Gjeldende diagnostiske antimikrobiell resistenstesting er avhengig av planktoniske veksten av isolater i næringsrike, aerobic forhold. Her benytter vi en alternativ kunstig spytt medium for å studere antimikrobiell følsomhet Pseudomonas aeruginosa biofilm under begge aerobe og mikroaerofile forholdene mer representative for cystisk fibrose lunge.
Det er økende bekymring om relevansen av in vitro antimikrobielle mottakelighet tester når den brukes til isolater av P. aeruginosa fra cystisk fibrose (CF) pasienter. Eksisterende metoder stole på én eller noen få isolater vokst aerobt og planktonically. Forhåndsbestemt cut-offs brukes til å definere om bakteriene er følsomme eller resistente mot et gitt antibiotikum en. Men under kroniske lungeinfeksjoner i CF, P. aeruginosa populasjoner finnes i biofilmer og det er bevis på at miljøet er stort sett mikroaerofile to. Den brutale forskjellen i forhold mellom bakterier i lungene og de som i løpet av diagnostisk testing har kalt inn spørsmålet pålitelighet og selv relevansen av disse testene 3.
Kunstig sputum medium (ASM) er en kultur medium som inneholder komponenter av CF pasient sputum, inkludert aminosyrer, mucin og gratis DNA. P. aeruginosa </ Em> vekst i ASM etterligner vekst i CF infeksjoner, med dannelsen av egen tilsammen biofilm strukturer og befolkning divergens 4,5,6. Målet med denne studien var å utvikle en microtitre-plate analysen å studere antimikrobiell følsomhet P. aeruginosa basert på vekst i ASM, som gjelder både mikroaerofile og aerobe forhold.
En ASM analysen ble utviklet i en microtitre plate format. P. aeruginosa biofilmer fikk lov til å utvikle for 3 dager før inkubasjon med antimikrobielle midler på ulike konsentrasjoner i 24 timer. Etter biofilm avbrudd, ble celleviabilitet målt ved farging med resazurin. Denne analysen ble brukt til å fastslå fastsittende cellen minste hemmende konsentrasjon (SMIC) av tobramycin for 15 ulike P. aeruginosa isolater under aerobe og mikroaerofile forhold og SMIC verdier ble sammenlignet med de som oppnås med standard kjøttkraft vekst. Mens det varnoen bevis for økte MIC verdier for isolater dyrket i ASM i forhold til sine planktoniske kolleger, ble de største forskjellene fant med bakteriene som ble testet i mikroaerofile forhold, som viste en mye økt motstand opp til a> 128 fold, mot tobramycin i ASM systemet når sammenlignet med analyser utført i aerobe forhold.
Mangelen på sammenheng mellom dagens resistenstesting metoder og klinisk resultat har stilt spørsmål ved gyldigheten av dagens metoder 3. Flere in vitro modeller har blitt brukt tidligere for å studere P. aeruginosa biofilmer 7, 8. Men disse metodene er avhengige av overflaten festet biofilm, mens ASM biofilm likner som er observert i CF lunge 9. I tillegg har redusert oksygenkonsentrasjon i slimet vist seg å endre atferden til P. aeruginosa 2 og påvirke antibiotika mottakelighet 10. Derfor using ASM henhold mikroaerofile forhold kan gi en mer realistisk miljø der for å studere antimikrobiell følsomhet.
I denne studien brukte vi en roman in vitro modell basert på ASM å replikere P. aeruginosa biofilm forhold innen CF lunge 4. Modellen ble endret vellykket for småskala, high-throughput testing av antimikrobielle midler.
