वर्तमान नैदानिक रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण पोषक तत्व अमीर, एरोबिक परिस्थितियों में आइसोलेट्स planktonic विकास पर निर्भर करता है. यहाँ, हम एक वैकल्पिक कृत्रिम थूक के लिए दोनों एरोबिक और microaerophilic सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़ों के प्रतिनिधि की शर्तों के तहत Pseudomonas aeruginosa biofilms के रोगाणुरोधी संवेदनशीलता का अध्ययन मध्यम रोजगार.
There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a >128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.
इस अध्ययन में हम इन विट्रो मॉडल में एक उपन्यास का इस्तेमाल एएसएम पर आधारित पी. को दोहराने के aeruginosa CF फेफड़ों 4 भीतर biofilm शर्तें. मॉडल को सफलतापूर्वक छोटे पैमाने पर, antimicrobial एजेंटों की उच्च throughput परीक्षण के लिए संशोधित किया गया था.
इस परख की महत्वपूर्ण कदम हैं:
लघु ASM biofilm मॉडल की एक स्पष्ट आवेदन biofilm रोगाणुरोधी भावनाएँ (90 BSMIC) के और अधिक यथार्थवादी दृढ़ संकल्प है. Anaerobic और microaerophilic niches CF फेफड़ों में मौजूद हैं और वहाँ सबूत है कि ऑक्सीजन गहरे परिपक्व 2 biofilms, 17 के भीतर सीमित है. यहाँ हम दिखाना है कि 10/14 नैदानिक पी. tobramycin के लिए संवेदनशीलता में एएसएम में microaerophilic शर्तों के तहत कमी – सीएफ़ रोगी sputa से aeruginosa आइसोलेट्स एक काफी (≥ 128 गुना 4) एक्ज़िबिट. इस अध्ययन के परिणाम बताते हैं कि एंटीबायोटिक दवाओं, ऐसे tobramycin के रूप में, कम पी. के खिलाफ प्रभावी हो सकता है CF फेफड़ों में संक्रमण aeruginosa से पारंपरिक संवेदनशीलता परीक्षण तरीकों ने संकेत दिया. इन परिणामों 10 biofilms के रोगाणुरोधी संवेदनशीलता पर पिछले अध्ययनों को दर्शाते हैं. छोटेassays पैमाने पर एएसएम इस तरह सार्थक एंटीबायोटिक संवेदनशीलता डेटा बेहतर चिकित्सीय फैसले को सूचित करने के लिए एक सरल उच्च throughput मंच प्रदान करते हैं. परख उसी तरह पारंपरिक है कि एक कालोनियों में एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के रूप में है कि पूरी आबादी का प्रतिनिधि नहीं हो सकता है स्क्रीनिंग के लिए चुना जाता में सीमित है. हालांकि, हम मानते हैं कि (i) गैर सतह संलग्न biofilm विकास और (ii) microaerophilic शर्तों के लागू दृष्टिकोण का उपयोग कर, एक स्पष्ट विकल्प और मौजूदा तरीकों के लिए एक संभावित सुधार का प्रतिनिधित्व करता है. हम निष्कर्ष है कि इस परख पी. अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल है aeruginosa biofilm आबादी. नैदानिक सेटिंग में आगे परीक्षण का पता लगाना होगा कि एंटीबायोटिक भावनाएँ biofilm से बड़े हो पी. के आधार पर aeruginosa संभावित सुधार सूक्ष्मजीवविज्ञानी और नैदानिक परिणामों के साथ अलग एंटीबायोटिक विकल्प के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. क्लासिक biofilm मॉडल भी इसी तरह का उपयोग कर जांच से पता चला है कि BSMIC मूल्यों नेतृत्वएंटीबायोटिक उपचार 5,17 के लिए विभिन्न सिफारिशों को.
विरोधी संक्रामक एजेंटों के प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए इसके अलावा, एएसएम पी. के विविधीकरण को समझने के उद्देश्य से उन लोगों के रूप में इस तरह के अध्ययन के लिए एक सस्ता, सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पशु मॉडल के लिए वैकल्पिक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है aeruginosa आबादी. हम पी. की प्राकृतिक आबादी में व्यापक विविधता है मनाया aeruginosa सीएफ़ रोगी 18 sputa, 19 से बरामद किया. समान प्ररूपी और genotypic विविधीकरण 4 एएसएम (और हमारे अप्रकाशित डेटा) में वृद्धि के दौरान देखा जा सकता है, यह CF फेफड़ों की स्थिति के इन विट्रो मॉडल में एक आकर्षक बना रही है. एएसएम मॉडल के रिश्तेदार सादगी बनाता है यह आसान डिजाइन के लिए लंबी अवधि के अनुकूलन प्रयोगों पी. पर एंटीबायोटिक दवाओं या अन्य तनाव के प्रभाव की निगरानी में उदाहरण के लिए, उद्देश्य aeruginosa जनसंख्या विचलन. इसके अलावा, अन्य बैक्टीरियल रोगज़नक़ों में उगाया जा सकता हैएएसएम. उदाहरण के लिए, Fouhy एट अल 2007. एएसएम का इस्तेमाल किया है एस द्वारा biofilm गठन का अध्ययन 20 maltophillia.
The authors have nothing to disclose.
हम यूनाइटेड किंगडम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए संस्थान, डॉ. Hadwen ट्रस्ट, इंसानियत अनुसंधान के लिए ब्रिटेन की अग्रणी चिकित्सा अनुसंधान दान धन विशेष रूप से गैर पशु अनुसंधान के लिए पशु प्रयोगों की जगह तकनीक, और वेलकम ट्रस्ट (089,215 अनुदान) के समर्थन को स्वीकार करते हैं. हम भी नोवार्टिस दवा ब्रिटेन लिमिटेड (अप्रतिबंधित शैक्षिक अनुदान) स्वीकार करते हैं.
Name of reagent | Company | Catalogue number |
DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 |
Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 |
L-Alanine | Acros Organics | 102830250 |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 |
L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 |
L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 |
L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 |
L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 |
Glycine | Acros Organics | 220911000 |
L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 |
L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 |
L-Serine | Acros Organics | 132660250 |
L-Threonine | Acros Organics | 138930250 |
L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 |
L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 |
NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 |
KCl | BDH | BDH0258 |
KOH | BDH | BDH0262 |
Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 |
ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 |
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | Millipore | SCGPT10RE |
Luria-Bertani medium | Sigma | L2897 |
96-well microtitre plates | Sarstedt | 82.1581 |
24-well tissue culture-treated plates | Iwaki | 3820-024 |
CampyGen gas generation packs | Oxoid | CN0025 |
Microaerophilic chamber | Oxoid | HP0011 |
Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 |
Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 |
Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 |
Citrate.H20 | BDH | BDH0288 |
Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |