Summary
इस कागज Zebrafish की पृष्ठीय महाधमनी से रक्त का संग्रह के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है. यह भी जैव रासायनिक विश्लेषण में कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड का स्तर निर्धारित करने के लिए परीक्षण के रूप में उपयोग के लिए सीरम प्राप्त करने के लिए निर्देश प्रदान करता है.
Protocol
1. प्रोटोकॉल पाठ
- Zebrafish रक्त इकट्ठा करने से पहले, यह आवश्यक है के anesthetizing पानी तैयार है. ~ मछलीघर पानी की 200 मिलीलीटर 500 मिलीलीटर क्षमता के साथ एक कंटेनर में डालो. ~ बर्फ चिप्स के 200 ग्राम जोड़ें. तापमान 4 डिग्री सेल्सियस के बारे में होना चाहिए चिप्स के रूप में बर्फ पिघल, यह अधिक बर्फ चिप्स जोड़ने के लिए एक निरंतर तापमान 4 डिग्री सेल्सियस के पास बनाए रखने के लिए आवश्यक हो जाएगा
- जब anesthetizing पानी तैयार है, रक्त संग्रह के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करते हैं. एक टिप कम प्रतिधारण एक P20 pipettor पर रखो और छुट्टी pipettor जहां यह आसानी से पहुँचा जा सकता है. विंदुक टिप संदूषण के किसी भी स्रोत से संपर्क करने की अनुमति न दें.
- शुष्क धुंध का एक टुकड़ा के साथ एक पेट्री डिश को कवर किया. एक स्टील ब्लेड और धुंध का एक और टुकड़ा एक आसानी से सुलभ जगह में रखा जाना चाहिए.
- एक प्लास्टिक की नलियों के लिए अनुकूलित अपकेंद्रित्र की जरूरत होगी.
- जब इस aforementioned सामग्री तैयार कर रहे हैं, पहली zebrafish पर कब्जा करने के लिए anesthetized बुद्धिहा मछली पकड़ने के जाल और यह है कि संज्ञाहरण के लिए तैयार किया गया है पानी में जारी है. Zebrafish ठंडा पानी में 3-6 एस संवेदनाहृत हो, मछली पर निर्भर करता है की आवश्यकता होती है. ठंडे पानी में मछली रखें जब तक यह नहीं रह बाह्य stimuli का जवाब है.
- मछली पकड़ने के जाल का प्रयोग, धुंध का एक तैयार टुकड़ा पर संवेदनाहृत मछली जगह है, पूंछ धुंध के बंद छोड़ने. मछली के सिर और शरीर के बाहर केवल अपनी पूंछ को छोड़ पर धुंध मोड़ो. पेट्री डिश पर धुंध के साथ कवर मछली रखो.
- स्टील ब्लेड का उपयोग करने के लिए बस गुदा फिन और लांगुलिय पंख के बीच में एक विकर्ण चीरा बनाने के लिए. रक्त के लिए बाहर आना शुरू कर देंगे. इस बिंदु पर, यह करने के लिए जल्दी से काम करने के लिए आवश्यक है.
- धीरे रक्त की ख्वाहिश कि P20 pipettor (पूर्व एक कम प्रतिधारण टिप के साथ भरा हुआ है) के साथ बाहर आता है. रक्त की राशि है कि एकत्र किया जा सकता है मछली के आकार पर निर्भर करता है और क्या हद तक है कि यह सही ढंग से संवेदनाहृत था. यह आमतौर पर 5 से 20 μl के लिए बदलता है. जब रक्त ग बंद हो जाता हैबाहर oming, धीरे से एक ट्यूब में आकांक्षी रक्त हस्तांतरण.
- Hemolysis से बचने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि ट्यूब में रक्त के साथ बहुत ध्यान से संभाला जा, जब तक यह किसी भी कठोर आंदोलनों के बिना अपकेंद्रित्र में रखा गया है.
- Hemolysis से बचने के लिए, यह भी महत्वपूर्ण है कि रक्त के नमूने अपकेंद्रित्र में रक्त संग्रह के 10 मिनट के भीतर सुरक्षित हो.
