Summary
Eksperimentel rotte endocarditis model på grund af methicillin-resistente
Abstract
Endovaskulære infektioner, herunder endocarditis, er livstruende infektionssygdomme syndromer 1-3. Staphylococcus aureus er den mest almindelige verdensplan årsagen til sådanne syndromer med uacceptabelt høj morbiditet og mortalitet selv med passende antimikrobielle middel behandlinger 4-6. Stigningen i infektioner på grund af methicillin-resistente S. aureus (MRSA), de høje vancomycin kliniske behandling fejl og voksende problemer med linezolid og daptomycin modstand har alle yderligere kompliceret behandling af patienter med sådanne infektioner, og førte til høje udgifter til sundhedsvæsenet 7, 8. Desuden bør det understreges, at de seneste undersøgelser med antibiotika behandlingsresultater er baseret på kliniske indstillinger, og dermed kan meget vel blive påvirket af værtfaktorer varierende fra patient til patient. Derfor er en relevant dyremodel for endovaskulær infektion, hvor værtsfaktorer svarer fra dyr til dyr, er mereafgørende at undersøge mikrobiel patogenese, såvel som virkningen af hidtil ukendte antimikrobielle midler. Endocarditis hos rotter er en veletableret eksperimentel dyremodel, der nøje tilnærmer human nativ ventil endocarditis. Denne model er blevet anvendt til at undersøge rollen af visse stafylokok virulensfaktorer og effektiviteten af antibiotika behandlingsregimer for stafylokok endocarditis. I denne rapport beskriver vi den eksperimentelle endocarditis modellen på grund af MRSA, der kunne bruges til at undersøge bakteriel patogenese og respons på antibiotisk behandling.
Protocol
1. Klargøring af MRSA-stammer for Infektion
- Inokulere en løkkefuld af MRSA kultur fra en bestand rør ved -80 ° C til en fåreblod Trypticase Soy Agar (TSA) plade (se tabel specifikke reagenser og udstyr), og der inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Kontroller renheden af kulturen på blodagar plade (tilsvarende koloni fænotyper) for at sikre, at der ikke er nogen forurening.
- Vælge en koloni fra fåreblod TSA plade og inokulere koloni i 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) i et 15 ml snap-capped rør.
- Inkuber ved 37 ° C natten over under omrystning ved 200 rpm.
2. Forberedelse Kirurgi Katetre
Skær polyethylen rør (PE10;. Becton Dickinson, for ingen 427.401) til 10 cm længder, og smelter den ene ende ved at trykke på spidsen med en steril pincet. Med henblik på forsegling af den ene ende af kateteret er at undgå blødning under kateterisering.
3. Pre-Surgery Forberedelse og Anæstesi
- Sted Sprague-Dawley rotter (Harlan, Indianapolis, Ind hunkøn, 250-300 g) i et kammer indeholdende isofluoran-oxygen gasblanding (50%: 50%), indtil den anæstetiske får virkning (f.eks musklerne er afslappede og pedal reflekser er fraværende ), og vedligeholde dyr i en bedøvet tilstand under operationen med gasblandingen.
- Rengør nakken fra hage til lige under brystbenet med Betadine og 70% ethanol.
4. Kirurgisk procedure
- Brug steril teknik hele operationen. Lave et snit (1-1,5 cm) vertikalt gennem kun hudlag af halsen over brystbenet.
- Ved stump dissektion, fascia adskille at eksponere den højre halspulsåre ved hjælp af 2 par krumme fortandede pincet.
- Træk forsigtigt arterien op af halsen hulrum, og placere to 10 cm længder af silke sutur under arterie og binde off arterien ved den udsatte cefale enden, skal du placere et klip på ArteRy at forhindre blødning.
- Lav et lille hul i toppen af arterien ved hjælp af et kateter introducerende (Becton Dickinson, bestillingsnr. 406.999), indsætte et kateter med en pincet gennem hullet i arterien, fjerne klippet, og tryk ned kateteret mod hjertet, indtil modstand er opfyldt.
- Binde løs suturen omkring den kaudale ende af arterie og fastgøre katetret på plads med silkesutur, når kateteret er på plads som bestemt ved: i) længden af kateter (4-5 cm), ii) modstand mod yderligere fremføring og iii) pulsering af kateteret med hjerteslag. Forlade kateteret i stedet for resten af eksperimentet.
- Skær overskydende sutur og kateter ender, og sørg for, at der ikke er nogen blødning fra kateteret. Putte de løse ender under halsen og lukke huden med huden clips.
- Placer rotten i buret på et varmt sted, indtil udvundet fra anæstesi, og give mad og vand. Se rotte hyppigt under ogEfter genvinding fra anæstesi.
- Denne operation er en "kategori E" procedure. De procedurer, der produceres smerte er unrelieved af smertestillende midler siden MRSA-infektioner følger gene for dyrene.
5. MRSA
- Infektion kan udføres mellem 1 og 7 dage efter kirurgi, men holder overensstemmende inden forsøg.
- Ren rotte hale med 70% ethanol, og injicere 0,5 ml MRSA ved en ønsket celletælling (10 april - 10 juni cfu / dyr for de fleste S. aureus-stammer). Med 27 G 1/2 inch nål intravenøst fra halevenen Forsigtig : MRSA kultur hører til biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) og har moderat potentiel fare for personale og miljø.
- Holde trykket på stedet, indtil hæmostase forekommer før returnering af rotte til buret.
6. Offer Rotter og Kultur Målvæv
- Ofre rotter ved ip injektion af natriumpentobarbital (200 mg/ Kg) efter 1 til 6 dage efter infektion.
- Placer rotte på ryggen og tør brystet med 70% ethanol.
- Foretag en V-formet indsnit i brystet nedenfor brystbenet, og skære brusken af ribber på hver side af brystbenet at blotlægge hjertet.
- Træk hjertet blidt op, og klip gennem hjertet vævet tæt på aorta og dissekere op for at frigøre hjertet.
- Placere hjerte på en steril petriskål med 4x4 inch gaze indersiden lave et snit gennem den venstre ventrikel indervæg og åbne venstre-sidet kammer.
- Kontroller visuelt for kateter placering. Undersøge og fjerne vegetationen fra ventilen med saks og pincet.
- Vejes og homogeniseres i vegetationen, og gør seriefortyndinger med PBS til kvantitativ kultur.
7. Repræsentative resultater
Umiddelbart efter indsættelse af kateteret ind i arterien og trykke ned kateteret omkring 4-5 cm i retning mod hjertet, vil en modstand være erfaringspæced. Hvis ingen modstand afføles, kan kateteret ikke med held har været indsat i venstre side af hjertekammeret, hvilket kan påvirke placeringen af katetret. En korrekt kateteranbringelse tidligere offentliggjorte 9 er vist i figur 1.
En del af MRSA prøver skal være kvantitativ kulturperler den sørg nøjagtige levedygtige bakterietallet for infektion og renheden af infektion prøve. Desuden bør de organismer udvundet fra vegetationen være de samme som dem, der anvendes i podestoffet.
Tabel 1 viser et eksempel på virulens af en S. aureus-stamme i rotte endocarditis model, som blev offentliggjort tidligere 9. Alle dyrene påvirket med inocula 10 5 og 10 6 cfu og aflivet mellem 3 til 6 dage efter infektion udviklede endocardits med høj S. aureus densiteter i de kardiale vegetationen samt nyrer og milt ( en SD, standardafvigelse. P <0,001 for 10 5 eller 10 6 CFU-udfordrede dyr. Tabel 1. S. aureus densitet i hjerte vegetationen med forskellige inokula i rotte endocarditis modellen 9. 
Figur 1. Kateteret er i en korrekt sted (venstre side af hjertekammeret), og adskillige vegetationen er synlige omkring aorta ventilerne 9. Inokulum (antal Animas) Betyder log 10 cfu / g væv ± SD en i: Vegetation Nyre Milt 10 6 CFU / dyr (9) 10,36 ± 0,85 7,30 ± 0,64 6,70 ± 0,57 10 5 CFU / dyr (8) 9,93 ± 0,53 7,14 ± 0,53 6,44 ± 0,63 10 4 CFU / dyr (7) 3,46 ± 0,50 * 1,81 ± 0,74 * 1,58 ± 0,59 *
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rotten endocarditis er en vigtig og velkarakteriserede dyremodeller for in vivo-undersøgelser i patogenesen og antimikrobielle midler i behandlingen af bakterieinfektioner 9-11. Desuden repræsenterer rotte endocarditis model sammensat af akutte og sub-akutte infektioner, og nøje efterligner menneskelige modstykke og human indfødte ventil endocarditis. Desuden, ledsaget af en bolig kateter, det repræsenterer en klassisk biofilm-associeret infektion, en fælles og vanskeligt spørgsmål i kliniske omgivelser 12. Vigtigst resultater frembragt med rotte-endocarditis model er meget reproducerbare.
