Nuvarande diagnostiska resistensbestämning bygger på plankton tillväxt isolat i näringsrika och aeroba förhållanden. Här använder vi ett alternativt artificiellt sputum medium för att studera antimikrobiell känslighet Pseudomonas aeruginosa biofilmer under både aeroba och mikroaerofila förhållanden mer representativa för cystisk fibros lungan.
Det finns en växande oro för betydelsen av in vitro resistensbestämning tester när de tillämpas på isolat av P. aeruginosa av cystisk fibros (CF) patienter. Existerande metoder förlitar sig på enkel eller några isolat odlades aerobt och planktonically. Förutbestämda cut-off används för att definiera om bakterierna är känsliga eller resistenta mot en viss antibiotika 1. Under kroniska lung infektioner i CF, P. aeruginosa populationer finns i biofilmer och det finns belägg för att miljön är i stort sett mikroaerofila 2. Den markanta skillnaden i förutsättningar mellan bakterier i lungan och de som under diagnostiska tester har ifrågasatt tillförlitligheten och även betydelsen av dessa tester 3.
Artificiell sputum medium (ASM) är ett odlingsmedium som innehåller komponenter av CF patientens sputum, inklusive aminosyror, mucin och gratis DNA. P. aeruginosa </ Em> tillväxt i ASM härmar tillväxt under CF infektioner, med bildandet av själv samlar biofilm strukturer och befolkningens divergens 4,5,6. Syftet med denna studie var att utveckla en mikro-platta analys för att studera antimikrobiell känslighet P. aeruginosa baserat på tillväxt i ASM, som är tillämplig på både mikroaerofila och aeroba förhållanden.
En ASM analys utvecklades i en mikrotiterplatta format. P. aeruginosa biofilmer fick utvecklas under 3 dagar före inkubation med antimikrobiella medel vid olika koncentrationer under 24 timmar. Efter biofilm störningar, var cellviabiliteten mättes genom färgning med resazurin. Denna analys användes för att fastställa den fastsittande celler minsta inhiberande koncentrationen (SMIC) av tobramycin för 15 olika P. aeruginosa isolat under aeroba och mikroaerofila förhållanden och SMIC värden jämfördes med de som erhölls med standard-buljong tillväxt. Även om det fannsvissa bevis för ökade MIC-värden för isolat odlas i ASM jämfört med sina planktoniska motsvarigheter, var de största skillnaderna finns med bakterier testade mikroaerofila förhållanden, som visade ett mycket ökat motstånd upp till en> 128 gånger, mot tobramycin i ASM systemet när jämfört med analyser som utförs i aeroba betingelser.
Bristen på koppling mellan nuvarande metoder resistensbestämning, och kliniskt resultat har ifrågasatt giltigheten av nuvarande metoder 3. Flera in vitro-modeller har använts tidigare för att studera P. aeruginosa biofilmer 7, 8. Men dessa metoder är beroende av ytan bifogade biofilmer, medan ASM biofilmen liknar de som observerats i CF lungan 9. Dessutom har minskad syrekoncentration i slem visats påverka beteendet hos P. aeruginosa 2 och påverka antibiotikakänslighet 10. Därför using ASM i mikroaerofila förhållanden kan ge en mer realistisk miljö att studera antimikrobiell känslighet.
I denna studie använde vi en ny in vitro modell baserad på ASM att replikera P. aeruginosa biofilm villkoren inom CF lungan 4. Modellen ändrades framgångsrikt för småskalig, hög genomströmning testning av antimikrobiella medel.
