immuno-farvede chos af tredje stadiums larver, er vist i figur 1. Dette eksempel viser en pænt strakt abdominal segment, hvor syv af de otte chos er klart synlige. Neuroner er labdrejes frem og tilbage med MAb22C10 (1:20, opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank ved University of Iowa), den fælles landbrugspolitik, ledbånd, cap-vedhæftning og ledbånd vedhæftede celler mærkes med anti-αTub85E (1:10, Klein et al. 2010). Sekundære antistoffer til fluorescerende farvning var Cy3 eller Cy5-konjugeret anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Prøverne blev set ved hjælp af konfokal mikroskopi (LSM 510, Zeiss).
En gruppe af vinge chos på den ventrale radiale vene i 35 timer gammel puppe er vist i figur 2.
Figur 1 (A) Skematisk illustration af de seks celletyper, der udgør en enkelt Ch organ. Hætte vedhæftede (CA), hætten (C), scolopale (S), neuron (N), ligament (L) og ligamentet fastgørelse (LA ). Den LCh5 orgel, hvor fem chos er grupperet, strækkes på tværs af gruppen af laterale tværgående muskler (LT1-4). Den laterale langsgående muskel (LL1), ventrale langsgående muskler (VL1-4) og laterale, skrå muskel (LO1) er også vist. Sener celler er illustreret som brune kugler (taget fra Klein et al., 2010). (B) En abdominal segment af en tredje stadiums larver set fra et 10X forstørrelse. Syv af de otte chos stede i hver mave segment er indlysende: fem laterale organer, der tilsammen udgør pentascolopidial organ (LCh5), en enkelt lateral organ (LCh1) og en af to ventrale chos (VChB). De neuroner (N) af de chos er mærket med den neuronale markør MAb 22C10 (rød). Ligamentet (L), hætten (C) og vedhæftede celler (LA, CA) er mærket med anti-αTub-85e (blå). Hætten og ligament celler yderligere mærket med en CHO-specifik GFP reporter indeholdende et regulatorisk element fra dei locus (Nachman et al, upublicerede data).
Figur 2. et al, upublicerede data).
Discussion
Protokollen beskrevet i denne video tilvejebringer en måde at visualisere proprioceptive chos under larver og puppe trin. Undersøgelser om strukturen og udviklingen af proprioceptive chos har hidtil hovedsageligt begrænset til embryonale stadier og larver fantasiens diske. Således mange aspekter af senere stadier af udviklingen af både larver og voksne chos, fortsat er stort set ukendt. Den beskrevne protokol, kombineret med almindelige genetiske værktøjer i Drosophila, kan anvendes til at identificere og studere nye gener og veje, der spiller en rolle i senere stadier af chos udvikling. Denne protokol er blevet optimeret til visualisering af Cho, men det kan tilpasses til farvning af andre væv, såsom puppe vinger 6.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Developmental Studies Hybridoma Bank ved University of Iowa for at sende os antistoffer. Dette arbejde blev støttet af en bevilling (nr. 29/08) fra The Israel Science Foundation. AS er også understøttet af en forskningsbevilling fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 (or #55) forceps, biologie tip | F.S.T. | 11252-20 or 11252-10 (or similar forceps) | |
| Austerlitz stainless steel insect pins, minutiens 0.1mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6083-10 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 240.4019862 | |
| Vannas micro scissors (straight, 7.5 cm, blade 3mm) | AS Mdeizintechnik GmbH | 11-590-00 | Vannas Spring Scissors with identical specifications can be purchased from Roboz Surgical Instrument Co. |
| Orbital shaker - Rotamax-120 | Heidolph | N/A | |
| Dako Fluorescent Mounting Medium | Dako | ||
| X10 PBS formulation | The quality of PBS is critical for the success of this protocol | 2 gr/lit KCl, 2 gr/lit KH2PO4, 80 gr/lit NaCl, 21.7 gr/lit Na2HPO4.7H2O |
|
| PBT | X1 PBS + 0.1% Tween 20 |
References
- Brewster, R., Bodmer, R. Origin and specification of type II sensory neurons in Drosophila. Development. 121, 2923-2936 (1995).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16053-16053 (2003).
- Eberl, D. F. Feeling the vibes: chordotonal mechanisms in insect hearing. Curr. Opin. Neurobiol. 9, 389-393 (1999).
- Eberl, D. F., Boekhoff-Falk, G. Development of Johnston's organ in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 51, 679-687 (2007).
- Eberl, D. F., Hardy, R. W., Kernan, M. J. Genetically similar transduction mechanisms for touch and hearing in Drosophila. J. Neurosci. 20, 5981-5988 (2000).
- Egoz-Matia, N., Nachman, A., Halachmi, N., Toder, M., Klein, Y., Salzberg, A. Spatial regulation of cell adhesion in the Drosophila wing is mediated by Delilah, a potent activator of βPS integrin expression. Dev Biol. 351, 99-109 (2011).
- Field, L. H., Matheson, T. Chordotonal organs of insects. Advances in Insect Physiology. 27, 1-228 (1998).
- Gong, Z., Son, W., Chung, Y. D., Kim, J., Shin, D. W., McClung, C. A., Lee, Y., Lee, H. W., Chang, D. J., Kaang, B. K. Two interdependent TRPV channel subunits, inactive and Nanchung, mediate hearing in Drosophila. J. Neurosci. 24, 9059-9066 (2004).
- Inbal, A., Volk, T., Salzberg, A. Recruitment of ectodermal attachment cells via an EGFR-dependent mechanism during the organogenesis of Drosophila proprioceptors. Dev. Cell. 7, 241-250 (2004).
- Jarman, A. P., Grau, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. atonal is a proneural gene that directs chordotonal organ formation in the Drosophila peripheral nervous system. Cell. 73, 1307-1321 (1993).
- Jarman, A. P., Sun, Y., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Role of the proneural gene, atonal, in formation of Drosophila chordotonal organs and photoreceptors. Development. 121, 2019-2030 (1995).
- Kim, J., Chung, Y. D., Park, D. Y., Choi, S., Shin, D. W., Soh, H., Lee, H. W., Son, W., Yim, J., Park, C. S. A TRPV family ion channel required for hearing in Drosophila. Nature. 424, 81-84 (2003).
- Klein, Y., Halachmi, N., Egoz-Matia, N., Toder, M., Salzberg, A. The proprioceptive and contractile systems in Drosophila are both patterned by the EGR family transcription factor Stripe. Dev. Biol. 337, 458-470 (2010).
- Matthews, K. A., Miller, D. F., Kaufman, T. C. Functional implications of the unusual spatial distribution of a minor alpha-tubulin isotype in Drosophila: a common thread among chordotonal ligaments, developing muscle, and testis cyst cells. Dev. Biol. 137, 171-183 (1990).
- Okabe, M., Okano, H. Two-step induction of chordotonal organ precursors in Drosophila embryogenesis. Development. 124, 1045-1053 (1997).
- Rusten, T. E., Cantera, R., Urban, J., Technau, G., Kafatos, F. C., Barrio, R. Spalt modifies EGFR-mediated induction of chordotonal precursors in the embryonic PNS of Drosophila promoting the development of oenocytes. Development. 128, 711-722 (2001).
- Todi, S. V., Sharma, Y., Eberl, D. F. Anatomical and molecular design of the Drosophila antenna as a flagellar auditory organ. Microsc. Res. Tech. 63, 388-399 (2004).
- zur Lage, P., Jarman, A. P. Antagonism of EGFR and notch signalling in the reiterative recruitment of Drosophila adult chordotonal sense organ precursors. Development. 126, 3149-3159 (1999).