- यदि आवश्यक हो, यह संभव है एक से अधिक जानवर से रक्त गठबंधन, एक पूल बनाने के. जमा नमूने के रूप में पहली मछली और centrifugation से रक्त संग्रह के बीच में देरी 10 मिनट से अधिक नहीं है लंबे समय के रूप में ठीक काम करेगा.
- जब रक्त का संग्रह किया जाता है, 10 मिनट के लिए 0.5 ग्राम (Eppendorf 5415D अपकेंद्रित्र) में रक्त अपकेंद्रित्र.
- Centrifugation के बाद, सीरम ट्यूब के ऊपर परत में है. एक विंदुक के साथ, सीरम महाप्राण (व्यंजन), जबकि दोनों परतों को अच्छी तरह से विभाजित है और स्थिर रखने के लिए सिर्फ सीरम सुनिश्चित करने.
- एक नया microtube में सीरम स्थानांतरण औरजैव रासायनिक विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है. सीरम बर्फ में संग्रहीत किया जा सकता है, जबकि यह जैव रासायनिक विश्लेषण शुरू करने की प्रतीक्षा है.
- यदि सीरम तत्काल नहीं किया जाएगा, यह -18 में सी ° के लिए जमे हुए किया जा सकता है लगभग 3 महीने के लिए.
2. प्रतिनिधि परिणाम
यह संभव था प्रत्येक मछली क्या पहले से वर्णित तकनीकों (तालिका 2) से भी चार गुना अधिक रक्त का प्रतिनिधित्व करता है से पूरे रक्त का 5 से 20 μl इकट्ठा. कुल कोलेस्ट्रॉल, एचडीएल कोलेस्ट्रॉल, एलडीएल कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड्स की बायोकेमिकल विश्लेषण रक्त संग्रह के बाद इस तकनीक का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. पहले रक्त संग्रह के लिए भोजन का सेवन के हस्तक्षेप से बचने के लिए दोनों लिंगों मछली के दो समूहों के 24 घंटे के लिए उपवास किया गया. छोटे आकार वर्णमिति परीक्षण (कुल कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड के विश्लेषण के लिए Labtest Diagnóstica एसए, ब्राज़ील) के साथ विश्लेषण किया गया, सीरम की 3 μl इस्तेमाल किया गया. एलडीएल कोलेस्ट्रॉल और एचडीएल कोलेस्ट्रॉल के लिएविश्लेषण, 4 μl और सीरम के 10 μl का इस्तेमाल किया गया, क्रमशः. इन विश्लेषण नमूना प्रति 10 zebrafish की जमा नमूने पर प्रदर्शन किया गया.
सीरम lipídic स्तर मछली है कि अपने स्वयं के अंडे और उन है कि, एक नीचे कवर मछलीघर में, 2 सप्ताह के एक प्रयोगात्मक अवधि के लिए अपने स्वयं के अंडे के लिए पहुँच नहीं था पहुँचा के बीच तुलना की गई. सीरम विश्लेषण से पता चला कि सीरम कुल कोलेस्ट्रॉल के स्तर (362 अंडे ± 42 मिग्रा / डेली के साथ और 357 अंडे के बिना ± 13 मिग्रा / डीएल), एचडीएल कोलेस्ट्रॉल (अंडे 91.22 ± 1.79 मिग्रा / डेली के साथ और अंडे के बिना 72.14 ± 2.89 मिलीग्राम / डेली), और एलडीएल कोलेस्ट्रॉल (अंडे 55.68 ± 10.88 मिग्रा / डेली के साथ और अंडे 44.18 ± 9.84 मिग्रा / डेली के बिना) काफी समूहों के बीच अलग नहीं किया था. हालांकि, ट्राइग्लिसराइड के स्तर प्रयोगात्मक समूह में काफी कम नियंत्रण समूह की तुलना में (, पी = 0.03 अंडे 457 ± 25 मिग्रा / डेली के साथ) (292 अंडे ± 64 मिग्रा / डीएल) के बिना थे.
| और nbsपी; | अंडे के लिए उपयोग के साथ | अंडे के लिए उपयोग किए बिना |
| कुल कोलेस्ट्रॉल (मिग्रा / डेली) | 362.82 ± 73.11 | 357.69 ± 23.08 |
| एलडीएल कोलेस्ट्रॉल (मिग्रा / डेली) | 55.69 ± 18.84 | 44.19 ± 17.05 |
| एचडीएल कोलेस्ट्रॉल (मिग्रा / डेली) | 91.23 ± 3.11 | 72.14 ± 5.01 |
| ट्राइग्लिसराइड्स (मिग्रा / डेली) | 457.64 ± * 43.78 | 292.36 ± 111.28 |
तालिका 1. दोनों का अध्ययन समूहों के लिए कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड्स चीन का स्तर (अंडे के लिए उपयोग के साथ और अंडे के लिए उपयोग किए बिना) मतलब ± मानक विचलन में व्यक्त की है.
* सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (पी = 0.03). छात्र टी परीक्षण.
| Aut हॉर्स | चीरा के प्लेस | फसल पद्धति | संज्ञाहरण | एकत्र रक्त की राशि |
| Jagadeeswaran एट. अल., 1999 Murtha एट अल, 2003 | सूक्ष्म विच्छेदन पृष्ठीय पंख के पीछे | Micropipette | उल्लेख नहीं किया ठंडे पानी में MS222 3% | एक एक 5 μl 5 10 μl |
| Eames एट अल, 2010 | शिरच्छेद | माइक्रो capillaries के ट्यूब | MS222 0,02% 28 ° सी पानी | 5 10 μl |
| वर्तमान अध्ययन | गुदा फिन और लांगुलिय पंख के बीच में चीरा | Micropipette और कम प्रतिधारण युक्तियाँ | पानी और बर्फ के चिप्स | 5 20 μl |
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Discussion
यह पत्र एक सरल तकनीक है कि आगे और zebrafish प्रयोगों में सीरम विश्लेषण रक्त की अनुमति देता है प्रस्तुत करता है. इस तकनीक को भविष्य zebrafish hematologic रक्त पैरामीटर डेटा की आवश्यकता के अध्ययन के लिए योगदान करने की क्षमता है. यह भी zebrafish की एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में अधिक से अधिक अनुप्रयोगों के लिए अनुमति चाहिए.
यह तकनीक विशेष कौशल या एक सटीक तकनीक के कार्यान्वयन की आवश्यकता नहीं है. इसके अलावा, यह डबल रक्त की राशि एकत्र की जा अन्य तकनीकों की तुलना में सक्षम बनाता है, जिससे कम मछली का उपयोग करने के लिए जैविक सामग्री की जरूरत की राशि प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है. तकनीक एक महत्वपूर्ण कदम है, जो कि रक्त के नमूनों को ध्यान से संभाला जा सकता है के रूप में zebrafish रक्त रक्तापघटन बहुत आसानी से अपने ऊपर लेना कर सकते हैं. रक्त संग्रह और centrifugation के बीच के समय में देरी सख्ती से सीमित किया जाना चाहिए. एक 10 मिनट की सीमा रक्तापघटन रोकने चाहिए. गति और centrifugation की अवधि (10 मिनट के लिए 0,5 छ) should की भी कड़ाई से पालन हो.
अन्य रक्त संग्रह तकनीक से पहले इस तकनीक को विकसित किया गया था करने का प्रयास किया गया. हालांकि, प्रयुक्त जानवर की संख्या रक्त की बड़ी और बहुत छोटी मात्रा में प्रत्येक मछली से एकत्र किए गए. इस नई तकनीक कम पशुओं के उपयोग की अनुमति दी, कम कौशल स्तर के चिकित्सकों के साथ संभव हो प्रदर्शन किया गया, और प्रत्येक मछली से एकत्र रक्त की मात्रा के संदर्भ में अन्य तकनीकों की तुलना में बेहतर परिणाम दे दी है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
/ FIPE HCPA है Fundo डे Incentivo एक Pesquisa ई Eventos
Capes - Coordenação डे Aperfeiçoamento डे Pessoal डे Nível सुपीरियर
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
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