De kritiska stegen i denna analys är följande:
En uppenbar tillämpning av småskalig ASM biofilm modell är mer realistisk bestämning av biofilm antimikrobiella känslighet (BSMIC 90). Anaeroba och mikroaerofila nischer finns i CF lungan och det finns bevis för att syre är begränsad djupt inom mogna biofilmer 2, 17. Här visar vi att 10/14 klinisk P. aeruginosa isolat från CF patienter sputa uppvisar en betydande (4 – ≥ 128 gånger) minskning i känslighet för tobramycin i mikroaerofila förhållanden i ASM. Resultaten av denna studie antyder att antibiotika, såsom tobramycin, kan vara mindre effektiva mot P. aeruginosa infektioner i CF lungan än vad som anges med konventionella metoder resistensbestämning. Dessa resultat återspeglar tidigare studier om antimikrobiella känsligheten hos biofilmer 10. Litenskala ASM analyser ger därmed en enkel hög genomströmning plattform för att generera meningsfulla antibiotikakänslighet data för att bättre informera terapeutiska beslut. Analysen är begränsad på samma sätt som traditionell antibiotikabehandling resistensbestämning i att enstaka kolonier plockas för screening som kanske inte är representativa för hela befolkningen. Vi tror dock att ett tillvägagångssätt (i) att använda icke-ytan bifogade biofilm tillväxt och (ii) för mikroaerofila förhållanden, utgör ett tydligt alternativ och en potentiell förbättring av befintliga metoder. Vi drar slutsatsen att denna analys är en lämplig modell för att studera P. aeruginosa biofilm populationer. Ytterligare testning i kliniska skulle avgöra om antibiotika känslighet baserat på biofilmen odlade P. aeruginosa kan leda till olika antibiotika val med potentiellt förbättrade mikrobiologiska och klinisk resultat. Liknande undersökningar med klassiska biofilm modeller har visat att BSMIC värden ledertill olika rekommendationer för antibiotikabehandling 5,17.
Förutom testning för effektiviteten av anti-infektiösa agens utgör ASM systemet en billig, enkel och reproducerbar alternativ till djurmodeller för studier som de syftar till att förstå diversifiering av P. aeruginosa populationer. Vi har observerat en omfattande heterogenitet i naturliga populationer av P. aeruginosa återhämtat sig från CF patienter sputa 18, 19. Liknande fenotypiska och genotypiska diversifiering kan observeras under tillväxt i ASM 4 (och våra opublicerade data), vilket gör det till ett attraktivt in vitro modell av CF lung villkoren. Den relativa enkelhet ASM-modellen gör det enkelt att utforma långsiktiga anpassning försök riktar sig till, till exempel att övervaka effekterna av antibiotika eller andra påfrestningar på P. aeruginosa befolkningen divergens. Dessutom kan andra bakteriella patogener odlas iASM. Till exempel Fouhy et al. 2007 har använt ASM för att studera biofilm bildning av S. maltophillia 20.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner stöd av Förenade kungarikets National Institute for Health Research, Dr Hadwen Trust för Humane Research, Storbritanniens ledande medicinsk forskning välgörenhet finansiering uteslutande utan djurförsök tekniker för att ersätta djurförsök, och Wellcome Trust (Grant 089.215). Vi erkänner också Novartis Pharmaceuticals Storbritannien Ltd (obegränsad utbildningsbidrag).
Name of reagent | Company | Catalogue number |
DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 |
Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 |
L-Alanine | Acros Organics | 102830250 |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 |
L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 |
L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 |
L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 |
L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 |
Glycine | Acros Organics | 220911000 |
L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 |
L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 |
L-Serine | Acros Organics | 132660250 |
L-Threonine | Acros Organics | 138930250 |
L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 |
L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 |
NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 |
KCl | BDH | BDH0258 |
KOH | BDH | BDH0262 |
Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 |
ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 |
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | Millipore | SCGPT10RE |
Luria-Bertani medium | Sigma | L2897 |
96-well microtitre plates | Sarstedt | 82.1581 |
24-well tissue culture-treated plates | Iwaki | 3820-024 |
CampyGen gas generation packs | Oxoid | CN0025 |
Microaerophilic chamber | Oxoid | HP0011 |
Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 |
Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 |
Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 |
Citrate.H20 | BDH | BDH0288 |
Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |