Summary
Dieser Beitrag stellt eine Methode zur Gewinnung von Blut aus der Aorta dorsalis von Zebrafisch. Es bietet auch Anweisungen für das Abrufen Serum zur Verwendung in biochemischen Analysen, wie etwa Tests zur Bestimmung von Cholesterin und Triglyceriden.
Abstract
Der Zebrafisch ist als Tiermodell für die Untersuchung der verschiedenen menschlichen Krankheiten verwendet. Es kann als leistungsfähige Plattform für die präklinische Studien über die molekularen Ereignisse und therapeutische Strategien sowie für die Auswertung der physiologischen Mechanismen von einigen Pathologien 1 dienen.
Es gibt relativ wenige Veröffentlichungen im Zusammenhang mit erwachsenen Zebrafisch Physiologie der Organe und Systeme 2, die führen Forscher zu folgern, dass die grundlegenden Techniken erforderlich, um die Exploration von Zebrafisch-Systeme erlauben es fehlen 3 können. Hämatologische biochemischen Werte des Zebrafisch wurden erstmals im Jahr 2003 von 4 Murtha und Kollegen, die eine Blutentnahme Technik zuerst von Jagadeeswaran und Kollegen im Jahr 1999 beschrieben beschäftigt gemeldet. Kurz gesagt, wurde Blut über eine Mikropipettenspitze durch einen seitlichen Einschnitt gesammelt, etwa 0,3 cm in der Länge, im Bereich der dorsalen Aorta 5. Wegen der winzigen Dimensionen beteiligt sind, diesenist eine hochpräzise Technik, die eine sehr erfahrenen Praktiker. Die gleiche Technik wurde von der gleichen Gruppe in einer anderen Publikation im selben Jahr 6 verwendet. Im Jahr 2010 beurteilt Eames und Kollegen ganze Blutzuckerwerte im Zebrafisch 7. Sie gewannen den Zugriff auf das Blut, indem Enthauptungen mit der Schere und dann Einfügen einer heparinisierten Mikrokapillare Sammlung Schlauch in die Brust Artikulation. Sie erwähnen, die Schwierigkeiten mit Hämolyse mit einem geeigneten Lagertemperatur auf die Arbeit Kilpatrick et al gelöst wurden. 8. Bei dem Versuch, Jagadeeswaran die Technik in unserem Labor verwenden, fanden wir, dass es schwierig war, den Schnitt in genau der richtigen Stelle machen, wie nicht eine erhebliche Menge an Blut verloren, bevor Sammlung begonnen werden konnte werden lassen.
Vor kurzem Gupta et al. 9 beschrieben, wie man erwachsene Zebrafisch Organe, Kinkle et al sezieren. 10 beschrieben, wie man intraperiton durchführenEAL Injektionen und Tritt durch et al. 11 beschrieben, wie man retroorbitalen Injektionen durchführen. Allerdings sind weitere Anstrengungen erforderlich, um mehr vollständig zu erforschen grundlegende Techniken für die Forschung im Zebrafisch.
Die geringe Größe der Zebrafisch birgt Herausforderungen für die Forscher, sie als ein experimentelles Modell. Des Weiteren sind angesichts dieser Kleinteiligkeit, ist es wichtig, dass einfache Techniken entwickelt werden, damit die Forscher die Vorteile des Zebrafisch-Modell zu untersuchen.
Protocol
1. Protokoll Text
- Vor dem Sammeln Zebrafisch Blut, ist es notwendig, betäubende Wasser vorzubereiten. Gießen Sie ~ 200 ml Aquarienwasser in einen Behälter mit einem 500-ml Fassungsvermögen. Fügen Sie ~ 200 g Eis-Chips. Die Temperatur sollte etwa 4 ° C liegen Da die Eis-Chips zu schmelzen, wird es notwendig sein, mehr Eisstückchen in den eine konstante Temperatur der Nähe von 4 ° C zu halten
- Als die betäubende Wasser fertig ist, bereitet die Materialien für die Blutentnahme nötig. Setzen Sie eine Low-Retention-Spitze auf einem P20-Pipette und lassen Sie die Pipette, wo sie leicht zugänglich sind. Nicht in die Pipettenspitze, um alle Quellen der Verschmutzung zu kontaktieren.
- Deckel einer Petrischale mit einem Stück Gaze trocken. Ein Stahl-Klinge und ein weiteres Stück Gaze sollte in einem leicht zugänglichen Ort platziert werden.
- Zentrifuge für Kunststoffrohre ausgebildet benötigt werden.
- Wenn die oben genannten Materialien bereit sind, fangen die ersten an narkotisierten Zebrafisch Witz seinha Fischernetz und lassen Sie ihn in das Wasser, die für die Narkose vorbereitet wurde. Zebrafisch erforderlich 3-6 s in gekühltem Wasser zu betäubende, abhängig von der Fische. Halten Sie den Fisch im kalten Wasser, bis es reagiert nicht mehr auf äußere Reize.
- Mit dem Fischernetz, platzieren Sie den betäubten Fisch auf einem vorbereiteten Stück Gaze, so dass der Schwanz aus der Gaze. Falten Sie die Gaze über die Fische Kopf und Körper zu verlassen nur mit dem Schwanz. Den Fisch mit der Gaze auf der Petrischale abgedeckt.
- Verwenden Sie die Klinge, um eine diagonale Schnitt nur zwischen der Afterflosse und der Schwanzflosse zu machen. Das Blut beginnt zu kommen. An diesem Punkt ist es notwendig, schnell zu arbeiten.
- Sanft streben das Blut, das aus mit dem P20-Pipette (mit einer geringen Retention Spitze vorinstalliert). Die Menge des Blutes, die gesammelt werden können, hängt von der Größe des Fisches und in welchem Umfang, dass es richtig betäubt war. Es variiert in der Regel 5 bis 20 ul. Wenn das Blut nicht mehr coming out, sanft übertragen die angestrebte Blut in ein Röhrchen.
- Um eine Hämolyse zu vermeiden, ist es wichtig, dass das Rohr mit Blut darin sehr vorsichtig gehandhabt werden, ohne drastischen Bewegungen, bis er in die Zentrifuge eingesetzt.
- Um eine Hämolyse zu vermeiden, ist es auch wichtig, dass die Blutprobe in der Zentrifuge innerhalb von 10 Minuten nach der Blutentnahme befestigt werden.
- Falls erforderlich, ist es möglich, Blut von mehr als einem Tier zu kombinieren, wobei ein Pool. Gepoolten Proben wird funktionieren, solange die Verzögerung zwischen der Blutentnahme aus der ersten Zentrifugation Fisch und nicht mehr als 10 Minuten in Ordnung.
- Wenn die Blutentnahme durchgeführt wird, das Blut zentrifugiert für 10 Minuten bei 0,5 g (Eppendorf Zentrifuge 5415D).
- Nach der Zentrifugation wird das Serum bei der oberen Schicht des Rohrs. Mit einer Pipette absaugen Serum, achten Sie darauf, nur das Serum bekommen und dabei beide Lagen gut aufgeteilt und stabil.
- Das Serum in ein neues Mikroröhrchen und esist bereit, in biochemischen Analysen verwendet werden. Das Serum kann in Eis gelagert werden, während sie um die biochemischen Analysen beginnen zu warten.
- Wenn das Serum nicht sofort verwendet werden, kann es bei -18 ° C eingefroren werden für bis zu etwa 3 Monate.
2. Repräsentative Ergebnisse
Es war möglich, 5 bis 20 ul Vollblut aus jedem Fisch, was sogar 4-mal mehr Blut als vorher beschriebenen Techniken (Tabelle 2) stellt zu sammeln. Biochemische Analyse von Gesamt-Cholesterin, HDL-Cholesterin, LDL-Cholesterin und Triglyceride wurden nach der Blutentnahme mit dieser Technik durchgeführt. Zwei Gruppen von beiden Geschlechtern Fische wurden für 24 Stunden gefastet, bevor Blutentnahme Nahrungsaufnahme Störungen zu vermeiden. Die Analysen mit kleinräumigen Farbtest (Labtest Diagnostica SA, Brasilien) für Gesamt-Cholesterin-und Triglycerid-Analysen wurden durchgeführt, wurden 3 ul Serum verwendet. Für LDL-Cholesterin und HDL-CholesterinAnalyse, 4 und 10 ul ul Serum wurden verwendet wurden. Diese Analysen wurden auf gepoolten Proben von 10 Zebrafisch pro Probe durchgeführt.
Serum-Lipid-Spiegel wurden zwischen Fischen, die ihre eigenen Eier und solche, die in einer Unterseite bedeckt Aquarium, keinen Zugang zu ihren eigenen Eizellen für eine experimentelle Dauer von 2 Wochen zugegriffen verglichen. Serum-Analyse zeigte, dass die Serumspiegel von Gesamt-Cholesterin (mit Eiern 362 ± 42 mg / dl und ohne Eier 357 ± 13 mg / dl), HDL-Cholesterin (mit Eiern 91,22 ± 1,79 mg / dl und ohne Eier 72,14 ± 2,89 mg / dl) und LDL-Cholesterin (mit Eiern 55,68 ± 10,88 mg / dl und ohne Eier 44,18 ± 9,84 mg / dL) unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Gruppen. Allerdings waren Triglycerid-Spiegel signifikant niedriger in der experimentellen Gruppe (ohne Eier 292 ± 64 mg / dl) als in der Kontrollgruppe (mit Eier 457 ± 25 mg / dl, p = 0,03).
| & Nbsp; | Mit dem Zugriff auf Eier | Ohne Zugriff auf Eier |
| Gesamt-Cholesterin (mg / dL) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23,08 |
| LDL - Cholesterin (mg / dL) | 55,69 ± 18,84 | 44,19 ± 17,05 |
| HDL - Cholesterin (mg / dL) | 91,23 ± 3,11 | 72,14 ± 5,01 |
| Triglyzeride (mg / dL) | 457,64 ± 43,78 * | 292,36 ± 111,28 |
Tabelle 1. Cholesterin und Triglyceride Seric Ebenen für beide untersuchten Gruppen (mit Zugriff auf Eier und ohne Zugang zu Eiern) in Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.
* Statistisch signifikant (P = 0,03). Student t-Test.
| Aut hors | Ort des Einschnitts | Ernte-Verfahren | Anästhesie | Menge an gesammeltem Blut |
| Jagadeeswaran et. al., 1999 Murtha et al., 2003 | Mikrodissektion hinter Rückenflosse | Mikropipette | Nicht erwähnt MS222 3% in kaltem Wasser | 1 a 5 ul 5 a 10 pl |
| Eames et al., 2010 | Enthauptung | Micro Kapillaren Rohr | MS222 0,02% 28 ° C Wasser | 5 a 10 pl |
| Vorliegenden Studie | Einschnitt zwischen Afterflosse und Schwanzflosse | Mikropipette und mit geringer Retention | Wasser und Eis-Chips | 5 a 20 ul |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dieser Beitrag stellt eine einfache Technik, die weiter Blut und Serum-Analyse im Zebrafisch Experimente erlaubt. Diese Technik hat das Potenzial, zukünftige Zebrafisch hämatologische Untersuchungen, die Blut-Parameter-Daten beitragen. Es sollte auch für größere Anwendungen der Zebrafisch als ein experimentelles Modell zu ermöglichen.
Diese Technik erfordert keine speziellen Fähigkeiten oder Umsetzung einer präzise Technik. Darüber hinaus ermöglicht es die doppelte Menge von Blut gesammelt werden im Vergleich zu anderen Techniken, wodurch die Verwendung von weniger Fische, um die benötigte Menge an biologischem Material zu erhalten. Die Technik hat einen entscheidenden Schritt, was bedeutet, dass die Blutproben sorgfältig behandelt werden, wie Zebrafisch Blut kann Hämolyse sehr leicht fallen wird. Die Zeitverzögerung zwischen Blutentnahme und Zentrifugation muss strikt begrenzt werden. Ein 10-Minuten-Grenze soll verhindern, Hämolyse. Die Geschwindigkeit und Dauer der Zentrifugation (0,5 g für 10 Minuten) should auch strikt zu befolgen.
Andere Techniken der Blutentnahme wurden versucht, bevor diese Technik entwickelt wurde. Jedoch war die Anzahl der verwendeten Tiere großen und sehr kleinen Mengen von Blut von jedem Fische wurden gesammelt. Diese neue Technik erlaubt die Verwendung von weniger Tiere, erwies sich als machbar mit niedrige Qualifikationsniveau Praktiker und gab bessere Ergebnisse als andere Techniken in Bezug auf die Menge an Blut aus jedem Fisch gesammelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Fipe / HcpA - Fundo de Incentivo ein Fortgeschrittenen-e Eventos
Capes - Coordenação Aperfeiçoamento de de de Nivel Superior-Pessoal
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol. Dis. 25, 239-249 (1999).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
