Summary
פולימראז כמותי זמן אמת תגובת שרשרת (QPCR) היא שיטה מהירה רגישה כדי לחקור את רמות הביטוי של microRNA שונים (מירנה) מולקולות דגימות הגידול. שימוש בביטוי זה השיטה של מאות מולקולות שונות מירנה יכול להיות מוגבר, לכמת אותה ולנתח אותה מהתבנית cDNA אותו.
Abstract
מיקרו RNA (miRNAs) הם יחיד תקועים, 18-24 נוקלאוטידים ארוכים, ללא קידוד מולקולות RNA. הם מעורבים בכל תהליך כמעט הסלולר כולל 1 פיתוח, אפופטוזיס 2, מחזור התא תקנה 3. MiRNAs מוערך להסדיר את הביטוי של% 30 עד% 90 של הגנים האנושיים 4 באמצעות קשירה שליח היעד שלהם RNAs (mRNAs) 5. Dysregulation נרחב של miRNAs דווחה מחלות סרטן שונות תת 6. בשל השכיחות שלהם מבנה ייחודי, אלו מולקולות קטנות עשויים להיות הדור הבא של סמנים ביולוגיים, סוכני טיפולית ו / או מטרות.
שיטות לחקור ביטוי מירנה כוללים SYBR ירוק אני מבוסס צבען, כמו גם Taqman-בדיקה QPCR מבוסס. אם miRNAs יש להשתמש ביעילות בסביבה קלינית, זוהי חובתו של זיהוי שלהם בדגימות קליניות טריים ו / או בארכיון להיות מדויקת, לשחזור, ו SPecific. QPCR כבר בשימוש נרחב עבור אימות ביטוי miRNAs ב ניתוחים הגנום כולו, כמו מדעי microarray 7. דגימות בשימוש בפרוטוקול זה היו חולים שעברו כריתה רדיקאלית של הערמונית לסרטן ערמונית מקומי קלינית, אולם רקמות אחרות שורות תאים ניתן להחליף בו דגימות הערמונית היו הצמד קפוא בחנקן נוזלי לאחר כריתה. משתנים קליניים מעקב מידע עבור כל מטופל נאספו לצורך ניתוח שלאחר מכן 8.
כימות רמות מירנה בדגימות סרטניים בערמונית. השלבים העיקריים בניתוח QPCR של גידולים הם: סה"כ מיצוי RNA, סינתזה cDNA, זיהוי של מוצרים QPCR באמצעות מירנה פריימרים ספציפיים. RNA כולל, הכולל mRNA, מירנה, ו RNAs קטנים אחרים שהוצאו מן דגימות באמצעות מגיב TRIzol. MiScript של Qiagen מערכת שימש לסנתז cDNA ולבצע QPCR (איור 1). MiRNAs אנדוגניים לא POlyadenylated, ולכן בתהליך שעתוק לאחור, פולימראז פולי (א) polyadenylates מירנה. מירנה משמש כתבנית לסנתז cDNA באמצעות oligo-DT ו - reverse transcriptase. רצף תג אוניברסלית על קצה '5 של oligo-DT primers מאפשר הגברה של cDNA בשלב ה-PCR. הגברה PCR המוצר מזוהה על ידי רמת הקרינה הנפלטת SYBR ירוק, צבע אשר intercalates לתוך ה-DNA גדילי כפול. מירנה פריימרים ספציפיים, יחד עם פריימר יוניברסל הנקשרת רצף תג אוניברסלית יהיה להגביר מירנה רצפים מסוימים.
מבחני פריימר miScript זמינים יותר מאלף בני אדם ספציפיים miRNAs, ומאות Murine ספציפיים miRNAs. שיטת כימות יחסי שימש כאן כדי לכמת את הביטוי של miRNAs. כדי לתקן את השונות בין מדגמים שונים, רמות הביטוי של מירנה היעד מנורמל את רמות הביטוי של הגן התייחסות. הבחירה של GEנה שבו לנרמל את הביטוי של מטרות הוא קריטי שיטת כימות היחסית של הניתוח. דוגמאות של גנים התייחסות המשמשים בדרך כלל במסגרת זו הם RNU6B RNAs קטן, RNU44, ו RNU48 כפי שהם נחשבים לבוא לידי ביטוי ביציבות לאורך רוב דגימות. בפרוטוקול זה, RNU6B משמש הגן התייחסות.
Protocol
1. הערמונית אוסף דוגמאות
- איסוף דגימות הערמונית במועד כריתת ערמונית. דגימה מכוונת באמצעות ציוני דרך אנטומיים. הערמונית שלפוחית הזרע צבועים באופן הבא: ירוק בצד ימין, הצד השמאלי הכחול.
- הבטן הרוחבי אקראי של הערמונית היא נלקחה בניצב לפני השטח של פי הטבעת, קפואים בחנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -80 ° C 9.
- פרוסות המכסים של דגימות הם מצולם, אוריינטציה (קדמית, אחורית, ימין ושמאל), quadrisected. קטעים נחתכים באמצעות cryostat.
- סעיפים מגואלות H & E ו נבדקות על ידי פתולוג כדי לקבוע להתוות תחומים לעומת גידול רגיל בשקופיות מוכתמים ועל התמונה המתאימה. האזורים המסומנים משמשים כמדריך כדי לציין אזורים ממנה כדי לחלץ את רקמת הגידול שממנו RNA יחולצו בשלבים הבאים.
2. בידוד RNA סך הכל, כולל מירנה, מדגימות
- קפואים מקום הערמונית דגימות על קרח יבש בהתייחסו צילום התחום, לחתוך חלק קטן של הגידול בערמונית (בין 50 מ"ג עד 100).
