Summary
Dit artikel presenteert een techniek voor de inzameling van bloed uit de dorsale aorta van de zebravis. Het geeft ook instructies voor het verkrijgen van serum voor gebruik in biochemische analyses, zoals tests voor het bepalen van cholesterol en triglyceriden.
Abstract
De zebravis is gebruikt als diermodel voor onderzoek naar verschillende ziekten bij de mens. Het kan dienen als een krachtig preklinische platform voor onderzoek van moleculaire gebeurtenissen en therapeutische strategieën alsook de evaluatie van de fysiologische mechanismen van bepaalde pathologieën 1.
Er zijn relatief weinig publicaties die bij volwassen zebravis fysiologie van organen en systemen 2, wat kan leiden onderzoekers af te leiden dat de basistechnieken die nodig zijn om de exploratie van de zebravis systemen mogelijk te maken zijn 3 ontbreken. Hematologische biochemische waarden van de zebravis werden voor het eerst gerapporteerd in 2003 door Murtha en collega's 4 die gebruik van een techniek tijdens de bloedafname voor het eerst beschreven door Jagadeeswaran en collega's in 1999. In het kort werd bloed afgenomen via een micropipet uiteinde via een zijdelingse insnijding ongeveer 0,3 cm in lengte in het gebied van de dorsale aorta 5. Omdat er geringe afmetingen, datis een zeer nauwkeurige techniek die een zeer bekwame arts. Dezelfde techniek werd gebruikt door de dezelfde groep in een andere publicatie in datzelfde jaar 6. In 2010, Eames en collega's heel bloedsuikerspiegel bepaald in zebravis 7. Ze kreeg toegang tot het bloed door het uitvoeren van onthoofdingen met een schaar en dan het plaatsen van een gehepariniseerde microcapillaire collectie pijp in de borstspier articulatie. Zij vermelden problemen met hemolyse die werden opgelost met een geschikte bewaartemperatuur gebaseerd op het werk Kilpatrick et al.. 8. Als u probeert de Jagadeeswaran de techniek in ons laboratorium te gebruiken, vonden we dat het moeilijk was om de incisie te maken in precies de juiste plaats als niet tot een significante hoeveelheid bloed verloren te gaan voordat collectie kon worden gestart mogelijk te maken.
Onlangs Gupta et al.. 9 beschreven hoe tot volwassen zebravis organen, Kinkle et al. ontleden. 10 beschreven hoe intraperiton uit te voerenpaling injecties en Pugach et al.. 11 beschreven hoe retro-orbitale injecties uit te voeren. Er is echter meer werk nodig om meer volledig te verkennen basistechnieken voor onderzoek in de zebravis.
De geringe omvang van de zebravis biedt uitdagingen voor onderzoekers met behulp van het als een experimenteel model. Bovendien gaven deze kleinschaligheid, is het belangrijk dat simpele technieken worden ontwikkeld om onderzoekers in staat om de voordelen van de zebravis model te verkennen.
Protocol
1. Protocol tekst
- Voor het verzamelen van zebravis bloed, is het noodzakelijk om voor te bereiden verlamming water. Giet ~ 200 ml aquariumwater in een container met een 500-ml. Voeg ~ 200 g ijs chips. De temperatuur moet ongeveer 4 ° C. Aangezien de ijsblokjes smelten, is het noodzakelijk om meer ijsblokjes aan een constante temperatuur bij 4 ° C. handhaven
- Wanneer de verlamming water klaar is, de voorbereiding van de materialen die nodig zijn voor de bloedafname. Leg een laag-retentie tip op een P20 pipet en laat de pipet waar het gemakkelijk kan worden geopend. Zorg ervoor dat het pipet tip om alle bronnen van verontreiniging contact op te nemen.
- Bekleed een petrischaal met een stuk droog gaas. Een stalen blad en een stukje gaas moeten worden geplaatst in een gemakkelijk toegankelijke plaats.
- Een centrifuge aangepast voor plastic buizen nodig zijn.
- Wanneer de hiervoor genoemde materialen worden bereid, vangen de eerste zebravis om onder narcose wit te zijnha visnetten en laat hem los in het water, dat is voorbereid voor anesthesie. Zebravissen nodig 3-6 s in gekoeld water te zijn verdoofd, afhankelijk van de vis. Houd de vis in het koude water tot hij niet meer reageert op prikkels van buitenaf.
- Met behulp van het visnet, plaats de verdoofde vis op een voorbereide stuk gaas, zodat de staart af van het gaas. Vouw het gaas boven het hoofd van de vis en het lichaam weg te laten alleen de staart. Leg de vis bedekt met het gaas op de Petrischaal.
- Gebruik de stalen mes om een diagonale snede precies tussen de anaalvin en de staartvin te maken. Het bloed begint te komen. Op dit punt is het noodzakelijk om snel werken.
- Voorzichtig naar streven het bloed dat naar buiten komt met de P20 pipet (pre-geladen met een lage retentie tip). De hoeveelheid bloed kunnen worden verzameld afhankelijk van de grootte van de vis en in welke mate dat het juiste verdoofd. Het varieert gewoonlijk 5-20 ul. Wanneer het bloed stopt censen uit, voorzichtig over te dragen van de streefde bloed in een buis.
- Om te voorkomen dat hemolyse, is het essentieel dat de buis met bloed in het zeer zorgvuldig worden behandeld, zonder drastische bewegingen totdat het wordt geplaatst in de centrifuge.
- Om te voorkomen hemolyse, is het ook belangrijk dat het bloedmonster worden vastgezet in de centrifuge binnen 10 minuten bloedafname.
- Eventueel is het mogelijk om bloed te combineren van meer dan een dier, waardoor een zwembad. Gepoolde monsters zal prima werken zolang de vertraging tussen de bloedinzameling van de eerste vis en centrifugeren niet meer dan 10 minuten.
- Wanneer de bloedafname wordt gedaan, centrifugeren het bloed gedurende 10 minuten bij 0,5 g (Eppendorf Centrifuge 5415D).
- Na centrifugatie, het serum in de bovenste laag van de buis. Met een pipet, zuig het serum, en zorg ervoor dat alleen het serum te krijgen terwijl beide lagen goed verdeeld en stabiel.
- Breng het serum in een nieuwe microbuisjes enklaar voor gebruik in biochemische analyses. Het serum kan worden opgeslagen in ijs terwijl wachten biochemische analyses starten.
- Als serum niet direct worden gebruikt, kan worden ingevroren bij -18 ° C tot ongeveer 3 maanden.
2. Representatieve resultaten
Het was mogelijk 5 tot 20 ul bloed verzamelen elke vis wat zelfs vier maal bloed dan hiervoor beschreven technieken (Tabel 2) vertegenwoordigt. Biochemische analyse van totaal cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol en triglyceriden werden uitgevoerd na de bloedafname met behulp van deze techniek. Twee groepen van beide geslachten vissen werden gevast voor 24 uur voor de bloedafname de voedselinname interferentie te voorkomen. De analyses zijn gedaan met kleinschalige colorimetrische tests (Labtest Diagnostica SA, Brazilië) Voor het totale cholesterol en triglyceriden analyses werden 3 ul serum gebruikt. Voor de LDL-cholesterol en HDL-cholesterolanalyse 4 pi en 10 pi serum werden respectievelijk. Deze analyses werden uitgevoerd op samengevoegde monsters van 10 zebravissen per monster.
Serum lipide werden vergeleken tussen vis eigen eieren die in een bodem onder aquarium heeft toegang tot hun eigen eieren niet voor een experimentele van 2 weken gebruikt. Serum analyse toonde aan dat het serum concentraties van totaal cholesterol (met eieren 362 ± 42 mg / dL en zonder eieren 357 ± 13 mg / dl), HDL-cholesterol (met eieren 91,22 ± 1,79 mg / dL en zonder eieren 72,14 ± 2,89 mg / dL), en LDL-cholesterol (met eieren 55,68 ± 10,88 mg / dL en zonder eieren 44,18 ± 9,84 mg / dl) verschilde niet significant tussen de groepen. Echter, triglyceride niveaus waren significant lager in de experimentele groep (zonder eieren 292 ± 64 mg / dL) dan in de controlegroep (met eieren 457 ± 25 mg / dL; P = 0,03).
| & Nbsp; | Met toegang tot eieren | Zonder toegang tot eieren |
| Totaal Cholesterol (mg / dl) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23,08 |
| LDL - cholesterol (mg / dl) | 55,69 ± 18,84 | 44,19 ± 17,05 |
| HDL - Cholesterol (mg / dl) | 91,23 ± 3,11 | 72,14 ± 5,01 |
| Triglyceriden (mg / dl) | 457,64 ± 43,78 * | 292,36 ± 111,28 |
Tabel 1. Cholesterol en triglyceriden seric niveaus voor zowel bestudeerde groepen (met toegang tot eieren en zonder toegang tot eieren), uitgedrukt in gemiddelde ± standaarddeviatie.
* Statistisch significant (p = 0,03). Student t test.
| Aut hors | Plaats van incisie | Harvest methode | Anesthesie | Bedrag van de verzamelde bloed |
| Jagadeeswaran et. al.., 1999 Murtha et al.., 2003 | Micro dissectie posterieur aan rugvin | Micropipet | Niet vermeld MS222 3% in koud water | 1 5 pi 5 a 10 pi |
| Eames et al.., 2010 | Onthoofding | Micro haarvaten buis | MS222 0,02% 28 ° C water | 5 a 10 pi |
| Deze studie | Incisie tussen anaalvin en de staartvin | Micropipet en lage retentie tips | Water en ijs chips | 5 20 ul |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel presenteert een eenvoudige techniek die meer bloed en serum analyse in zebravis experimenten mogelijk maakt. Deze techniek heeft de potentie om bij te dragen aan toekomstige zebravis hematologische onderzoeken waarbij bloed parameter gegevens. Het moet ook grotere toepassingen van de zebravis als een experimenteel model.
Deze techniek vereist geen speciale vaardigheden of implementatie van een nauwkeurige techniek. Bovendien maakt van de dubbele hoeveelheid bloed worden verzameld in vergelijking met andere technieken, waardoor het gebruik van minder vis de benodigde hoeveelheid biologisch materiaal te verkrijgen. De techniek heeft een belangrijke stap, namelijk dat de bloedmonsters zorgvuldig worden behandeld als zebravis bloed kan oplopen hemolyse heel gemakkelijk. De tijd tussen de bloedafname en centrifugeren moet strikt worden beperkt. Een 10-minuten grens moet voorkomen hemolyse. De snelheid en de duur van centrifugatie (0,5 g gedurende 10 minuten) should ook strikt worden opgevolgd.
Andere bloedafname technieken werden geprobeerd voordat deze techniek werd ontwikkeld. Het aantal dieren om grote en kleine hoeveelheden bloed verzameld per vis. Deze nieuwe techniek kon het gebruik van minder dieren, is aangetoond dat haalbaar is met een laag opleidingsniveau uit de praktijk, en gaf betere resultaten dan andere technieken in termen van de hoeveelheid bloed verzameld van elke vis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Fipe / HCPA - Fundo de Incentivo een Pesquisa e Eventos
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nivel Superior
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol. Dis. 25, 239-249 (1999).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
