Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod doi: 10.3791/3857 Published: June 5, 2012

Summary

Nuværende diagnostisk antimikrobiel resistensbestemmelse bygger på planktoniske væksten af ​​isolater i næringsrige og aerobe forhold. Her vil vi ansætte en alternativ kunstigt spyt medie til at studere antimikrobiel følsomhed af Pseudomonas aeruginosa biofilm under både aerobe og mikroaerofile betingelser yderligere en repræsentant for cystisk fibrose lunge.

Abstract

Der er stigende bekymring relevans in vitro antimikrobielle følsomhedstests når det påføres isolater af P. aeruginosa fra cystisk fibrose (CF) patienter. Eksisterende fremgangsmåder er afhængige af en enkelt eller nogle få isolater dyrket aerobt og planktonically. Forudbestemte cut-off anvendes til at definere, om bakterierne er følsomme eller resistente over for en given antibiotikum 1. Men under kroniske lungeinfektioner i CF, s. aeruginosa befolkninger findes i biofilm, og der er bevis for, at miljøet er stort set mikroaerofil 2. Det skarp forskel i forhold mellem bakterier i lungerne, og dem under diagnostiske test har sat spørgsmålstegn ved pålideligheden og endda relevans af disse tests 3.

Kunstigt spyt medium (ASM) er et dyrkningsmedium indeholdende bestanddelene af CF patientens spyt, herunder aminosyrer, mucin og frit DNA. P. aeruginosa </ Em> vækst i ASM efterligner vækst i CF-infektioner, med dannelsen af selv-sammenhobning biofilm strukturer og befolkning divergens 4,5,6. Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en mikrotiter-plade assay at studere antimikrobiel følsomhed over P. aeruginosa er baseret på vækst i ASM, der gælder for både mikroaerofile og aerobe betingelser.

En ASM assay blev udviklet i en mikrotiterplade format. P. aeruginosa biofilm fik lov at udvikle sig i 3 dage forud for inkubation med antimikrobielle midler i forskellige koncentrationer i 24 timer. Efter biofilm afbrydelse blev cellelevedygtighed måles ved farvning med resazurin. Dette assay blev anvendt til at fastslå sessile cellen minimale inhiberende koncentration (SMIC) af tobramycin til 15 forskellige P. aeruginosa isolater under aerobe og mikroaerofile betingelser og SMIC værdier blev sammenlignet med dem opnået med standard bouillon vækst. Selv om der varnogle beviser for øgede MIC-værdierne for isolater dyrket i ASM, når sammenlignet med deres planktoniske modstykker, blev de største forskelle fundet med bakterier testet i mikroaerofile betingelser, som viste en meget forøget resistens til en> 128 fold, i retning tobramycin i ASM systemet, når sammenlignet med assays udført under aerobe betingelser.

Den manglende sammenhæng mellem de nuværende resistensbestemmelse metoder og klinisk resultat har stillet spørgsmålstegn ved gyldigheden af nuværende metoder 3. Adskillige in vitro-modeller har været anvendt tidligere til at studere P. aeruginosa biofilm 7, 8. Disse metoder er afhængige af overfladen fastgjorte biofilm, mens ASM biofilm ligner dem observeret i CF lungen 9. Desuden har reduceret oxygenkoncentration i slim vist sig at ændre opførslen af P. aeruginosa 2 og påvirke antibiotikum modtagelighed 10. Derfor using ASM under mikroaerofile betingelser kan give et mere realistisk miljø, hvor du kan studere antimikrobiel følsomhed.

Protocol

1. Fremstilling af kunstig Sputum Medium (ASM)

  1. Tilsættes 4 g af DNA fra fisk sæd til 250 ml sterilt vand meget langsomt over et tidsrum på flere timer. DNA tager flere timer til fuldstændig opløsning og kan omrøres natten over ved stuetemperatur.
  2. Tilsættes 5 g mucin fra svinemave (type II) langsomt til 250 ml sterilt vand, indtil mucin er fuldstændig opløst. Opløsningen kan omrøres natten over ved 4 ° C.
  3. Opløs 0,25 g af hver essentielle og ikke-essentielle L-aminosyre, med undtagelse af L-tyrosin og L-cystein, i 100 ml sterilt vand. Opløs 0,25 g L-cystein i 25 ml 0,5 M kaliumhydroxid (Mr 56,11 g / mol) og 0,25 g L-tyrosin i 25 ml sterilt vand.
  4. Opløs 5,9 mg diethylentriaminpentaeddikesyre (DTPA), 5 g NaCI og 2,2 g KCl i 100 ml sterilt vand.
  5. Kombinere DNA, mucin, L-aminosyrer, DTPA, NaCl og KCl i en 1 liter kolbe.
  6. Tilsæt 5 ml æggeblomme emulsion og fyld op til ca 850 ml med sterilt vand.
  7. Juster pH til 6,9 med 1 M Tris (pH 8,5; Mr 121,14) og bringe volumenet til 1 liter med sterilt vand.
  8. Sterilisere ASM ved filtrering under anvendelse af en Vacuubrand ME 2 membran vakuumpumpe og Millipore Steritop filterenheder med en pore-og hals størrelse på 0,22 um og 45 mm. Hver Steritop filterenhed kan genanvendes umiddelbart op til tre gange, men filtrene skal skylles to gange med sterilt vand før genbrug. Filtreringsprocessen er langsom og kan udføres i løbet af 2 dage. Andre versioner af ASM er blevet udviklet, at bruge tilsætning af antibiotika i stedet for filtrering 11 dog, på grund af mulige lægemiddelinteraktioner, anbefaler vi ikke den metode, for denne særlige anvendelse.
  9. Ufiltreret og filtreret ASM skal opbevares ved 4 ° C i mørke. Brug frisk ASM anbefales dog, det kan holdes under disse betingelser for højst en måned.

    2. Bestemmelse af plankton siddende Cell Minimum Metabolic inhiberende koncentration (PSMIC)

    1. For at bestemme den minimale metaboliske hæmmende koncentration (PSMIC) værdier for 15 planktonically vokset P. aeruginosa isolater, det mikrofortyndingsplader metode bør udføres, som beskrevet i retningslinjerne for British Society for antimikrobiel kemoterapi BSAC 12. Det foretrukne antibiotika, i dette tilfælde tobramycin sulfat, fortyndes serielt i Luria-Bertani (LB) medium i en 96-brønds mikrotiterplade for at tilvejebringe en passende række af koncentrationer af antibiotikum.
    2. Fortynd overnatskulturer af P. aeruginosa i LB til en OD600 på 0,05 (± 0,01), og der tilsættes 100 gl volumener til brøndene i 96-brønds mikrotiterplade indeholdende 100 ul af seriefortyndet antibiotikum. I dette tilfælde, varierede de endelige koncentrationer af tobramycin sulfat mellem 512 til 0,5 ug / ml. Otte gentagelser af hver Antibiotic koncentration bør udføres.
    3. Negative kontrolbrønde for hvert isolat bør nedsættes, hvor der ikke antibiotikum tilsættes. Desuden bør otte brønde kun indeholde LB til anvendelse som et råemne i nedstrøms-analyse (afsnit 2.6).
    4. Inkubér 96-brønds mikrotiterplader i 1 - 2 dage ved 37 ° C uden omrystning under aerobe eller mikroaerofil (5% O2, 10% CO2, og 85% N2) betingelser. Mikroaerofile betingelser opnås under anvendelse CampyGen gasgenererings pakker i store anaerobe glas.
    5. Efter inkubation bakterievækst bestemmes ved at måle absorbansen af ​​bakteriekulturen i hver brønd ved en bølgelængde på 600 nm med en Fluostar Omega mikropladelæser og MARS Dataanalyse Software.
    6. Absorption fra antibiotika-behandlede planktoniske kulturer (A antibiotika behandlede planktoniske celler) og absorption fra negative kontroller (En negativ kontrol) bør rettes ved at trækkeion af baggrunden absorbans fås fra brønde, der indeholdt LB kun (En tom). Den procentvise inhibering af levedygtighed efterfølgende beregnes som (middel ± antibiotiske behandlede planktoniske celler / betyder En negativ kontrol) x 100%. Den PSMIC 90 er defineret som den antibiotiske koncentration, der forårsager 90% hæmning af planktoniske bakterievækst.
    7. At bestemme bakteriel levedygtighed efter behandling med antibiotika valg, 10 ul 0,02% (v / v) resazurin (fortyndet i destilleret vand) tilsættes til hver brønd, og pladerne inkuberes under aerobe betingelser i 1 - 2 timer ved 37 ° C, under omrystning ved 150 rpm. Levedygtige celler vil reducere den blå resazurin farvestoffet til den lyserøde fluorescerende resorufin form.
    8. Efter inkubation med resazurin, fluorescensen af ​​hver brønd med en excitationsbølgelængde på 540 nm og en emissionsbølgelængde på 590 nm i en Fluostar Omega mikropladelæser overvåge. De data skal analyseres som beskrevet værelav.

