Summary
本文提出了一种从斑马鱼背主动脉采血技术。它还提供了用于生化分析，如确定胆固醇和甘油三酯水平的试验，取得血清的指示。
Abstract
斑马鱼已被用作研究一些人类疾病的动物模型。它可以作为一个强大的临床前平台的分子事件的研究和治疗策略，以及评估某些疾病的生理机制1。
有成年斑马鱼的生理器官和系统，这可能导致研究人员推断，让斑马鱼系统的勘探所需的基本技术缺乏相对较少的出版物。斑马鱼血液生化值均在2003年首次报道，默撒和同事4人聘用了第一由Jagadeeswaran和他的同事在1999年描述的采血技术。简单地说，血液收集通过微吸管尖端通过外侧切口，长度约0.3厘米，背主动脉的地区5。分钟尺寸的参与，这是因为是一种高精度的技术要求非常熟练的医生。在同组的另一发表在同年6使用相同的技术。在2010年，埃姆斯和他的同事评估整个血糖水平，在斑马鱼7。他们获得了血，用剪刀执行斩首和肝素微毛细管收集管插入到胸鳍关节1。他们提到基尔帕特里克工作等为基础的温度适当的存储解决困难与溶血8。当试图在我们的实验室，使用Jagadeeswaran的技术，我们发现这是很难做出正确的地方正是切口，不要让相当数量的血液丢失，才可以开始收集。
近日，Gupta等9描述了如何解剖成年斑马鱼器官中，Kinkle等10描述了如何执行intraperitonEAL注射，Pugach等11描述了如何执行眼窝注射。然而，更多的工作需要更充分地探讨在斑马鱼研究的基本技术。
斑马鱼体积小，使用它作为实验模型的研究人员面临的挑战。此外，由于这种规模狭小，重要的是简单的技术开发，以使研究人员能够探索的斑马鱼模型的优势。
Protocol
1。协议文本
- 之前收集斑马鱼的血液，这是必要的准备麻醉测定的水。水族箱〜200毫升倒入一个500毫升容量的容器。新增〜200克的冰碴儿。温度应约4°C。由于冰块融化，这将是必要的，添加更多的冰块，以保持近4°C的恒温
- 当麻醉测定的水已准备就绪，准备采血所需的材料。提出保留一个低尖上P20的移液器和离开的地方可以很容易地访问的移液器。不要让枪头接触任何污染来源。
- 用一块干纱布覆盖的培养皿。一个不锈钢刀片和另一块纱布，应放置在一个方便的地方。
- 将需要适应塑料管离心机。
- 当上述材料的准备，捕捉第一斑马鱼麻醉机智公顷的渔网，并已准备麻醉的水释放到它。斑马鱼需要在冷水中3-6秒到麻醉，根据鱼。保持鱼在冷水中，直到它不再响应外界刺激。
- 使用渔网，放在麻醉鱼的准备一块纱布，纱布的尾巴。折叠纱布超过鱼的头部和身体离开了只有它的尾巴。把鱼培养皿上的纱布覆盖。
- 使用钢材叶片臀鳍和尾鳍之间公正的对角线切口。血液将开始走出来。在这一点上，有必要迅速开展工作。
- 轻轻地向往与P20的移液器（低保留尖预装）的血液出来。可收集的血液量取决于鱼的大小，到什么程度，这是正确的麻醉。它通常介于5至20μL。当血液停止Çoming出来，轻轻地转移到管渴望血。
- 为了避免溶血，它是非常小心处理，管中的血液将没有任何激烈的运动，直到它被放置到离心机的关键。
- 为了避免溶血，它也是重要的，在离心机内固定10分钟的血液采集的血液样本。
- 如果有必要，它是可以结合来自多个动物的血液，使池。混合样品，做工精细，只要采血之间的第一条鱼，离心延迟不超过10分钟。
- 当血液采集完成后，离心10分钟，在0.5克（Eppendorf公司离心机5415D）的血液。
- 离心后，血清管的顶层。用吸管，吸出血清，确保得到公正的血清，同时保持两个层次的划分和稳定。
- 血清转移到一个新的微管，它是准备用于生化分析。血清可以存储在冰块，而等待它启动的生化分析。
- 如果血清中不会被立即使用，它可以在-18℃，冻结了约3个月。
2。代表结果
这是可能的5至20微升全血收集每个代表先前所描述的技术（ 见表2）血甚至4倍以上的鱼什么。使用这种技术后，血液收集进行生化分析的总胆固醇，高密度脂蛋白胆固醇，低密度脂蛋白胆固醇，甘油三酯。两个男女鱼禁食24小时前采血，以避免食物的摄入干扰。色度测试总胆固醇和甘油三酯分析小规模（Labtest Diagnostica公司SA，巴西）的分析，3μL血清。对于低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇分析，4μL和10μL血清，分别采用。 10％样品斑马鱼的混合样品进行分析。
访问自己的鸡蛋，在底部覆盖水族馆，没有2个星期的实验期间访问自己的蛋，鱼，血清脂质水平进行了比较。血清分析表明，血清总胆固醇（鸡蛋362±42毫克/升，没有鸡蛋357±13毫克/升），高密度脂蛋白胆固醇（鸡蛋91.22±1.79毫克/升，没有鸡蛋72.14±2.89毫克/升），低密度脂蛋白胆固醇（鸡蛋55.68±10.88毫克/升，没有鸡蛋44.18±9.84毫克/升）没有显着差异之间的群体。然而，甘油三酯水平显着降低，实验组比对照组（鸡蛋457±25毫克/升，P = 0.03）（无蛋292±64毫克/升）。
| - 国家统计局P; | 访问鸡蛋 | 没有鸡蛋 |
| 总胆固醇（毫克/升） | 362.82±73.11 | 357.69±23.08 |
| 低密度脂蛋白 - 胆固醇（毫克/升） | 55.69±18.84 | 44.19±17.05 |
| 高密度脂蛋白 - 胆固醇（毫克/升） | 91.23±3.11 | 72.14±5.01 |
| 甘油三酯（毫克/升） | 457.64±43.78 * | 292.36±111.28 |
表1。两个研究小组赛瑞胆固醇和甘油三脂水平（访问鸡蛋没有鸡蛋）平均值±标准差表示。
*统计显着性（p = 0.03）。 Student t检验。
| AUT开胃 | 切口地点 | 收获方法 | 麻醉 | 收集血液量 |
| jagadeeswaran等。人，1999年默撒等人，2003年 | 微解剖后背鳍 | 微量 | 未提及 在冷水中MS222 3％ | 1 5μL 5 10μL |
| 埃姆斯等人，2010 | 斩首 | 微毛细血管管 | MS222 0.02％ 28°C水 | 5 10μL |
| 研究现状 | 切口之间的臀鳍和尾鳍 | 微管和低保留秘诀 | 水和冰芯片 | 5 20μL |
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Discussion
本文提出了一种简单的技术，允许进一步的血液和血清分析斑马鱼实验。这种技术具有潜力，有助于未来的斑马鱼血液学研究血液中的参数数据。它也应该让更多的斑马鱼作为实验模型的应用。
这种技术不需要特殊技能或实施精确技术。此外，它可实现高达两倍的血液量相对其他技术收集，从而允许使用较少的鱼，以获得所需的生物材料。该技术有一个关键的一步，这是血液样本必须小心处理斑马鱼血液可以很容易产生溶血。之间的延迟时间采血，离心，必须严格限制。 10分钟为限，应防止溶血。速度和离心时间为10分钟（0,5 克 ）寿劳工处亦必须严格遵守。
其他采血技术，试图在此之前技术的开发。然而，使用动物的数量是大和极少量的血液收集每条鱼。这项新技术允许使用较少的动物，被证明是可行的，低技能水平的从业人员，并提供了比其他技术在每条鱼的血液收集量方面更好的结果。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
FIPE / HCPA - 丰杜Incentivo 1 PesquisaéEventos
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
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