Patogeniciteten af S. aureus i rotte endocarditis modellen, da andre dyremodeller, varierer kan afhængigt af en række parametre, herunder inokulum dosis, bakteriel vækstfase (log vs stationær), alder dyr og dyr genetisk baggrund 9, 13. Kirurgiske succesrate er highly afhængig af teknisk ekspertise og kirurgiske færdigheder forskeren. Succes i kirurgi kan måles ved: 1) det antal dyr, der inddrager fra kirurgi, 2) kateteret i en korrekt sted på tidspunktet for aflivning og 3) vegetationen stede på hjerteklapper.
Sammenfattende er rotte endocarditis en praktisk, reproducerbar og vigtig model, der efterligner den kliniske situation nøje. Derfor er det hensigtsmæssigt for alle områder af sepsis forskning, herunder mikrobiel patogenese og effekten af antimikrobielle stoffer i behandlingen af eksperimentelle endocarditis syndromer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det amerikanske National Institutes of Health [tilskud R01AI-39.108 til ASB] og American Heart Association [tilskud SDG 0630219N og AID 09GRNT2180065 til YQX].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plate, 5% sheep blood in Trypticase Soy agar(TSA) | Hardy Diagnostics | A10BX | |
| Trypticase Soy broth (TSB) | BD Biosciences | 211825 | |
| Shaking incubator | Labnet International | I5311-DS | |
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | |
| Catheter introducer | BD Biosciences | 6999 | |
| Isofluorance | Western Medical Suppy, Inc | 2147 | Follow safety and handling information |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc. | Find the instruments from the two companies for your needs |
References
- Petti, C. A., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis. Cardiol. Clin. 21, 219-233 (2003).
- Bashore, T. M., Cabell, C., Fowler, V. Update on infective endocarditis. Curr. Probl. Cardiol. 31, 274-352 (2006).
- Fowler, V. G. Jr, Justice, A., Moore, C. Risk factors for hematogenous complications of intravascular catheter-associated Staphylococcus aureus bacteremia. Clin. Infect. Dis. 17, 313-320 (1993).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin. Infect. Dis. 39, 309-317 (2004).
- Hoen, B. Special issues in the management of infective endocarditis caused by gram-positive cocci. Infect Dis. Clin. North Am. 16, 437-452 (2002).
- Moise, P. A., Hershberger, E., Amodio-Groton, M. I., Lamp, K. C. Safety and clinical outcomes when utilizing high-dose (> or =8 mg/kg) daptomycin therapy. Ann. Pharmacother. 43, 1211-1219 (2009).
- Sakoulas, G., Brown, J., Lamp, K. C., Friedrich, L. V., Lindfield, K. C. Clinical outcomes of patients receiving daptomycin for the treatment of Staphylococcus aureus infections and assessment of clinical factors for daptomycin failure: a retrospective cohort study utilizing the Cubicin Outcomes Registry and Experience. Clin. Ther. 31, 1936-1945 (2009).
- Xiong, Y. Q., Willard, J., Kadurugamuwa, J. L., Yu, J., Francis, K. P., Bayer, A. S. Real-time in vivo bioluminescent imaging for evaluating the efficacy of antibiotics in a rat Staphylococcus aureus endocarditis model. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 380-387 (2005).
- Peerschke, E. I., Bayer, A. S., Ghebrehiwet, B., Xiong, Y. Q. gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an animal model of infective endocarditis. Infect. Immun. 74, 4418-4423 (2006).
- Ganesh, V. K., Rivera, J. J., Smeds, E. A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics. PLoS Pathog. 4, e1000226 (2008).
- Boles, B. R., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm disassembly. Trends Microbiol. , (2011).
- Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). J. Vis. Exp. (48), e2528 (2011).