    3. Bestemmelse af biofilm sessile Cell minimale inhiberende koncentration (BSMIC)

    1. Overnatskulturer af P. aeruginosa (i dette tilfælde er 15 isolater af P. aeruginosa anvendes) skal fortyndes i LB til en OD600 på 0,05 (± 0,01), derefter yderligere fortyndet 1:100 i frisk ASM (samlet volumen 1,8 ml).
    2. De fortyndede kulturer (1,8 ml) bør tilsættes til hver brønd i en 24-brønds vævskulturplade behandlet plade. Tre brønde skal indeholde ASM kun til brug som en blank under nedstrøms analyse (afsnit 3,9).
    3. Sikre 24-brønds plader med laboratorie parafilm og inkuberes i 3 dage under aerobe eller mikroaerofile betingelser ved 37 ° C, under omrystning ved 75 rpm. Mikroaerofile betingelser skal opnås ved hjælp af CampyGen gas generation pakker i store anaerobe krukker.
    4. Fortynd antibiotika valg, i dette tilfælde tobramycin sulfat, at skabe en passende koncentrationsinterval i friskASM. I dette tilfælde, varierede slutkoncentrationer mellem 512-1 ug / ml. Tilsættes hver koncentration af det antibiotikum, i mængder på 200 gl med passende brønde i 24-brønds plader. Fire gentagelser af hvert antibiotikum koncentration skal udføres. Biofilm ikke er udsat for det foretrukne antibiotika blev anvendt som en negativ kontrol.
    5. Sikre 24-brønds plader med laboratorie parafilm og inkuberes under aerobe eller mikroaerofile betingelser i yderligere 24 timer ved 37 ° C, under omrystning ved 75 rpm.
    6. Efter inkubering i nærværelse af antibiotikum valg forstyrre de bakterielle biofilm med 100 ul 100 mg / ml cellulase (fortyndet i 0,05 M citratpuffer [9,6 g / l Citrate.H 2 0 i vand og pH 4,6 med NaOH] ) og inkuber i 24-brønds plader under aerobe betingelser ved 37 ° C, under omrystning ved 150 rpm i 1 time. Hvis det kræves, kan biofilm yderligere afbrudt ved manuel pipettering på dette stadium.
    7. At bestemme de metaboliske aktiviteterDe bakterielle celler frigivet fra de sprængte biofilm, resazurin (fortyndet i destilleret vand) 100 gl 0,02% (v / v) bør tilsættes til hver brønd i 24-brønds plader og inkuberet i 1-2 h ved 37 ° C , under omrystning ved 150 rpm.
    8. Efter inkubation med resazurin, fluorescensen af ​​hver brønd med en excitationsbølgelængde på 540 nm og en emissionsbølgelængde på 590 nm i en Fluostar Omega mikropladelæser og MARS Dataanalyse Software måle.
    9. Fluorescens fra den antibiotikum-behandlede biofilm (F antibiotikum-behandlede biofilm) og fluorescens fra de negative kontroller (F negativ kontrol) skal korrigeres ved subtraktion af baggrunds-fluorescensen fra brøndene indeholdende ASM alene (F blank). Den procentvise inhibering af levedygtighed efterfølgende beregnes som (gennemsnit af F antibiotiske behandlet biofilm / betyder F negativ kontrol) x 100%. Den BSMIC 90 er defineret som Antibiotic koncentration, der forårsager 90% inhibering af metabolisk aktivitet.

    4. Repræsentative resultater

    ASM biofilmdannelse er mulig i små (2 ml), mængderne og de ​​biofilm er fuldt dannet inden for 3 dage (fig. 1A). Dette kan påvises ved nøje pipettering biofilmen, som skal være vanskeligt at forstyrre. De mikrokolonier er sammenlignelige med dem, der dyrkes i større mængder 4 (fig. 1B). Figur 2 viser store forskelle mellem celler dyrket planktonically og i en biofilm, som detekteret ved elektronmikroskopisk billede analyse. Biofilm kulturer tydeligt betydelige niveauer af ekstracellulær matrix omgiver cellerne og individuelle strukturer i biofilmen er vanskelige at identificere.

    Adskillige undersøgelser antyder, at biofilmen livsstil kan påvirke antimikrobiel følsomhed 13, 14. Vores lille skala ASM assay kan anvendes til forværringrmine den BSMIC af multiple antibiotika flere isolater på samme tid. Arbejdsgangen af assayet er vist i figur 3. Virkningen af ​​antibiotika på bakteriel cellelevedygtighed kan måles under anvendelse af resazurin assay. Antibiotika, i dette tilfælde tobramycin, kan tilsættes til den etablerede biofilm og inkuberet i 24 timer. Efter dette biofilmen er afbrudt, og resazurin tilsættes.

    Metabolisk aktive celler kan reducere resazurin farvestoffet resulterer i en farveændring fra blå (resazurin) til lyserød (resorufin) 15. Figur 4A viser et eksempel assay, hvori P. aeruginosa blev inkuberet med forskellige koncentrationer af tobramycin før biofilm forstyrrelser og tilsætning af resazurin i en mikrotiterplade. Den blå ikke-fluorescerende farve indikerer ikke-levedygtige celler, hvorimod levende celler reducerer farvestoffet til den lyserøde fluorescerende form, resorufin. SMIC kan derefter beregnes ved at omdanne fluorescens i procentresterende bakteriel levedygtighed. Figur 4B viser ændringen i% levedygtighed med stigende tobramycin koncentration. 10% levedygtighed blev valgt som en cut-off for at beregne SMIC 90.

    Under aerobe betingelser er de tobramycinkoncentrationer SMIC 90 værdier større for celler dyrket som en biofilm end planktoniske kulturer. Tabel 1 viser variationen i PSMIC 90 og BSMIC 90 for alle testede isolater. Tabel 2 viser, at under aerobe betingelser blev en dramatisk forøgelse i resistens over for tobramycin (2 til> 32 fold stigning i SMIC) observeret i de fleste isolater, når de dyrkes i ASM (biofilm tilstand) sammenlignet med LB (planktoniske tilstand). Desuden udviste biofilm dyrket under mikroaerofile betingelser en forøget SMIC på mellem 2 og> 128 gange i sammenligning med biofilm dyrket under aerobe betingelser.

    Figur 1
    Figur1. Biofilm dannelse af P. aeruginosa i ASM P. aeruginosa stammen PAO1 danner makroskopisk synlige klumper (mikrokolonier), når der dyrkes i ASM. A biofilmdannelse i 30 ml ASM kulturer (stor-skala) efter 7 dages vækst i skruelåg glas Duran kolber. B, biofilmdannelse i 2 ml ASM kulturer ( mindre) efter 3 dages vækst i 24-brønds polystyrenplader.

    Figur 2
    Figur 2. TEM-mikrografier af ASM biofilm A / C TEM mikrograf (x, 27.000) af PAO1 dyrket planktonically og ASM henholdsvis B / D TEM mikrograf (x57, 000) af PAO1grown planktoniske og ASM, hhv. Planktonically dyrket bakterier blev dyrket natten over i LB-bouillon. Biofilm blev dyrket i 7 dage i 30 ml ASM kulturer. Sorte pile refererer til celler i biofilmen og stjerner refererer til ekstracellulære rum. Målestoksforhold = 1um.

    Figur 3
    Figur 3. Arbejdsgang af ASM biofilmen antimikrobiel følsomhed assay.

    Figur 4
    Figur 4. Anvendelse af resazurin til bestemmelse af antibiotika modtagelighed Bakterieceller blev inkuberet med forskellige koncentrationer af antibiotikum, og den resterende metaboliske aktivitet blev bestemt under anvendelse resazurin. A, blå ikke-fluorescerende oxideret form af resazurin angiver ikke-levedygtige celler og reduceres ved metabolisk aktive celler til lyserød fluorescerende resorufin. B er Fluorescensintensitet omdannes til procentdelen af tilbageværende bakteriel levedygtighed. 10% levedygtighed blev valgt som cut-off med henblik på at beregne MSMIC90. Klik her for at se larGER figur.

    Stammer PSMIC 90 (ug / ml) 1 BSMIC 90 (ug / ml) 1
    Aerobic Mikroaerofile 2 Aerobic Mikroaerofile 2
    PAO1 4 4 8 > 512
    Liverpool Epidemic Stamme (LES) isolerer
    LESB58 21 8 64 64 128
    LES400 22 32 128 8 256
    LESB25 16 32 256 512
    LESB55 16 64 64 > 512
    LESB64 16 64 > 512 > 512
    LES431 22 4 8 32 > 512
    LESB49 16 64 64 256
    LES109 32 128 32 > 512
    Ikke-LES isolater
    49461 16 32 16 > 512
    59032 0,5 2 4 > 512
    59073 > 512 > 512 > 512 > 512
    59076 16 32 32 > 512 </ Td>
    27 8 16 4 > 512
    45 16 32 4 > 512

    Tabel 1. Modtagelighed P. aeruginosa for tobramycin.

    En Til bestemmelse af PSMICs og BSMICs tobramycinkoncentrationer blev anvendt to-fold seriefortyndinger
    lige 512-0,5 ug / ml (n = 8 for hver koncentration) og 512-1 ug / ml (n = 4 for hver
    koncentration), henholdsvis; PSMICs blev bestemt under anvendelse af standard
    mikrofortyndingsplader metode 1.

    2 mikroaerofile betingelser var 5% O2, 10% CO2, og 85% N2.

    Strain PSMIC 90 / BSMIC 90 fold ændring 1
    PSMIC aerob
    PSMIC mikroaerofil
    BSMIC aerob
    BSMIC mikroaerofil
    PSMIC aerob
    BSMIC aerob
    PSMIC mikroaerofil
    BSMIC mikroaerofil
    PAO1 0 > 64 2 128
    LES isolerer
    LESB58 8 2 8 2
    LES400 4 32 0,25 2
    LESB25 2 2 16 16
    LESB55 4 > 8 4 > 8
    LESB64 4 ND > 32 > 8
    LES431 2 > 16 8 > 64
    LESB49 4 4 4 4
    LES109 4 16 0 > 4
    Ikke-LES isolater
    49461 2 > 32 0 > 16
    59032 4 > 128 8 > 256
    59073 ND ND ND ND
    59076 2 > 16 2 > 16
    27 2 > 128 0,5 > 32
    45 2 > 128 0,25 > 16

    Tabel 2 nedenfor. Fold ændring af PSMICs og BSMICs til tobramycin.

    1 ND, ikke bestemt; værdier i fed skrift indikerer SMIC fold ændringer> 10.

Discussion

I denne undersøgelse anvendte vi en hidtil ukendt in vitro-model baseret på ASM at replikere P. aeruginosa biofilm forhold i CF lunge 4. Modellen blev ændret med succes i lille skala, high-throughput test af antimikrobielle stoffer.

De kritiske trin i dette assay, er:

  1. Konsekvent forberedelsen af ​​ASM medier og opretholde sterilitet. Vi har anvendt mange timer på optimering den måde, hvorpå hver komponent er tilsat for at opnå reproducerbare resultater hver gang. Filtrering af ASM er langsom, men er at foretrække at autoklavering, hvilket kan beskadige mucin komponent. Vi anbefaler ikke tilsætning af antibiotika, som foreslået af andre 11, fordi dette kan indebære en betydelig selektive pres, drev mutationer, inducere profag lysis 16 og i væsentlig grad ændre udtryk af flere bakterielle gener.
  2. Assayet skal optimeres i overensstemmelse med volumenet of. ASM anvendes. Ryster hastigheder øges for mindre mængder, og en kortere biofilm livscyklus er observeret.

En oplagt anvendelse af små ASM biofilm model er mere realistisk bestemmelse af biofilm antimikrobielle modtagelighed (BSMIC 90). Anaerobe og mikroaerofile nicher er til stede i CF lunge, og der er tegn på, at ilt er begrænset dybt inde i moden biofilm 2, 17. Her viser vi, at 10/14 kliniske P. aeruginosa isolater fra CF patienter sputa udviser en betydelig (4 - ≥ 128 fold) reduktion i følsomhed over for tobramycin under mikroaerofile betingelser i ASM. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at antibiotika, såsom tobramycin, kan være mindre effektive mod P. aeruginosa-infektioner i CF lungen end angivet ved konventionelle følsomhed testmetoder. Disse resultater afspejler tidligere undersøgelser antimikrobiel følsomhed af biofilm 10. Lille-skala ASM analyser giver således en simpel high throughput platform for at skabe meningsfulde antibiotiske data om modtagelighed for bedre at informere terapeutiske beslutninger. Analysen er begrænset på samme måde som konventionel antibiotika resistensbestemmelse i det ene kolonier samles til screening, der måske ikke er repræsentativ for hele befolkningen. Men vi mener, at en tilgang (i) ved anvendelse af ikke-overflade vedlagte biofilm vækst og (ii) gælder for mikroaerofile betingelser, udgør et klart alternativ, og en potentiel forbedring af eksisterende metoder. Vi konkluderer, at denne test er en passende model til at studere P. aeruginosa biofilm befolkninger. Yderligere testning i kliniske omgivelser vil afgøre, om antibiotika modtagelighed baseret på biofilm-vokset P. aeruginosa kan føre til forskellige antibiotiske valg med potentielt forbedrede mikrobiologiske og kliniske resultater. Lignende undersøgelser der anvender klassiske biofilm modeller har vist, at BSMIC værdier førertil forskellige anbefalinger for behandling med antibiotika 5,17.

Ud over at teste for effektiviteten af anti-infektiøse agenter, repræsenterer ASM systemet en billig, enkel og reproducerbar alternativ til dyremodeller til undersøgelser som dem, der sigter mod at forstå spredning af P. aeruginosa befolkninger. Vi har observeret omfattende heterogenitet i naturlige populationer af P. aeruginosa inddrives fra CF patient sputa 18, 19. Lignende fænotypiske og genotypiske diversificering kan observeres under vækst i ASM 4 (og vores upublicerede data), hvilket gør det til et attraktivt in vitro model af CF lungesygdomme. Den relative enkelhed ASM model gør det let at designe langsigtede tilpasning eksperimenter rettet, for eksempel ved at overvåge virkningerne af antibiotika eller andre spændinger på P. aeruginosa befolkning divergens. Desuden kan andre bakterielle patogener dyrkes iASM. F.eks. Fouhy et al 2007 har anvendt ASM at studere biofilmdannelse af S. maltophillia 20.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi anerkender støtten fra Det Forenede Kongeriges National Institute for Health Research, Dr Hadwen Trust for Human Research, udelukkende af Storbritanniens førende medicinske forskning velgørenhedsorganisation, der støtter ikke-animalske forskning teknikker til at erstatte dyreforsøg, og Wellcome Trust (Grant 089.215). Vi anerkender også Novartis Pharmaceuticals England Ltd (ubegrænset SU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA from fish sperm Sigma-Aldrich 74782
Mucin from porcine stomach, type II Sigma-Aldrich M2378
L-Alanine Acros Organics 102830250
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006
L(+)-Asparagine monohydrate Acros Organics 175271000
L(+)-Aspartic acid Acros Organics 105041000
L-Cysteine Sigma-Adrich 168149
L(+)-Glutamic acid Acros Organics 156211000
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126
Glycine Acros Organics 220911000
L-Histidine Sigma-Adrich H8000
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000
L(+)-Lysine monohydrochloride Acros Organics 125222500
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625
L-Phenylalanine Acros Organics 130310250
L-Proline Sigma-Aldrich P0380
L-Serine Acros Organics 132660250
L-Threonine Acros Organics 138930250
L(-)-Tryptophan Acros Organics 140590250
L-Tyrosine Acros Organics 140641000
L-Valine Sigma-Aldrich V0500
Diethylenetriaminepentaacetic acid Sigma-Aldrich 32318
NaCl Fisher Scientific S/3160/60
KCl VWR BDH0258
KOH VWR BDH0262
Egg yolk emulsion Sigma-Aldrich 17148
ME 2 diaphragm vacuum pump Vacuubrand 696126
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) EMD Millipore SCGPT10RE
Luria-Bertani medium Sigma-Aldrich L2897
96-well microtitre plates Sarstedt Ltd 82.1581
24-well tissue culture-treated plates Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. 3820-024
CampyGen gas generation packs Oxford Labware CN0025
Microaerophilic chamber Oxford Labware HP0011
Tobramycin sulphate Sigma-Aldrich T1783
Cellulase, from Aspergillus niger Sigma-Aldrich 22178
Resazurin Sigma-Aldrich 199303
Citrate.H20 VWR BDH0288
Fluostar omega microplate reader BMG-Labtech SPECTROstar Omega

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).
  2. Worlitzsch, D. Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).
  3. Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis. Chest. 123, 1495-1502 (2003).
  4. Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung. J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).
  5. Garbe, J. Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions. BMC Microbiol. 10, 301 (2010).
  6. Naughton, S. Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung. PLoS One. 6, e24526 (2011).
  7. Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection. J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).
  8. Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).
  9. Bjarnsholt, T. Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients. Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).
  10. Hill, D. Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions. J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).
  11. Fung, C. Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum. J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).
  12. Andrews, J. M. BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8). The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).
  13. Rybtke, M. T. The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).
  14. Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).
  15. Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).
  16. Fothergill, J. L. Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).
  17. Singh, P. K. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms. Nature. 407, 762-764 (2000).
  18. Mowat, E. Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. (2011).
  19. Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations. J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).
  20. Fouhy, Y. Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia. J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).
  21. Winstanley, C. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Res. 19, 12-23 (2009).
  22. Carter, M. E. A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection. J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).
Brug af kunstig Sputum Medium til Test antibiotikum Effekt mod<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I forhold mere relevante for cystisk fibrose Lung
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).More

Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter