Summary
Este artigo apresenta uma técnica de coleta de sangue da aorta dorsal do peixe zebra. Ele também fornece instruções para a obtenção de soro para uso em análises bioquímicas, tais como testes para determinação dos níveis de colesterol e triglicérides.
Abstract
O peixe-zebra tem sido utilizado como um modelo animal para estudos de várias doenças humanas. Ela pode servir como uma plataforma poderosa pré-clínico para estudos de acontecimentos moleculares e estratégias terapêuticas, bem como para avaliar os mecanismos fisiológicos de cerca de 1 patologias.
Há relativamente poucas publicações relacionadas à fisiologia do peixe-zebra adulto de órgãos e sistemas 2, que podem levar os pesquisadores a concluir que as técnicas básicas necessárias para permitir a exploração de sistemas de zebrafish faltam 3. Hematológicas valores bioquímicos do peixe-zebra foram relatados primeiramente em 2003 por Murtha e 4 colegas que empregou uma técnica de coleta de sangue primeiramente descrita por Jagadeeswaran e colegas em 1999. Resumidamente, o sangue foi recolhido através de uma ponta micropipeta através de uma incisão lateral, a aproximadamente 0,3 cm de comprimento, na região da aorta dorsal 5. Devido às dimensões hora envolvidos, estaé uma técnica de alta precisão requerendo um praticante altamente qualificado. A mesma técnica foi utilizada pelo mesmo grupo em outra publicação no mesmo ano 6. Em 2010, Eames e colegas avaliaram os níveis de glucose no sangue em zebrafish 7. Ganharam acesso ao sangue através da realização de decapitações com a tesoura e depois inserir um tubo de colheita heparinizado microcapilar na articulação peitoral. Eles mencionam dificuldades com hemólise que foram resolvidos com uma temperatura de armazenamento adequado com base no trabalho Kilpatrick et al. 8. Ao tentar usar a técnica Jagadeeswaran no nosso laboratório, verificou-se que era difícil de fazer a incisão no lugar precisamente a direita, como para não permitir que uma quantidade significativa de sangue a ser perdido antes da recolha pode ser iniciado.
Recentemente, Gupta et al. 9 descreveu como dissecar órgãos zebrafish adulto, nozinho et al 10. Descrito como executar intraperitoninjeções EAL e Pugach et al. 11 descrito como realizar retro-orbital injeções. No entanto, mais estudos são necessários para explorar mais técnicas básicas para a investigação em zebrafish.
O pequeno tamanho do zebrafish apresenta desafios para os pesquisadores que o utilizam como modelo experimental. Além disso, dado este pequenez de escala, é importante que as técnicas simples são desenvolvidos para permitir aos investigadores para explorar as vantagens do modelo de peixe-zebra.
Protocol
1. Texto Protocolo
- Antes de recolha de sangue do peixe-zebra, é necessário para preparar a água anestesiar. Verter ~ 200 ml de água de aquário em um recipiente com uma capacidade de 500 ml. Adicionar ~ 200 g de pedaços de gelo. A temperatura deve ser de cerca de 4 ° C. À medida que os pedaços de gelo derreter, será necessário adicionar mais fichas de gelo para manter uma temperatura constante próximo de 4 ° C.
- Quando a água anestesiar está pronto, preparar os materiais necessários para a coleta de sangue. Coloque uma ponta de retenção baixa em uma pipeta P20 e deixar o pipetador onde ele pode ser facilmente acessado. Não permita que a ponta da pipeta entrar em contato com quaisquer fontes de contaminação.
- Cobrir uma placa de Petri com um pedaço de gaze seca. Uma lâmina de aço e outro pedaço de gaze deve ser colocado em um local facilmente acessível.
- Uma centrífuga adaptado para tubos de plástico será necessário.
- Quando os referidos materiais são preparados, capturar o peixe-zebra primeiro a ser sagacidade anestesiadosha rede de pesca e solte-o na água que foi preparado para a anestesia. Zebrafish requerem 3-6 s em água gelada para ser anestesiados, dependendo do peixe. Mantenha o peixe na água fria até que já não responde a estímulos externos.
- Usando a rede de pesca, coloque o peixe anestesiados sobre um pedaço de gaze preparada, deixando a cauda para fora da gaze. Dobre a gaze sobre a cabeça do peixe e do corpo deixando de fora apenas a cauda. Coloque o peixe coberto com a gaze na placa de Petri.
- Use a lâmina de aço para fazer uma incisão diagonal apenas entre a barbatana anal e da barbatana caudal. O sangue vai começar a sair. Neste ponto, é necessário trabalhar rapidamente.
- Gentilmente aspirar o sangue que sai com o pipetador P20 (pré-carregado com uma ponta de retenção baixa). A quantidade de sangue que pode ser recolhida depende do tamanho do peixe e em que medida que era anestesiados correctamente. É geralmente varia de 5 a 20 uL. Quando o sangue deixa de coming para fora, suavemente transferir o sangue para um tubo de aspiração.
- Para evitar hemólise, é crítico que o tubo com sangue em que ser manuseados com muito cuidado, sem quaisquer movimentos drásticas até que seja colocada na centrífuga.
- Para evitar hemólise, é também importante que a amostra de sangue ser fixada na centrífuga no prazo de 10 minutos de recolha de sangue.
- Se necessário, é possível combinar o sangue a partir de mais de um animal, tornando uma piscina. Amostras combinadas irá funcionar bem, desde que o atraso entre a colheita de sangue a partir do primeiro peixe e centrifugação não exceda 10 minutos.
- Quando a recolha de sangue é feito, centrifugar o sangue durante 10 minutos a 0,5 g (Eppendorf Centrífuga 5415D).
- Após centrifugação, o soro é na camada de topo do tubo. Com uma pipeta, aspirar o soro, certificando-se para obter apenas o soro, mantendo ambas as camadas bem dividido e estável.
- Transferir o soro para um microtubo novo e seestá pronto para ser utilizado em análises bioquímicas. O soro pode ser armazenado em gelo enquanto se esperar para iniciar as análises bioquímicas.
- Se o soro não irá ser imediatamente utilizado, ele pode ser congelada a -18 ° C até cerca de 3 meses.
2. Os resultados representativos
Foi possível recolher 5-20 ul de sangue total a partir de cada peixe que representa o sangue até 4 vezes mais do que as técnicas anteriormente descrito (Tabela 2). A análise bioquímica do colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol e triglicérides foram realizadas após a coleta de sangue, utilizando esta técnica. Dois grupos de ambos os sexos peixes foram mantidos em jejum durante 24 horas antes da recolha de sangue para evitar a interferência ingestão de alimentos. As análises foram feitas com pequena escala testes colorimétricos (Labtest Diagnóstica SA, Brasil) para análises de colesterol total e triglicérides, 3 uL de soro foram utilizados. Para o LDL-colesterol e HDL-colesterolanálise, 4 uL e 10 uL de soro foram utilizados, respectivamente. Estas análises foram realizadas em amostras combinadas de 10 peixes-zebra por amostra.
Os níveis séricos lipídicos foram comparados entre os peixes que acessou seus próprios ovos e aquelas que, em um aquário de fundo coberto, não têm acesso a seus próprios ovos por um período experimental de 2 semanas. Análise de soro mostraram que os níveis séricos de colesterol total (com ovos de 362 ± 42 mg / dL e sem ovos de 357 ± 13 mg / dL), HDL-colesterol (com ovos de 91,22 ± 1,79 mg / dL e sem ovos de 72,14 ± 2,89 mg / dL) e LDL-colesterol (com ovos de 55,68 ± 10,88 mg / dL e sem ovos de 44,18 ± 9,84 mg / dL) não diferiram significativamente entre os grupos. No entanto, os níveis de triglicéridos foram significativamente menores no grupo experimental (sem ovos 292 ± 64 mg / dL) do que no grupo de controlo (com ovos 457 ± 25 mg / dL, P = 0,03).
| & Nbsp; | Com acesso aos ovos | Sem acesso aos ovos |
| Colesterol total (mg / dL) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23,08 |
| LDL - colesterol (mg / dL) | 55,69 ± 18,84 | 44,19 ± 17,05 |
| HDL - colesterol (mg / dL) | 91,23 ± 3,11 | 72,14 ± 5,01 |
| Triglicérides (mg / dL) | 457,64 ± 43,78 * | 292,36 ± 111,28 |
Tabela 1. Colesterol e triglicérides níveis séricos para ambos os grupos estudados (com acesso aos ovos e sem acesso aos ovos), expresso em média ± desvio padrão.
* Estatisticamente significativo (P = 0,03). Teste t de Student.
| Aut. hors | Local de incisão | Método de colheita | Anestesia | Quantidade de sangue coletado |
| Jagadeeswaran et. ai., 1999 Murtha et al., 2003 | Posterior dissecção Micro para nadadeira dorsal | Micropipeta | Não é mencionado MS222 3% em água fria | 1 uL um 5 5 um uL 10 |
| Eames et al., 2010 | Decapitação | Micro capilares tubo | MS222 0,02% 28 ° C de água | 5 um uL 10 |
| Presente Estudo | Incisão entre barbatana anal e nadadeira caudal | Micropipeta e dicas de retenção baixa | Fichas de água e gelo | 5 um uL 20 |
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Discussion
Este artigo apresenta uma técnica simples que permite que mais sangue e análise de soro em experimentos de zebrafish. Esta técnica tem o potencial de contribuir para estudos futuros zebrafish hematológicas que exigem dados de parâmetros sanguíneos. Deve também permitir para aplicações maiores do peixe-zebra como um modelo experimental.
Esta técnica não exige habilidades especiais ou de aplicação de uma técnica precisa. Além disso, permite-se o dobro da quantidade de sangue a ser recolhida em relação a outras técnicas, permitindo assim a utilização de menos peixes para se obter a quantidade necessária de material biológico. A técnica tem um passo crítico, o que é que as amostras de sangue ser manuseados com cuidado como o sangue do peixe-zebra pode incorrer hemólise muito facilmente. O intervalo de tempo entre a coleta de sangue e centrifugação deve ser estritamente limitado. Um limite de 10 minutos deve evitar a hemólise. A velocidade e duração da centrifugação (0,5 g durante 10 minutos) should também ser rigorosamente seguidas.
Outras técnicas de coleta de sangue foram tentadas antes que essa técnica foi desenvolvida. No entanto, o número de animais utilizados era de grandes quantidades e muito pequenas de sangue foram colhidas de cada peixe. Esta nova técnica permitiu a utilização de menos animais, foi demonstrado ser viável com baixo nível de habilidade praticantes, e deu os melhores resultados do que outras técnicas em termos da quantidade de sangue recolhido a partir de cada peixe.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - Fundo de Incentivo à Pesquisa e Eventos
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
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