De kritiske trinnene i denne analysen er:
En åpenbar anvendelse av småskala ASM biofilm modellen er mer realistisk bestemmelse av biofilm antimikrobielle følsomhet (BSMIC 90). Anaerobe og mikroaerofile nisjer er tilstede i CF lunge og det er bevis for at oksygen er begrenset dypt inne moden to biofilm, 17. Her demonstrerer vi at 10/14 kliniske P. aeruginosa isolater fra CF pasient slim viser en betydelig (4 – ≥ 128 ganger) reduksjon i følsomheten for tobramycin etter mikroaerofile forhold i ASM. Resultatene av denne studien tyder på at antibiotika, for eksempel tobramycin, kan være mindre effektiv mot P. aeruginosa infeksjoner i CF lungene enn indikert ved konvensjonelle resistenstesting metoder. Disse resultatene gjenspeiler tidligere studier om den antimikrobielle mottakelighet av biofilm 10. Small-skala ASM analyser således gi en enkel høy gjennomstrømning plattform for å generere meningsfulle antibiotika mottakelighet data for å bedre informere terapeutiske beslutninger. Analysen er begrenset på samme måte som vanlig antibiotika resistenstesting i at enkle kolonier plukkes for screening som kanskje ikke er representative for hele befolkningen. Vi mener imidlertid at en tilnærming (i) bruk av ikke-overflate festet biofilm vekst og (ii) gjelder mikroaerofile forhold, representerer et klart alternativ og en potensiell forbedring til eksisterende metoder. Vi konkluderer at denne analysen er en hensiktsmessig modell for å studere P. aeruginosa biofilm populasjoner. Ytterligere testing i kliniske settinger ville avklare om antibiotika følsomhet basert på biofilm-vokst P. aeruginosa kan føre til ulike antibiotika valg med potensielt bedre mikrobiologiske og klinisk utfall. Lignende undersøkelser ved hjelp av klassisk biofilm modeller har vist at BSMIC verdier føretil ulike anbefalinger for antibiotikabehandling 5,17.
I tillegg til testing for effektiviteten av anti-smittestoffer, representerer ASM systemet en billig, enkel og reproduserbar alternativ til dyremodeller for studier slik som de tar sikte på å forstå spredning av P. aeruginosa populasjoner. Vi har observert omfattende heterogenitet i naturlige populasjoner av P. aeruginosa utvinnes fra CF pasient 18 slim, 19. Lignende fenotypiske og genotypiske diversifisering kan observeres under vekst i ASM 4 (og våre upubliserte data), noe som gjør det til et attraktivt in vitro modell av CF lungelidelser. Den relative enkelhet av ASM-modellen gjør det enkelt å utforme langsiktige tilpasning eksperimenter rettet, for eksempel ved å overvåke effekten av antibiotika eller andre påkjenninger på P. aeruginosa befolkning divergens. I tillegg kan andre bakterielle patogener dyrkes iASM. For eksempel, Fouhy et al. 2007 har brukt ASM å studere biofilmdannelse ved S. maltophillia 20.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner støtte fra Storbritannia National Institute for Health Research, Dr Hadwen Trust for Humane forskning, Storbritannias ledende medisinsk forskning veldedighet finansiering utelukkende ikke-animalske forskning teknikker for å erstatte dyreforsøk, og Wellcome Trust (Grant 089 215). Vi erkjenner også Novartis Storbritannia Ltd (ubegrenset lærerikt tilskudd).
Name of reagent | Company | Catalogue number |
DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 |
Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 |
L-Alanine | Acros Organics | 102830250 |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 |
L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 |
L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 |
L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 |
L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 |
Glycine | Acros Organics | 220911000 |
L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 |
L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 |
L-Serine | Acros Organics | 132660250 |
L-Threonine | Acros Organics | 138930250 |
L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 |
L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 |
NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 |
KCl | BDH | BDH0258 |
KOH | BDH | BDH0262 |
Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 |
ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 |
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | Millipore | SCGPT10RE |
Luria-Bertani medium | Sigma | L2897 |
96-well microtitre plates | Sarstedt | 82.1581 |
24-well tissue culture-treated plates | Iwaki | 3820-024 |
CampyGen gas generation packs | Oxoid | CN0025 |
Microaerophilic chamber | Oxoid | HP0011 |
Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 |
Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 |
Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 |
Citrate.H20 | BDH | BDH0288 |
Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |