Summary
实时定量聚合酶链反应（QPCR）是一种快速，灵敏的方法来探讨不同的microRNA（miRNA）的分子的表达水平在肿瘤样本。使用此方法数百种不同的miRNA分子表达可以被放大，量化，并从相同的cDNA模板分析。
Abstract
小分子RNA（miRNAs）是单链，18-24核苷酸长，非编码RNA分子。他们参与几乎每一个细胞的过程，包括发展1 2，细胞凋亡，细胞周期调控3。估计miRNA的调节表达的30％到90％的人类基因4，结合他们的目标信使RNA（mRNA）5。据报道，在各种疾病和癌症亚型6 miRNA的普遍失调。由于他们的患病率和独特的结构，这些小分子有可能成为下一代的生物标志物，治疗药物和/或目标。
调查miRNA表达的方法，包括SYBR Green I染料为基础，以及基础的TaqMan探针定量PCR。如果miRNA是在临床上得到有效使用，这是当务之急，他们在新鲜和/或存档的临床标本的检测准确，重现性好，和SPecific。定量PCR已被广泛用于验证在整个基因组的分析，如基因芯片研究7 miRNA的表达。在本协议所使用的样本例临床局限性前列腺癌根治性前列腺切除术的患者;然而，其他组织和细胞株可以取代英寸前列腺标本在液氮单元冷冻切除后。为每一个病人的临床变量和后续信息收集为后续的分析8。
量化前列腺肿瘤样本中miRNA的水平 。在肿瘤的qPCR分析的主要步骤是：总RNA提取，cDNA合成，定量PCR产品检测miRNA的特异性引物。使用TRIzol试剂标本中提取总RNA，其中包括表达的miRNA，和其他小分子RNA。 QIAGEN的miScript系统被用来合成cDNA，并进行定量PCR（ 图1）。内源性miRNA是不是宝在逆转录过程中lyadenylated，因此，聚（A）聚合酶polyadenylates的miRNA。 miRNA的作为模板，使用Oligo-dT和逆转录合成cDNA。对通用标签序列的寡-dT引物5月底，有利于扩增的cDNA PCR步骤。用SYBR Green intercalates双链DNA，染料发出的荧光水平检测PCR产物的扩增。特定miRNA的引物，随着通用标签序列的通用引物结合，将扩增特定的miRNA序列。
有超过一千人特定的miRNA，和数以百计的小鼠特定miRNA的miScript底漆检测。相对定量方法是使用量化miRNAs的表达。要纠正不同样品之间的变异性，目标的miRNA的表达水平正常化的参照基因的表达水平。选择一个GENE正常化的目标表达相对定量分析方法是至关重要的。在这方面的能力通常使用的参照基因的例子是小分子RNA RNU6B，RNU44，并RNU48，他们表示在大部分样本都被认为是稳定。在这个协议中，被用来作为参照基因RNU6B。
Protocol
1。前列腺样品采集
- 在前列腺癌的时间收集前列腺样本。标本是面向使用解剖标志。前列腺和精囊都涂上如下：绿色右侧，左侧蓝色。
- 采取随机横向腹部前列腺直肠表面垂直，在液氮冷冻，储存在-80℃9。
- 影印，面向（前，后，左，右），quadrisected的库存标本切片。部分被削减使用恒温器。
- 部分与H＆E染色和由病理学家彩色幻灯片和相应的图像，以确定并划定肿瘤与正常区域的审查。显着的地区为指导，以表明从中提取肿瘤组织从RNA将在后续步骤中提取的地区使用。
2。从样品中分离总RNA，包括miRNA，
- 地方干冰和划定复印件冷冻前列腺样品，切出的前列腺肿瘤的一小部分（50至100毫克之间）。
- 1毫升Trizol试剂匀浆前列腺肿瘤组织。在下面的步骤的数量是根据使用1毫升Trizol试剂。
注：在这里，我们用Trizol试剂提取的RNA，但其他包隔离的小分子RNA，总RNA也可以使用。
- 孵育5分钟，在室温下的均质样品。
- 加入0.2毫升氯仿的样品，并大力摇晃15秒。孵育3分钟，在室温下的样品，然后离心15分钟12,000 XG 4°C。
- 无色的上层水相转移到新鲜管，并加入0.5毫升异丙醇。样品孵育室温为10分钟，然后离心10分钟，在12000 XG在4°C。
- 小心吸上清，不扰乱含有RNA的颗粒。 1毫升75％乙醇洗涤RNA的颗粒。涡的样品和再离心5分钟7,500 XG泥沙在4°C。
- 小心吸上清，干燥的RNA颗粒5-10分钟，确保RNA的颗粒是不完全干燥。重新溶解在无核酸酶水颗粒大小适当。测量RNA的浓度，使用的NanoDrop 1000分光光度计在260 nm和280 nm（测量吸光度）。
- 检查使用安捷伦生物分析仪的RNA样品的质量和完整性。
3。 RNA的反转录
- 使用miScript反转录试剂盒，根据制造商的说明（QIAGEN）进行反转录的RNA。这个套件包括一个逆转录聚（A）聚合酶。 miScript逆转录缓冲区包括镁离子，dNTPs浓度，寡-dT引物和随机引物。
- 使用10 pg和1微克的RNA合成cDNA。如果使用超过1微克的RNA，缩放到合适的音量线性反应。
- 准备主结构包含5X miScript RT缓冲（4μL），miScript逆转录混合（1μL），无RNase的水，使终体积20μL的反应。还包括在主结构模板RNA（1微克）。
- 孵育60分钟的样品在37°C间其次潜伏期为5分钟，立即在95°C这一步可以在PCR机，加热块或水浴。热循环是最合适和准确的方法。储存在冰短期的cDNA，-20℃长期贮存。
4。生成标准曲线
- 此前，以experiment目标的miRNA，生成标准曲线，通过对他们的交叉点（CP）（ 图2）已知浓度的cDNA。
- 准备一系列稀释2倍，10倍，50倍，250倍，1250倍，一个被称为有你感兴趣的基因大量表达的样品的原始基因。
- 在第5节“实时聚合酶链反应检测miRNA的”指定执行的PCR，基因是不是一个静态40倍稀释系列稀释的修改。
- 使用RelQuant软件（罗氏）产生的标准曲线进行分析。
注：必须为每一个感兴趣的基因产生一个新的标准曲线。
5。实时PCR miRNA的检测
- 为miRNA的实时定量PCR进行使用miScript的SYBR Green PCR试剂盒和miScript底漆含量根据制造商的说明（QIAGEN）。准备主结构包含2X QuantiTect的SYBR Green PCR扩增预混，10X miScript通用引物，10 miScript底漆含量，无RNase的水。准备为20μL体积反应的主结构。
- 引物检测特定miRNA的利益。重组10X miScript底漆含量，小瓶离心简单地说，并添加550μLTE缓冲液，pH 8.0。涡简要的小瓶混合，分装到小卷的引物，并储存于-20°C需要两个引物：目标基因和参照基因的引物RNU6B usedas参照基因。
- 稀释的cDNA于-20°C的40倍和商店额外等分
- 作为PCR模板的cDNA的服务。使用2μL40倍稀释的cDNA，并免除20μL轻毛细血管循环仪（罗氏）。
- 加入18μl的主结构的每一个毛细血管，离心机采用毛细管适配器。
- 放置在毛细管基于实时PCR仪的LightCycler 3，如毛细血管。5实时PCR 32毛细管传送带格式的系统。
- 运行PCR循环程序如下：
要激活HotStarTaq聚合酶在的2X QuantiTect的SYBR Green PCR扩增预混，孵化前95°C 15分钟。
其次是50个周期：
变性，15秒，94℃;
退火，30秒，55℃;
支线，30秒，70°C。 - 选择一个样本校准，并设置其规范化的目标金额为1。在所有其他校准样品的miRNA相对表达进行比较。
注：在一项研究中，使用相同的校准样品应保持结果的一致性。
6。分析数据
- PCR反应扩增曲线，描绘图形和数字的分子生化的LightCycler软件版本3.5（罗氏）。量化反应，在“量化”标签ND数据导出到一个文本文件。
- 数据导入到RelQuant分析软件（罗氏），产生定量结果。为靶基因，参照基因，与标准曲线数据导入单独的文件。
- 指定的校准目标和参照基因的位置。还可以指定样品的位置。数据表示为目标参考校准的参考率的目标分为不同的样本比例。以前产生的一个特定的miRNA和看家基因的标准曲线推断未知浓度的miRNA靶基因的定量数据作为参考标准。
- 三个重复样品分析为一组，平均浓度和一式三份的标准偏差计算。如果一式三份之一是不一致的，其余的一套，它会被排除在外的计划。
7。代表结果
<一类p =的“jove_content”> qPCR的前列腺样本分析的一个例子是如图3所示。结果数值描绘，以及图形。图表显示的参考基因，U6的表达水平，开始对周期20指数扩增，而表达的靶基因中，miR-98，约出现在25周期的延迟放大。从这个实验中的数据导出为文本文件和由RelQuant分析软件分析。指定的校准和样品含有毛细血管的立场。 图4说明了如何校准器设置为1，和校准相对其他样品中的表达。
图1。miScript反转录和实时PCR的各个步骤。
图2。标准曲线所产生的一系列稀释2倍，10倍，50倍，250倍，1250倍的原始cDNA样本。
图3。罗氏分子生化的LightCycler软件显示整个实验图形和文字信息。荧光定量实时PCR扩增图显示上升，从不同的样品。
图4数据进行量化使用RelQuant的LightCycler分析软件。通常情况下，三个重复，作为一个群体，并产生明显不一致的结果排除样品和平均浓度和一式三份的标准偏差计算分析样品。
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Discussion
已不断发现一些miRNA的异常表达在前列腺肿瘤中比正常组织，这些miRNAs部分已命名为潜在的新的治疗药物，预防前列腺癌的11。因此，miRNA的异常表达水平可能是有用的诊断和/或预后标志物。这里提供实时定量PCR方法检测前列腺肿瘤组织中miRNA的水平准确的量化。使用的miScript PCR系统可以检测单核苷酸成熟的miRNA之间的差异。的miScript miRNA的qPCR实验，然而，不用于茎环结构的miRNA前体，而的不同miScript易制毒化学检测可检测。
这项技术的可靠性取决于输入RNA的质量，因此RNA的浓度，完整性和纯度应事先测试实时PCR。此外，核糖核酸酶是非常stabl的e和易于降解的RNA，因此要格外小心，应采取的RNA处理。所有的反应，应设置在冰上，以尽量减少RNA的降解。添加到反应之前，反转录酶抑制剂，也可以。手套应经常更换，消毒和一次性塑料制品必须在整个过程中使用。
如果没有PCR产物或实时PCR扩增曲线检测后期，尽量增加PCR循环数，并确保单车的计划包括在95°C激活的HotStarTaq DNA聚合酶15分钟低放大，也可能是由于不足出发cDNA为模板，因此，设法增加的cDNA量。后期放大，也可以代表一个假阳性。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由加拿大癌症协会研究所资助的，不授予。 019038。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 | |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 | |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 | |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche Group | ||
| Light Cycler Capillaries | Roche Group | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2538 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
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