Nuværende diagnostisk antimikrobiel resistensbestemmelse bygger på planktoniske væksten af isolater i næringsrige og aerobe forhold. Her vil vi ansætte en alternativ kunstigt spyt medie til at studere antimikrobiel følsomhed af Pseudomonas aeruginosa biofilm under både aerobe og mikroaerofile betingelser yderligere en repræsentant for cystisk fibrose lunge.
Der er stigende bekymring relevans in vitro antimikrobielle følsomhedstests når det påføres isolater af P. aeruginosa fra cystisk fibrose (CF) patienter. Eksisterende fremgangsmåder er afhængige af en enkelt eller nogle få isolater dyrket aerobt og planktonically. Forudbestemte cut-off anvendes til at definere, om bakterierne er følsomme eller resistente over for en given antibiotikum 1. Men under kroniske lungeinfektioner i CF, s. aeruginosa befolkninger findes i biofilm, og der er bevis for, at miljøet er stort set mikroaerofil 2. Det skarp forskel i forhold mellem bakterier i lungerne, og dem under diagnostiske test har sat spørgsmålstegn ved pålideligheden og endda relevans af disse tests 3.
Kunstigt spyt medium (ASM) er et dyrkningsmedium indeholdende bestanddelene af CF patientens spyt, herunder aminosyrer, mucin og frit DNA. P. aeruginosa </ Em> vækst i ASM efterligner vækst i CF-infektioner, med dannelsen af selv-sammenhobning biofilm strukturer og befolkning divergens 4,5,6. Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en mikrotiter-plade assay at studere antimikrobiel følsomhed over P. aeruginosa er baseret på vækst i ASM, der gælder for både mikroaerofile og aerobe betingelser.
En ASM assay blev udviklet i en mikrotiterplade format. P. aeruginosa biofilm fik lov at udvikle sig i 3 dage forud for inkubation med antimikrobielle midler i forskellige koncentrationer i 24 timer. Efter biofilm afbrydelse blev cellelevedygtighed måles ved farvning med resazurin. Dette assay blev anvendt til at fastslå sessile cellen minimale inhiberende koncentration (SMIC) af tobramycin til 15 forskellige P. aeruginosa isolater under aerobe og mikroaerofile betingelser og SMIC værdier blev sammenlignet med dem opnået med standard bouillon vækst. Selv om der varnogle beviser for øgede MIC-værdierne for isolater dyrket i ASM, når sammenlignet med deres planktoniske modstykker, blev de største forskelle fundet med bakterier testet i mikroaerofile betingelser, som viste en meget forøget resistens til en> 128 fold, i retning tobramycin i ASM systemet, når sammenlignet med assays udført under aerobe betingelser.
Den manglende sammenhæng mellem de nuværende resistensbestemmelse metoder og klinisk resultat har stillet spørgsmålstegn ved gyldigheden af nuværende metoder 3. Adskillige in vitro-modeller har været anvendt tidligere til at studere P. aeruginosa biofilm 7, 8. Disse metoder er afhængige af overfladen fastgjorte biofilm, mens ASM biofilm ligner dem observeret i CF lungen 9. Desuden har reduceret oxygenkoncentration i slim vist sig at ændre opførslen af P. aeruginosa 2 og påvirke antibiotikum modtagelighed 10. Derfor using ASM under mikroaerofile betingelser kan give et mere realistisk miljø, hvor du kan studere antimikrobiel følsomhed.
I denne undersøgelse anvendte vi en hidtil ukendt in vitro-model baseret på ASM at replikere P. aeruginosa biofilm forhold i CF lunge 4. Modellen blev ændret med succes i lille skala, high-throughput test af antimikrobielle stoffer.
De kritiske trin i dette assay, er:
En oplagt anvendelse af små ASM biofilm model er mere realistisk bestemmelse af biofilm antimikrobielle modtagelighed (BSMIC 90). Anaerobe og mikroaerofile nicher er til stede i CF lunge, og der er tegn på, at ilt er begrænset dybt inde i moden biofilm 2, 17. Her viser vi, at 10/14 kliniske P. aeruginosa isolater fra CF patienter sputa udviser en betydelig (4 – ≥ 128 fold) reduktion i følsomhed over for tobramycin under mikroaerofile betingelser i ASM. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at antibiotika, såsom tobramycin, kan være mindre effektive mod P. aeruginosa-infektioner i CF lungen end angivet ved konventionelle følsomhed testmetoder. Disse resultater afspejler tidligere undersøgelser antimikrobiel følsomhed af biofilm 10. Lille-skala ASM analyser giver således en simpel high throughput platform for at skabe meningsfulde antibiotiske data om modtagelighed for bedre at informere terapeutiske beslutninger. Analysen er begrænset på samme måde som konventionel antibiotika resistensbestemmelse i det ene kolonier samles til screening, der måske ikke er repræsentativ for hele befolkningen. Men vi mener, at en tilgang (i) ved anvendelse af ikke-overflade vedlagte biofilm vækst og (ii) gælder for mikroaerofile betingelser, udgør et klart alternativ, og en potentiel forbedring af eksisterende metoder. Vi konkluderer, at denne test er en passende model til at studere P. aeruginosa biofilm befolkninger. Yderligere testning i kliniske omgivelser vil afgøre, om antibiotika modtagelighed baseret på biofilm-vokset P. aeruginosa kan føre til forskellige antibiotiske valg med potentielt forbedrede mikrobiologiske og kliniske resultater. Lignende undersøgelser der anvender klassiske biofilm modeller har vist, at BSMIC værdier førertil forskellige anbefalinger for behandling med antibiotika 5,17.
Ud over at teste for effektiviteten af anti-infektiøse agenter, repræsenterer ASM systemet en billig, enkel og reproducerbar alternativ til dyremodeller til undersøgelser som dem, der sigter mod at forstå spredning af P. aeruginosa befolkninger. Vi har observeret omfattende heterogenitet i naturlige populationer af P. aeruginosa inddrives fra CF patient sputa 18, 19. Lignende fænotypiske og genotypiske diversificering kan observeres under vækst i ASM 4 (og vores upublicerede data), hvilket gør det til et attraktivt in vitro model af CF lungesygdomme. Den relative enkelhed ASM model gør det let at designe langsigtede tilpasning eksperimenter rettet, for eksempel ved at overvåge virkningerne af antibiotika eller andre spændinger på P. aeruginosa befolkning divergens. Desuden kan andre bakterielle patogener dyrkes iASM. F.eks. Fouhy et al 2007 har anvendt ASM at studere biofilmdannelse af S. maltophillia 20.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender støtten fra Det Forenede Kongeriges National Institute for Health Research, Dr Hadwen Trust for Human Research, udelukkende af Storbritanniens førende medicinske forskning velgørenhedsorganisation, der støtter ikke-animalske forskning teknikker til at erstatte dyreforsøg, og Wellcome Trust (Grant 089.215). Vi anerkender også Novartis Pharmaceuticals England Ltd (ubegrænset SU).
Name of reagent | Company | Catalogue number |
DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 |
Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 |
L-Alanine | Acros Organics | 102830250 |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 |
L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 |
L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 |
L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 |
L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 |
Glycine | Acros Organics | 220911000 |
L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 |
L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 |
L-Serine | Acros Organics | 132660250 |
L-Threonine | Acros Organics | 138930250 |
L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 |
L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 |
NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 |
KCl | BDH | BDH0258 |
KOH | BDH | BDH0262 |
Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 |
ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 |
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | Millipore | SCGPT10RE |
Luria-Bertani medium | Sigma | L2897 |
96-well microtitre plates | Sarstedt | 82.1581 |
24-well tissue culture-treated plates | Iwaki | 3820-024 |
CampyGen gas generation packs | Oxoid | CN0025 |
Microaerophilic chamber | Oxoid | HP0011 |
Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 |
Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 |
Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 |
Citrate.H20 | BDH | BDH0288 |
Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |