Summary
Kvantitativ realtids-polymeras-kedjereaktion (qPCR) är en snabb och känslig metod för att undersöka expressionsnivåema av olika mikro-RNA (miRNA) molekyler i tumörprover. Med användning av denna metod uttryck av hundratals olika miRNA molekyler kan amplifieras, kvantifieras, och analyserades från samma cDNA-mall.
Abstract
MikroRNA (miRNA) är enkelsträngade, 18-24 nukleotider lång, icke-kodande RNA-molekyler. De är involverade i praktiskt taget varje cellulär process med utveckling 1, apoptos 2 och cellcykelreglering 3. MiRNA beräknas för att reglera uttrycket av 30% till 90% av humana gener 4 genom bindning till sina mål-RNA budbärar (mRNA) 5. Utbredd dysreglering av miRNA har rapporterats i olika sjukdomar och subtyper cancer 6. På grund av deras förekomst och unika struktur, dessa små molekyler är sannolikt att bli nästa generation av biomarkörer, terapeutiska medel och / eller mål.
Metoder som används för att undersöka miRNA uttrycket inkluderar SYBR Green I färgpulverbaserat samt Taqman-prob baserad qPCR. Om miRNA ska användas effektivt i klinisk miljö, är det absolut nödvändigt att deras upptäckt i färsk och / eller arkiveras kliniska prover vara korrekt, reproducerbar, och SPecific. qPCR har använts i stor omfattning för att validera expression av miRNA i hela genom analyser såsom microarray studier 7. De prover som användes i detta protokoll var från patienter som genomgick radikal prostatektomi för kliniskt lokaliserad prostatacancer, men andra vävnader och cellinjer kan vara substituerad i. Prostata prover snabbfrystes i flytande kväve efter resektion. Kliniska variabler och uppföljning information för varje patient togs in för senare analys 8.
Kvantifiering av miRNA nivåer i prostatatumör prover. De viktigaste stegen i qPCR analys av tumörer är: Total RNA-extraktion, cDNA-syntes, och detektion av qPCR produkter med användning av miRNA-specifika primrar. Total-RNA, som innefattar mRNA miRNA, och andra små RNA extraherades från prover med användning av TRIzol-reagens. Qiagen har miScript system användes för att syntetisera cDNA och utföra qPCR (figur 1). Endogena miRNA inte polyadenylated därför under den omvända transkriptionen, polyadenylates en poly (A)-polymeras i miRNA. Den miRNA används som en mall för att syntetisera cDNA med användning av oligo-dT och omvänt transkriptas. En universell tagg-sekvensen på 5'-änden av oligo-dT-primrar underlättar amplifieringen av cDNA i PCR-steget. PCR-produkten amplifiering detekteras genom nivån av fluorescens som emitteras av SYBR Green, ett färgämne som interkalerar till dubbelsträngat DNA. Specifika miRNA primers, tillsammans med en universell primer som binder till den universella taggen sekvensen kommer att förstärka specifika miRNA sekvenser.
De miScript Primer Analyser finns i över tusen mänskligt specifika miRNA och hundratals murina-specifika miRNA. Relativ kvantifiering metod användes här för att kvantifiera uttrycket av miRNA. För att korrigera för variationer mellan olika prover, är expressionsnivåer av en mål-miRNA normaliserades till de expressionsnivåer av en referens-genen. Valet av en GEne som att normalisera uttrycket av mål är kritisk i relativ kvantifiering analysmetod. Exempel på referens gener som vanligtvis används i denna egenskap är den lilla RNA RNU6B, RNU44 och RNU48 eftersom de anses vara stabilt uttryckas i de flesta prover. I detta protokoll är RNU6B används som referens-genen.
Protocol
1. Prostata Provtagning
- Samla upp prostata prover vid tiden för prostatektomi. Provet orienteras med anatomiska landmärken. Prostata och sädesblåsor är målade enligt följande: höger sida green, vänster sida blå.
- Ett slumpmässigt tvärgående mittdelen av prostata tas vinkelrätt mot den rektala ytan, frystes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C 9.
- Cellbanker skivor exemplar är kopieras, orienterade (främre, bakre, höger och vänster), fyrsektioners. Sektioner skärs med hjälp av kryostat.
- Sektioner färgas med H & E och granskas av en patolog för att bestämma och avgränsa tumör jämfört med normal områden på de färgade bilderna och en motsvarande bild. De markerade områdena används som en guide för att indikera områden från vilka för att extrahera tumörvävnad från vilken RNA kommer att extraheras i de efterföljande stegen.
2. Isolera totalt RNA, inklusive miRNA, från Prover
- Placera frysta prostata prov på torris och med hänvisning till de skisserade kopia, skära ut en liten del av prostata tumören (mellan 50 till 100 mg).
- Homogenisera vävnaden prostatatumör i 1 ml Trizol-reagens. Kvantiteterna i de följande stegen bygger på användning av 1 ml TRIzol reagens.
Notera: Här har vi använt Trizol-reagens för att extrahera RNA, men andra kit att isolera små RNA-innehållande totalt RNA kan också användas.
- Inkubera homogeniserade proverna under 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 0,2 ml kloroform till proverna och skaka kraftigt i 15 sekunder. Inkubera proverna under 3 minuter vid rumstemperatur, därefter centrifugera vid 12000 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Överföra den färglösa övre vattenfasen till nya rör och tillsätt 0,5 ml isopropylalkohol.Inkubera proverna under 10 minuter vid rumstemperatur, därefter centrifugera vid 12000 xg i 10 minuter vid 4 ° C.
- Försiktigt aspirera supernatanten utan att störa pelleten innehåller RNA. Tvätta RNA-pelleten med 1 mL av 75% etanol. Virvel provet och åter sedimentera genom centrifugering under 5 minuter vid 7500 xg vid 4 ° C.
- Noggrant aspirera supernatanten och torr RNA-pelleten i 5-10 minuter, vilket gör att RNA-pelleten inte är fullständigt torrt. Återupplösa i nukleasfritt vatten lämpligt för att pelletera stora. Mätning av koncentrationen av RNA med användning av NanoDrop 1000 spektrofotometer (mått absorbans vid 260 nm och 280 nm).
- Kontrollera kvaliteten och integriteten hos de RNA-prover med hjälp av Agilent Bioanalyzer.
3. Omvänd transkription av RNA
- Omvänd transkription av RNA utfördes med användning av miScript omvänd transkription Kit enligt tillverkarens instruktioner (Qiagen). Detta kit innehåller enomvänt transkriptas och en poly (A)-polymeras. Den miScript RT-buffert innefattar Mg 2 +, dNTP: er, oligo-dT-primers och slumpmässiga primrar.
- Använda mellan 10 pg och 1 | ig RNA för att syntetisera cDNA. Om du använder mer än 1 mikrogram av RNA, skala upp reaktionen linjärt till lämplig storlek.
- Framställa en huvudblandning som innehåller 5X miScript RT-buffert (4 pl), miScript omvänd transkription Blanda (1 | il), och RNas-fritt vatten för att bringa reaktioner slutlig volym av 20 pl. Inkludera även mall-RNA (upp till 1 g) i Master Mix.
- Proven inkuberas under 60 minuter vid 37 ° C följt omedelbart av en inkubation under 5 minuter vid 95 ° C. Detta steg kan utföras i en PCR-maskin, upphettning blocket, eller vattenbad. Tennocyklerapparater är den mest lämpliga och korrekta metod. Lagra det cDNA på is under kort tid, och -20 ° C under långtidslagring.
4. Generera en standardkurva
- Före kompeiment med mål-miRNA är en standardkurva som genererats med användning av cDNA av kända koncentrationer mot sina korsningspunkter (CP) (Figur 2).
- Framställa en serie av spädningar av 2-faldigt, 10-faldigt, 50-faldigt, 250-faldigt, och 1250-faldigt den ursprungliga cDNA för ett prov som är känt för att ha en väsentlig uttryckning av en gen av intresse.
- Kör PCR som anges i avsnitt 5 "Real-time PCR för detektion av miRNA", med den ändringen att cDNA i serieutspädningar inte en statisk 40x spädning.
- Utför analys med RelQuant mjukvara (Roche) för att generera standardkurvan.
Obs: en ny standardkurva måste genereras för varje gen av intresse.
5. Realtids-PCR för detektion av miRNA
- Realtids-PCR för miRNA utfördes med användning av miScript SYBR Green PCR Kit och miScript Primer Analys i enlighet med tillverkarens instruktioner (Qiagen). Förbered en master mix som innehåller2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay, och RNas-fritt vatten. Förbered en master mix för en 20 ^ volym reaktion.
- Primer-analys är specifik för miRNA av intresse. För att återskapa 10x miScript Primer analys, centrifugera flaskan en kort stund, och tillsätt 550 pl TE-buffert, pH 8,0. Vortex flaskan kort att blanda, lika stora primers till mindre volymer, och förvara vid -20 ° C. Två primrar erfordras. Primrar för den sökta genen och referensen genen RNU6B är usedas referens-genen.
- Späd cDNA 40x och lagra extra alikvoter vid -20 ° C.
- cDNA tjänar som mall för PCR. Använda 2 | il av utspätt 40x cDNA och dispensera till 20 | il ljus cyklem kapillärer (Roche).
- Lägg till 18 pl av Master Mix till varje kapillär och centrifugera med en kapillär adapter.
- Placera kapillärerna i en kapillär-baserad Real-Time cykler, såsom LightCycler 3.5 Real-Time PCR System med en 32-kapillär karusell format.
- Köra PCR-cykling programmet som följer:
Att aktivera HotStarTaq polymeras som är i 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, före inkubering vid 95 ° C under 15 minuter.
Följt av 50 cykler av:
Denaturering, 15 s, 94 ° C;
Glödgning, 30 s, 55 ° C;
Förlängning, 30 s, 70 ° C. - Välj ett prov som skall kalibratorn, och sätta dess normaliserade mål uppgår till 1. Jämföra den relativa expressionen av miRNA i alla de andra samplen till kalibratom.
Obs: Inom en studie bör samma kalibrering provet användas för att upprätthålla konsekvens av resultaten.
6. Analysera data
- Förstärknings kurvor för PCR-reaktionerna återges grafiskt och numeriskt av Molecular Biochemicals LightCycler Software version 3,5 (Roche). Kvantifiera reaktioner i "kvantifiering" fliken, ennd exportera data till en textfil.
- Importera data till RelQuant analysprogram (Roche) för att generera kvantifiering resultat. Importera separata filer för målgen, referens-gen och standarddata kurva.
- Ange positionen för kalibrator för både mål-och referens-genen. Också specificera positioner hos proven. Data uttrycks som mål för att referera förhållande av olika prover dividerat med målet att referens-förhållande av kalibratorn. Den standardkurva som tidigare genererats för en särskild miRNA och housekeeping-genen används som en referensstandard för extrapolering kvantitativa data för miRNA mål av okända koncentrationer.
- Tre replikat av prover analyseras som en grupp och medelkoncentrationer och standardavvikelser av trippelprover beräknas. Om en av de tre exemplar är oförenlig med resten av uppsättningen, kommer den att uteslutas av programmet.
7. Representativa resultat
<p klass = "jove_content"> Ett exempel på qPCR analys på prostata prov visas i Figur 3. Resultaten är avbildade numeriskt, såväl som grafiskt. De kurvor som visar uttrycksnivåer av referensen genen, U6, börjar exponentiell amplifiering vid ca cykel 20, medan uttrycket av målgenen, miR-98, visade fördröjd amplifiering ungefär vid cykel 25. Data från detta experiment exporterades som textfil och analyseras av RelQuant analysprogram. Positionerna för kapillärerna innehållande kalibrator och prover anges. Figur 4 illustrerar hur kalibratorn sätts till att vara 1, och uttrycket av andra prover i förhållande till kalibratom.
Figur 1. Olika stegen i miScript omvänd transkription och Real-time PCR.
Figur 2. En standardkurva genererades genom att använda en serie av spädningar av 2-faldigt, 10-faldigt, 50-faldigt, 250-faldigt, och 1250-faldigt den ursprungliga cDNA-provet.
Figur 3. Roche Molecular Biochemicals LightCycler Software visar hela informationen om försöket grafiskt och med text. Kvantitativ realtids-PCR-amplifieringsprodukter plottar visar ökad i fluorescens från olika prover.
Figur 4. Data kvantifierades med hjälp RelQuant programmet LightCycler analys. Vanligtvis replikerar tre av prover analyseras som en grupp och prover som producerar tydligt inkonsekventa resultat utesluts och innebär koncentrationer och standardavvikelser i tre exemplar beräknas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avvikande uttryck av vissa miRNA har genomgående visat i prostatatumörer jämfört med normal vävnad 10, och några av dessa miRNA har angivits såsom möjliga nya terapeutiska medel mot prostatacancer 11. Därigenom de avvikande expressionsnivåer av miRNA kan vara användbara diagnostiska och / eller prognostisk biomarkörer. Real-Time qPCR metodik presenteras här ger en analys för exakt kvantifiering av miRNA nivåer i prostata tumörvävnad. Den miScript PCR-system användes kan detektera enstaka nukleotidskillnader mellan mogna miRNA. De miScript miRNA qPCR Analyser emellertid inte är avsedda för detektering av prekursor-svängstruktur miRNA för vilka olika miScript Precursor analyser finns tillgängliga.
Tillförlitligheten av denna teknik beror på kvaliteten av den ingående RNA, alltså koncentration, integritet, och renhet av RNA bör kontrolleras före Real-Time PCR. Dessutom ribonukleaser är mycket stabilt och funtione och lätt nedbrytbart RNA, därför extra försiktighet bör vidtas vid hanteringen av RNA. Alla synpunkter bör sättas upp på isen för att minimera RNA nedbrytning. RNas-inhibitorer kan även sättas till reaktionsblandningen före omvänd transkription. Handskar bör bytas ut ofta, medan sterila och disponibel plastvaror måste användas under hela proceduren.
Om det inte finns PCR-produkt eller amplifieringskurva upptäcks sent i Real-Time PCR, prova att öka antalet PCR-cykler och se till att cykla programmet inkluderar aktivering av HotStarTaq DNA-polymeras i 15 minuter vid 95 ° C. Låg förstärkning också kan bero på otillräcklig start cDNA mall därför försöka att öka mängden av cDNA. Sen förstärkning kan också representera en falsk positiv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av den kanadensiska Cancer Society Research Institute, inte bevilja. 019.038.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 | |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 | |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 | |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche Group | ||
| Light Cycler Capillaries | Roche Group | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2538 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
- Reinhart, B. J.
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D.
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
