Summary
Eksperimentell rotte endokarditt modell på grunn av meticillinresistente
Abstract
Endovaskulære infeksjoner, inkludert endokarditt, er livstruende smittsomme syndromer 1-3. Staphylococcus aureus er den vanligste verdensomspennende årsak til slike syndromer med uakseptabelt høy sykelighet og dødelighet selv med egnede antimikrobielt middel behandlinger 4-6. Økningen i infeksjoner på grunn av meticillinresistente S. aureus (MRSA), den høye forekomsten av vankomycin kliniske behandlingssvikt og voksende problemer av linezolid og daptomycin motstand har all videre komplisert behandling av pasienter med slike infeksjoner, og førte til høye helsekostnader 7, 8. I tillegg bør det understrekes at de fleste nyere studier med antibiotika behandlingsresultatene har vært basert på kliniske settinger, og dermed kan godt være påvirket av vertsfaktorer varierende fra pasient til pasient. Derfor er en relevant dyremodell av endovaskulær infeksjon der vertsfaktorer er lik fra dyr til dyr meravgjørende for å undersøke mikrobiell patogenese, samt effekten av nye antimikrobielle midler. Endokarditt i rotte er en veletablert eksperimentell dyremodell som tett tilnærmet menneskelig innfødt ventil endokarditt. Denne modellen har blitt brukt til å undersøke hvilken rolle spesielle stafylokokker virulensfaktorer og effekten av antibiotika behandlingsregimer for stafylokokk endokarditt. I denne rapporten beskriver vi den eksperimentelle endokarditt modellen på grunn av MRSA som kan brukes til å undersøke bakteriell patogenese og respons på antibiotikabehandling.
Protocol
1. Klargjøre MRSA stammer til infeksjon
- Inokuler en loopful av MRSA kultur fra et lager rør ved -80 ° C til en saueblod Trypticase Soy agar (TSA) plate (se tabell over spesifikke reagenser og utstyr), og inkuber ved 37 ° C for natten.
- Sjekk renhet av kulturen på blod agar plate (tilsvarende kolonistimulerende fenotyper) å sørge for at det ikke er forurensning.
- Plukk en koloni fra saueblod TSA plate og inokuler kolonien i 5 ml Trypticase Soy kjøttkraft (TSB) i en 15 ml snap-capped tube.
- Inkuber ved 37 ° C over natten med rist ved 200 rpm.
2. Forbereder Kirurgi Kateter
Klipp polyetylen rør (PE10;. Becton Dickinson, best.nr. 427 401) til 10 cm lengder, og smelte den ene enden ved å trykke på spissen med en steril pinsett. Hensikten med tetting ene enden av kateteret er å unngå blødning under kateterisering.
3. Pre-surgery Forberedelse og anestesi
- Place Sprague-Dawley rotte (Harlan, Indianapolis, Ind kvinnelig, 250-300 gram) i et kammer som inneholder isofluorane-oksygen gassblanding (50%: 50%) inntil bedøvelsen trer i kraft (f.eks musklene er avslappet og pedal reflekser er fraværende ), og opprettholde dyr i en bedøvet tilstand under operasjonen med gassblandingen.
- Rengjør nakken fra hake til like under brystbenet med Betadine og 70% etanol.
4. Kirurgisk prosedyre
- Bruk steril teknikk gjennom hele operasjonen. Lag et snitt (1-1,5 cm) vertikalt gjennom bare huden laget av halsen over sternum.
- Ved hjelp av stump disseksjon, skille fascia å eksponere riktig carotisar bruker 2 par buede toothed tang.
- Dra forsiktig arterien opp av halsen hulrom, og plassere to 10 cm lengder av silke sutur under arterien og feste arterien på den eksponerte cephalica slutten, plasserer et klipp på artery for å hindre blødning.
- Lag et lite hull i toppen av arterien ved hjelp av et kateter introducer (Becton Dickinson, bestillingsnr. 406 999), sette inn et kateter med en tang gjennom hullet i arterien, fjerne klippet og trykk ned kateteret mot hjertet til motstand er oppfylt.
- Knytt løs sutur rundt kaudal slutten av arterie og fest kateteret på plass med silke sutur når kateteret er på plass som bestemmes ved: i) lengden av kateter (4-5 cm), ii) motstand mot videre avansement , og iii) pulsering av kateteret med hjerteslag. La kateteret på plass for resten av forsøket.
- Skjær overflødig sutur og kateter ender, og sørg for at det ikke er blødning fra kateteret. Brette de løse endene under huden i nakken og lukker huden med hud klipp.
- Plasser rotte i buret på et lunt sted før bedring av bedøvelsen, og gi mat og vann. Sjekk rotte ofte under ogetter utvinning fra anestesi.
- Denne operasjonen er en "Kategori E" prosedyre. Prosedyrene produserte smerte er avhjulpne av smertestillende siden MRSA-infeksjoner følger nød til dyrene.
5. MRSA-infeksjon
- Infeksjon kan utføres mellom 1 og 7 dager etter operasjonen, men holder konsekvent innenfor eksperimenter.
- Clean rotte hale med 70% etanol, og injisere 0,5 ml MRSA på et ønsket celletall (10 april til 10 juni cfu / dyr for de fleste S. aureus stammer). Med 27 G 1/2 cm nål intravenøst fra halen venen Forsiktig : MRSA kultur tilhører biosikkerhetsnivå 2 (BSL2) og har moderat potensiell risiko for personell og miljø.
- Hold trykket på stedet inntil hemostase skjer før retur rotte til buret.
6. Offer Rotter og kultur målvevet
- Ofre rotter ved ip injeksjon av natrium pentobarbital (200 mg/ Kg) etter 1 til 6 dager etter smitte.
- Plasser rotte på ryggen og tørk av brystet med 70% etanol.
- Lag en V-formet snitt i brystet under brystbenet, og kutte brusk av ribbeina på hver side av sternum å avsløre hjertet.
- Trekk hjertet opp forsiktig, og klipp gjennom hjertet vev nær hovedpulsåren og dissekere opp å frigjøre hjertet.
- Plasser hjertet på en steril petriskål med 4x4 tommers gasbind inne, et snitt gjennom venstre ventrikkel indre vegg og åpne venstre-sidig kammer.
- Sjekk visuelt for kateteriseringen. Undersøke og fjerne vegetasjon fra ventilen med saks og pinsetter.
- Vei og homogenisere vegetasjoner, og gjøre seriefortynning med PBS for kvantitativ kultur.
7. Representative Resultater
Umiddelbart etter innsetting av kateter i arterie og presser ned kateteret om 4-5 cm mot hjerte, vil en motstand være experienced. Hvis ingen motstand er detektert, kan kateteret ikke har klart å blitt satt inn i venstre side av hjertet kammer, som kan påvirke plasseringen av kateteret. En riktig kateteriseringen publisert tidligere 9 er vist i Figur 1.
En del av MRSA-infeksjon prøvene må være kvantitative kultivert den sikre nøyaktig levedyktig bakterietallet for infeksjon og renhet infeksjon prøven. I tillegg bør de organismene utvinnes fra vegetasjoner være den samme som brukes i podestoff.
Tabell 1 presenterer et eksempel på virulens en S. aureus stamme i rotte endokarditt modellen som ble publisert tidligere ni. Alle dyr utfordret med inocula av 10 5 og 10 6 CFU og ofret mellom 3-6 dager etter smitte utviklet endocardits med høy S. aureus tettheter i hjerte vegetasjoner, samt nyrer og milt ( en SD, standardavvik. P <0.001 i forhold til 10 5 eller 10 6 CFU-utfordret dyr. Tabell 1. S. aureus tetthet i hjerte vegetasjoner med forskjellig inocula i rotte endokarditt modellen 9. 
Figur 1. Kateteret er på en riktig sted (venstre side av hjertet kammer), og mange vegetasjoner er synlige rundt aorta ventiler 9. Podestoff (Antall Animas) Mean logger 10 CFU / g vev ± SD en i: Vegetasjon Nyre Spleen 10 6 CFU / dyr (9) 10.36 ± 0.85 7.30 ± 0.64 6.70 ± 0.57 10 5 CFU / dyr (8) 9.93 ± 0.53 7.14 ± 0.53 6.44 ± 0.63 10 4 CFU / dyr (7) 3.46 ± 0.50 * 1.81 ± 0.74 * 1.58 ± 0.59 *
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rotta endokarditt er en viktig og godt karakterisert dyremodell for in vivo studier i patogenese og antimikrobielle midler i behandlingen av bakterielle infeksjoner 9-11. I tillegg representerer rotte endokarditt modell sammensatt av akutte og sub-akutte infeksjoner, og etterligner menneskelige motstykke og menneskelige innfødte ventil endokarditt. Dessuten ledsaget av en i boligen kateter, representerer det en klassisk biofilm-assosierte infeksjon, en vanlig og vanskelig sak i kliniske settinger 12. Viktigst resultatene som genereres med rotta endokarditt modellen er svært reproduserbare.
Den sykdomsfremkallende evne av S. aureus i rotte endokarditt modellen, som andre dyremodeller, kan variere avhengig av en rekke parametere, inkludert podestoff dose, bakterievekst fase (log vs stasjonær), alder på dyr, og dyr genetisk bakgrunn 9, 13. Kirurgiske suksess er highly avhengig av teknisk ekspertise og kirurgiske ferdigheter av forskeren. Suksess i kirurgi kan måles ved: 1) antall dyr som gjenvinner fra operasjonen, 2) kateter i en riktig sted på tidspunktet for offer, og 3) vegetasjoner stede på hjerteklaffene.
I sammendraget er rotte endokarditt en praktisk, reproduserbar og viktig modell som etterligner den kliniske situasjonen nøye. Derfor er det hensiktsmessig for alle felt av sepsis forskning, herunder mikrobiell patogenese og effekt av antibiotika i behandling av eksperimentelle endokarditt syndromer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av det amerikanske National Institutes of Health [bevilgning R01AI-39108 til ASB] og American Heart Association [tilskudd SDG 0630219N og AID 09GRNT2180065 til YQX].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plate, 5% sheep blood in Trypticase Soy agar(TSA) | Hardy Diagnostics | A10BX | |
| Trypticase Soy broth (TSB) | BD Biosciences | 211825 | |
| Shaking incubator | Labnet International | I5311-DS | |
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | |
| Catheter introducer | BD Biosciences | 6999 | |
| Isofluorance | Western Medical Suppy, Inc | 2147 | Follow safety and handling information |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc. | Find the instruments from the two companies for your needs |
References
- Petti, C. A., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis. Cardiol. Clin. 21, 219-233 (2003).
- Bashore, T. M., Cabell, C., Fowler, V. Update on infective endocarditis. Curr. Probl. Cardiol. 31, 274-352 (2006).
- Fowler, V. G. Jr, Justice, A., Moore, C. Risk factors for hematogenous complications of intravascular catheter-associated Staphylococcus aureus bacteremia. Clin. Infect. Dis. 17, 313-320 (1993).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin. Infect. Dis. 39, 309-317 (2004).
- Hoen, B. Special issues in the management of infective endocarditis caused by gram-positive cocci. Infect Dis. Clin. North Am. 16, 437-452 (2002).
- Moise, P. A., Hershberger, E., Amodio-Groton, M. I., Lamp, K. C. Safety and clinical outcomes when utilizing high-dose (> or =8 mg/kg) daptomycin therapy. Ann. Pharmacother. 43, 1211-1219 (2009).
- Sakoulas, G., Brown, J., Lamp, K. C., Friedrich, L. V., Lindfield, K. C. Clinical outcomes of patients receiving daptomycin for the treatment of Staphylococcus aureus infections and assessment of clinical factors for daptomycin failure: a retrospective cohort study utilizing the Cubicin Outcomes Registry and Experience. Clin. Ther. 31, 1936-1945 (2009).
- Xiong, Y. Q., Willard, J., Kadurugamuwa, J. L., Yu, J., Francis, K. P., Bayer, A. S. Real-time in vivo bioluminescent imaging for evaluating the efficacy of antibiotics in a rat Staphylococcus aureus endocarditis model. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 380-387 (2005).
- Peerschke, E. I., Bayer, A. S., Ghebrehiwet, B., Xiong, Y. Q. gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an animal model of infective endocarditis. Infect. Immun. 74, 4418-4423 (2006).
- Ganesh, V. K., Rivera, J. J., Smeds, E. A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics. PLoS Pathog. 4, e1000226 (2008).
- Boles, B. R., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm disassembly. Trends Microbiol. , (2011).
- Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). J. Vis. Exp. (48), e2528 (2011).
