Summary
Quantitative Real Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist eine schnelle und empfindliche Methode, um die Expression verschiedener microRNA (miRNA) Moleküle in Tumorproben zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahrens Expression von Hunderten von verschiedenen miRNA-Moleküle können verstärkt, quantifiziert werden, und analysiert die gleiche cDNA-Matrize.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind einzelsträngige, 18-24 Nukleotide lange, nicht-kodierende RNA-Moleküle. Sie werden in nahezu allen zellulären Vorgang einschließlich der Entwicklung 1, 2 Apoptose, Zellzyklus-Regulation und 3 beteiligt. MiRNA werden geschätzt, um die Expression von 30% bis 90% der menschlichen Gene 4 zu regulieren durch Bindung an ihre Ziel-Boten-RNA (mRNA) 5. Verbreitet Dysregulation von miRNAs in verschiedenen Erkrankungen und Krebs Subtypen 6 wurde berichtet. Aufgrund ihrer Häufigkeit und einzigartige Struktur sind diese kleinen Moleküle wahrscheinlich die nächste Generation von Biomarkern, therapeutischen Wirkstoffen und / oder Ziele.
Den verwendeten Methoden zur miRNA-Expression zu untersuchen sind SYBR Green I-Farbstoff-Basis sowie TaqMan-Sonde basierte qPCR. Wenn miRNAs, um effektiv im klinischen Umfeld eingesetzt werden sollen, ist es unerlässlich, dass ihr Nachweis im Süß-und / oder archiviert klinischen Proben genaue, reproduzierbare und specific. qPCR wurde in großem Stil für die Validierung Expression von miRNAs in whole genome Analysen wie Microarray-Studien 7 verwendet. Die Beispiele in diesem Protokoll verwendet wurden, waren von Patienten, die radikale Prostatektomie für klinisch lokalisierten Prostatakrebs unterzogen, jedoch in anderen Geweben und Zelllinien können auf Prostata-Präparate ersetzt werden waren-Snap-in flüssigem Stickstoff schockgefroren nach Resektion. Klinische Variablen und Follow-up-Informationen für jeden Patienten wurden für die anschließende Analyse 8 gesammelt.
Die Quantifizierung der miRNA-Ebenen in Prostata-Tumor-Proben. Die wichtigsten Schritte in der qPCR-Analyse von Tumoren sind: Die Gesamt-RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und Erkennung von qPCR Produkten mit miRNA-spezifischen Primer. Die Gesamt-RNA, die mRNA, miRNA und andere kleine RNAs enthalten wurden aus Proben mit Trizol Reagenz extrahiert. Qiagen miScript System wurde verwendet, um cDNA zu synthetisieren und führen qPCR (Abbildung 1). Endogene miRNAs sind nicht polyadenylated, also während der reversen Transkription Verfahren polyadenylates ein Poly (A)-Polymerase die miRNA. Die miRNA wird als Matrize zur Synthese von cDNA unter Verwendung von Oligo-dT und Reverse Transkriptase. Eine universelle Tag-Sequenz am 5'-Ende des Oligo-dT-Primer erleichtert die Amplifikation von cDNA in der PCR-Schritt. PCR-Produkt Verstärkung wird durch den Grad der Fluoreszenz von SYBR Green, ein Farbstoff, der in doppelsträngige DNA interkaliert emittiert detektiert. Spezifische Primer miRNA, zusammen mit einem Universal Primer, die zur allgemeinen Tag-Sequenz bindet, zu amplifizieren miRNA Sequenzen.
Die miScript Primer Assays sind für mehr als tausend Menschen-spezifischen miRNAs, und Hunderte von Maus-spezifischen miRNAs zur Verfügung. Die relative Quantifizierung Verfahren wurde hier, um die Expression von miRNAs quantifizieren. Um die Variabilität zwischen den verschiedenen Proben zu korrigieren, wird Expression eines Ziel-miRNA, um die Expression eines Gens Bezug normalisiert. Die Wahl eines gene, auf der die Expression von Zielen zu normalisieren kritisch relative Quantifizierung Analyseverfahren. Beispiele von Referenz-Genen in der Regel in dieser Funktion verwendet werden, sind die kleinen RNAs RNU6B, RNU44 und RNU48 da sie als zu stabil in den meisten Proben ausgedrückt werden. In diesem Protokoll wird RNU6B als Referenz-Gen verwendet.
Protocol
1. Prostate Probenentnahme
- Sammeln Sie die Prostata Proben zum Zeitpunkt der Prostatektomie. Die Probe wird mit anatomischen Landmarken orientieren. Die Prostata und Samenblasen sind wie folgt lackiert: rechts grün, links blau.
- Eine zufällige quer Mittelabschnitt der Prostata senkrecht zur rektalen Oberfläche entnommen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C 9.
- Banked Scheiben von Proben sind fotokopiert, orientiert (anterior, posterior, rechts und links), viergeteiltem. Querschnitte werden geschnitten mit dem Kryostaten.
- Die Schnitte werden mit H & E gefärbt und bewertet durch einen Pathologen zu bestimmen und abzugrenzen Tumor gegenüber normalen Bereiche auf den gefärbten Schnitten und einem entsprechenden Bild. Die markierten Bereiche werden als Leitfaden für die Bereiche, aus denen das Tumorgewebe aus dem RNA in den nachfolgenden Schritten extrahiert werden extrahiert, um anzuzeigen, verwendet.
2. Isolierung von Gesamt-RNA, miRNA-Inklusive, von Proben
- Erstarrt Prostata Proben auf Trockeneis und unter Bezugnahme auf die Kopie abgegrenzt, herausgeschnitten einen kleinen Teil des Prostatatumors (zwischen 50 bis 100 mg).
- Homogenisieren des Prostata-Tumor-Gewebe in 1 ml TRIzol Reagenz. Die Mengen in den folgenden Schritten basieren auf der Verwendung von 1 ml TRIzol Reagens.
Hinweis: Wir haben TRIzol Reagenz zum Extrahieren von RNA verwendet, jedoch können andere Kits, die kleine isolieren RNA enthaltende Gesamt-RNA kann ebenfalls verwendet werden.
- Inkubieren der homogenisierten Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 0,2 ml Chloroform zu den Proben und kräftig schütteln für 15 Sekunden. Inkubieren Proben für 3 Minuten bei Raumtemperatur, dann bei 12.000 × g zentrifugiert 15 Minuten bei 4 ° C
- Übertragen Sie die obere wässrige Phase farblos in frische Röhrchen, und fügen Sie 0,5 ml Isopropylalkohol.Inkubieren Proben für 10 Minuten bei Raumtemperatur, dann bei 12.000 × g zentrifugiert 10 Minuten bei 4 ° C
- Vorsichtig den Überstand aspirieren, ohne das Pellet mit der RNA. Waschen der RNA-Pellet mit 1 ml 75% Ethanol. Vortexen der Probe und Re-Sediment durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 7.500 × g bei 4 ° C
- Vorsichtig den Überstand aspirieren und trocken das RNA-Pellet für 5-10 Minuten darauf achten, das RNA-Pellet nicht vollständig trocken ist. In Nuklease-freies Wasser angebracht, Pellet-Größe wieder auflösen. Messen der Konzentration von RNA unter Verwendung des NanoDrop 1000 Spektrophotometer (Messung der Extinktion bei 260 nm und 280 nm).
- Prüfen Sie die Qualität und Integrität der RNA-Proben mit Agilent Bioanalyzer.
3. Reverse Transkription von RNA
- Reverse Transkription der RNA wurde unter Verwendung miScript RT Kit nach den Anweisungen des Herstellers (Qiagen). Dieses Kit enthält einReverse Transkriptase und eine Poly (A)-Polymerase. Die RT-Puffer enthält miScript Mg 2 +, dNTPs, Oligo-dT-Primer und zufällige Primer.
- Verwenden Sie zwischen 10 pg und 1 pg der RNA-cDNA zu synthetisieren. Wenn Sie mehr als 1 ug RNA, Scale-up die Reaktion linear mit der entsprechenden Lautstärke.
- Erstellen Sie einen Master-Mix, der 5X miScript RT-Puffer (4 ul), miScript Reverse Transkription Mix (1 ul) und RNase-freies Wasser zu Reaktionen auf Endvolumen von 20 ul bringen enthält. Auch Matrizen-RNA (bis zu 1 ug) in der Master-Mix.
- Inkubieren der Proben für 60 Minuten bei 37 ° C unmittelbar gefolgt von einer Inkubation für 5 Minuten bei 95 ° C Dieser Schritt kann in einer PCR-Maschine durchgeführt werden, Heizblock oder Wasserbad. Thermocycler sind die am besten geeignete und genaue Methode. Bewahren Sie die cDNA auf Eis für kurze Sicht und -20 ° C für die langfristige Lagerung.
4. Erstellen einer Standardkurve
- Vor experiment mit Ziel-miRNAs wird eine Standardkurve mit bekannten Konzentrationen von cDNAs gegen ihren Kreuzungspunkten (CP) (Abbildung 2) erzeugt.
- Eine Reihe von Verdünnungen von 2-fach, 10-fach, 50-fach, 250-fach, und 1250-fachen der ursprünglichen cDNA einer Probe, die bekanntermaßen eine wesentliche Expression des Gens von Interesse ist.
- Führen Sie die PCR, wie in Abschnitt 5 "Real-time PCR zum Nachweis von miRNA" angegeben, mit der Modifikation, dass cDNA in Verdünnungsreihen kein statisches 40x Verdünnung ist.
- Führen Sie die Analyse mit Hilfe RelQuant Software (Roche), um Ihre Standardkurve zu erstellen.
Hinweis: ein neuer Standard-Kurve muss für jedes Gen von Interesse erzeugt werden.
5. Real-time PCR zum Nachweis von miRNA
- Echtzeit-PCR für miRNAs wurde unter Verwendung miScript SYBR Green PCR Kit und miScript Primer Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers (Qiagen). Erstellen Sie einen Master-Mix enthalten2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay und RNase-freies Wasser. Erstellen Sie einen Master-Mix für einen 20 ul Volumen Reaktion.
- Die Primer-Assay ist spezifisch für die miRNA von Interesse. Zur Rekonstitution 10x miScript Primer Assay, zentrifugieren Sie das Fläschchen kurz, und fügen Sie 550 ul TE Puffer, pH 8,0. Vortex das Fläschchen kurz zu mischen, aliquoten Primer auf kleinere Volumina und bei -20 ° C. Zwei Primer benötigt. Primer für die Ziel-Gen und dem Referenz-Gen ist RNU6B usedas die Referenz-Gen.
- Verdünnen Sie die cDNA-40x und zusätzliche Speicher Aliquots bei -20 ° C.
- cDNA dient als Matrize für die PCR. Verwenden Sie 2 ul 40x verdünnten cDNA und verzichten auf die 20 ul Light Cycler Kapillaren (Roche).
- In 18 ul des Master-Mix zu jeder Kapillare, und zentrifugieren mit Hilfe einer Kapillare Adapter.
- Setzen Sie den Kapillaren in einer Kapillare basierten Real-Time-Cycler, wie z. B. LightCycler 3.5 Real-Time PCR-System mit einem 32-Kapillar-Karussell-Format.
- Führen Sie die PCR-Cycling-Programm wie folgt:
Um HotStarTaq Polymerase, die in der 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, aktiviert werden, vor inkubieren bei 95 ° C für 15 Minuten.
Gefolgt von 50 Zyklen von:
Denaturierung, 15 s, 94 ° C;
Glühen, 30 s, 55 ° C;
Erweiterung, 30 s, 70 ° C - Wählen Sie eine Probe an den Kalibrator sein, und setzen Sie den normalisierten Zielbetrag auf 1 setzen. Vergleichen Sie die relativen Expression der miRNA in all den anderen Proben an den Kalibrator.
Hinweis: Im Rahmen einer Studie, die gleiche Kalibrierung Probe sollte verwendet werden, um die Konsistenz der Ergebnisse zu halten.
6. Analysieren von Daten
- Amplification-Kurven für die PCR-Reaktionen werden grafisch und numerisch durch Molecular Biochemicals LightCycler Software Version 3.5 (Roche) dargestellt. Quantifizieren Reaktionen in der "Quantifizierung"-Reiter, einND exportieren Sie die Daten in eine Textdatei.
- Importieren Sie die Daten an die RelQuant Analyse-Software (Roche), um eine Quantifizierung Ergebnisse zu generieren. Importieren Sie einzelne Dateien für Zielgen, Referenz-Gen, und Standardkurve Daten.
- Gibt die Position der Kalibrator für Ziel-und Referenz-Gen. Zudem die Positionen der Proben. Die Daten werden als Ziel-Verhältnis von verschiedenen Proben durch das Ziel an Referenzverhältnis des Kalibrators Teilreferenzspannungen ausgedrückt. Die Standardkurve vorher für eine bestimmte miRNA und Housekeeping-Gen erzeugt wird, als Referenz-Standard für die Extrapolation der quantitativen Daten für die miRNA-Targets von unbekannten Konzentrationen verwendet.
- Drei Wiederholungen der Proben als Gruppe analysiert und mittleren Konzentrationen und Standardabweichungen des dreifach berechnet wird. Wenn einer der dreifach ist unvereinbar mit dem Rest des Satzes, wird es vom Programm ausgeschlossen werden.
7. Repräsentative Ergebnisse
<p class = "jove_content"> Ein Beispiel für die qPCR-Analyse auf Prostata-Proben ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Ergebnisse werden numerisch dargestellt sowie graphisch dargestellt. Die Diagramme, die die Expression des Referenz-Gen, U6, beginnt bei etwa exponentiellen Amplifikation Zyklus 20, während die Expression des Zielgens, miR-98, eine verspätete Amplifikation etwa in Zyklus 25. Die Daten aus diesem Experiment wurde als Textdatei exportiert und mittels RelQuant Analyse-Software. Positionen der Kapillaren mit dem Kalibrator und Proben angegeben. Abbildung 4 zeigt, wie der Kalibrator eingestellt ist, dass 1 sein, und die Expression von anderen Proben relativ zum Kalibrator.
Abbildung 1. Verschiedene Schritte in miScript reverse Transkription und Echtzeit-PCR.
2. Eine Standardkurve wird durch Verwendung einer Reihe von Verdünnungen von 2-fach, 10-fach, 50-fach, 250-fach, und 1250-fachen der ursprünglichen cDNA-Probe erzeugt wird.
Abbildung 3. Roche Molecular Biochemicals LightCycler Software zeigt die gesamte Information des Experiments graphisch und durch Text. Quantitativer real-time PCR-Amplifikation Plots zeigen in der Fluoreszenz aus verschiedenen Proben erhöht.
Abbildung 4. Daten wurden wieder mit RelQuant LightCycler-Analyse-Software. Normalerweise repliziert drei Proben werden als Gruppe und Proben, die klar zu inkonsistenten Ergebnissen ausgeschlossen sind, zu produzieren und mittleren Konzentrationen und Standardabweichungen des dreifach berechnet wird analysiert.
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Discussion
Aberrant Ausdrücke einiger miRNAs wurden konsequent in Prostata-Tumoren gefunden werden, wenn zu normalem Gewebe 10, und einige dieser miRNAs wurden als potenzielle neuartige Therapeutika gegen Prostatakrebs 11 benannt verglichen. Daher die aberrante Expression von miRNAs können nützliche diagnostische und / oder prognostischer Biomarker sein. Der Real-Time qPCR hier vorgestellten Methodik stellt einen Assay für eine genaue Quantifizierung von miRNA-Ebenen in Prostata-Tumorgewebe. Die miScript PCR System verwendet werden erkennen single nucleotide Unterschiede zwischen den reifen miRNAs. Die qPCR-Assays miScript miRNA sind jedoch nicht für den Nachweis von Stammschleife Vorläufer miRNAs, für die unterschiedliche miScript Precursor-Assays zur Verfügung gedacht.
Die Zuverlässigkeit dieser Methode hängt von der Qualität des Eingangs-RNA, also Konzentration, Integrität und Reinheit der RNA sollten vor dem Real-Time PCR getestet werden. Darüber hinaus sind Ribonukleasen sehr Stable und schwer abbaubar, RNA, also besonders vorsichtig sein sollten im Umgang mit der RNA entnommen werden. Alle Reaktionen sollten auf Eis gesetzt werden, um RNA-Abbau zu minimieren. RNase-Inhibitoren können auch für die Reaktion vor der reversen Transkription zugesetzt werden. Handschuhe sollten häufig gewechselt werden, während sterile Einmal-Kunststoffprodukte und während des gesamten Verfahrens verwendet werden muss.
Wenn es kein PCR-Produkt oder die Amplifikation Kurve erkannt wird spät in Real-Time PCR, erhöhen Sie die Anzahl der PCR-Zyklen, und stellen Sie sicher, dass der Radsport-Programm die Aktivierung von HotStarTaq DNA-Polymerase für 15 Minuten bei 95 ° C umfasst Niedrige Verstärkung kann auch durch unzureichende Ausgangspunkt cDNA-Matrize, daher versuchen, die Menge an cDNA zu erhöhen. Verspätete Verstärkung kann auch eine falsch positiv.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der kanadischen Krebsgesellschaft Research Institute finanziert wurde, gewähren keine. 019038.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 | |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 | |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 | |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche Group | ||
| Light Cycler Capillaries | Roche Group | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2538 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
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