- Homogenize גידול הערמונית רקמות מ"ל 1 של מגיב TRIzol. הכמויות של השלבים הבאים מבוססים על שימוש מ"ל 1 של מגיב TRIzol.
הערה: כאן יש לנו להשתמש מגיב TRIzol עבור RNA לחילוץ, אולם הערכות אחרות לבודד RNA קטנים המכילים RNA הכל יכול לשמש גם.
- דגירה דגימות ומעורים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 0.2 מ"ל של כלורופורם על דגימות ולנער במרץ למשך 15 שניות. דגירה דגימות במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, ואז סרכזת ב XG 12,000 במשך 15 דקות 4 ° C.
- להעביר את השלב חסר צבע מימית העליון לצינורות טריים, ולהוסיף 0.5 מ"ל של אלכוהול איזופרופיל.דגירה דגימות עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואז סרכזת ב XG 12,000 במשך 10 דקות 4 ° C.
- בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה המכילה רנ"א. לשטוף גלולה RNA עם 1 מ"ל של אתנול 75%. המערבולת מדגם מחדש משקעים ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות בכל XG 7500 ב 4 ° C.
- בזהירות לשאוב supernatant ויבש גלולה רנ"א למשך 5-10 דקות, כדי לוודא גלולה RNA הוא לא יבש לחלוטין. מחדש להתמוסס במים nuclease ללא המתאים לגודל כדורית. למדוד את הריכוז של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop 1000 (מדד הספיגה של 260 ננומטר ו -280 ננומטר).
- לבדוק את איכות ותקינות של דגימות רנ"א באמצעות Agilent Bioanalyzer.
3. שעתוק לאחור של RNA
- שעתוק לאחור של RNA בוצעה באמצעות תמלול miScript ערכת הפוך על פי הוראות היצרן (Qiagen). ערכה זו כוללתלהפוך transcriptase ו פולימראז () פולי. מאגר RT miScript כולל Mg 2 +, dNTPs, oligo-DT primers, ו פריימרים אקראיים.
- השתמש בין PG 10 ו 1 מיקרוגרם של RNA לסנתז cDNA. אם אתה משתמש יותר מ 1 מיקרוגרם של רנ"א, הסולם את התגובה באופן ליניארי לנפח המתאים.
- להכין תערובת המכילה שני 5X miScript RT חוצץ (4 μl), תמלול miScript הפוך Mix (1 μl), ו RNase ללא מים להביא התגובות נפח סופי של μl 20. גם RNA תבנית (עד 1 מיקרוגרם) בתמהיל האב.
- דגירה הדגימות למשך 60 דקות ב 37 ° C ואחריו מיד הדגירה במשך 5 דקות על 95 ° C. שלב זה יכול להתבצע במכונה PCR, חימום אמבטיה לחסום, או מים. Thermocyclers הם השיטה המתאימה ביותר ומדויק. אחסן את cDNA על הקרח לטווח קצר, ו -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
4. יצירת עקומת סטנדרט
- לפני experiment עם miRNAs היעד, עקומת סטנדרט נוצרת באמצעות cDNAs של ריכוזים ידועים נגד המעברים שלהם (CP) (איור 2).
- הכינו סדרה של דילולים של פי 2, פי 10, פי 50, פי 250, ו 1250 פי cDNA המקורי של מדגם כי הוא ידוע כבעל ביטוי ניכר של הגן העניין שלך.
- הפעל את ה-PCR כאמור בסעיף 5 "בזמן אמת PCR לגילוי של מירנה", עם שינויים כי cDNA הוא דילולים סדרתיים לא דילול 40X סטטי.
- ביצוע ניתוח באמצעות תוכנה RelQuant (Roche) כדי ליצור עקומת הרגיל שלך.
הערה: עקומת סטנדרט חדש חייב להיות שנוצר עבור כל גן של עניין.
5. בזמן אמת PCR לגילוי מירנה
- PCR בזמן אמת עבור miRNAs בוצעה באמצעות miScript SYBR גרין PCR קיט Assay miScript פריימר בהתאם להוראות היצרן (Qiagen). להכין תערובת המכילה שני2x QuantiTect SYBR גרין PCR מיקס מאסטר, 10x פריימר miScript יוניברסל, פריימר 10x Assay miScript, ו RNase ללא מים. להכין תערובת אב תגובה 20 נפח μl.
- Assay פריימר ספציפי מירנה של עניין. כדי לשקם 10x Assay miScript פריימר, בצנטריפוגה בקבוקון בקצרה, ולהוסיף 550 μl TE חיץ, pH 8.0. בקבוקון וורטקס בקצרה לערבב, primers aliquot לאמצעי האחסון קטנות יותר, בחנות ב -20 ° C. שני פריימרים נדרשים:. Primers עבור הגן היעד הגן התייחסות RNU6B הוא usedas גן התייחסות.
- לדלל את aliquots cDNA נוספות 40X וחנות ב -20 ° C.
- cDNA משמש תבנית עבור ה-PCR. השתמש 2 μl של cDNA בדילול מלא 40X ו לוותר על 20 μl אור Cycler נימים (Roche).
- הוסף 18 μl של מיקס מאסטר זה נימי, ו סרכזת באמצעות מתאם נימי.
- מניחים את הנימים ב Cycler נימי בזמן אמת מבוסס, כמו LightCycler 3.5 Real-Time PCR מערכת עם פורמט 32-נימי קרוסלה.
- להפעיל את התוכנית אופניים PCR כדלקמן:
להפעלת פולימראז HotStarTaq הנמצא 2x QuantiTect SYBR גרין PCR מיקס מאסטר, מראש דגירה על 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
ואחריו 50 מחזורים של:
Denaturation, 15 S, 94 ° C;
חישול, 30 S, 55 ° C;
, הרחבה של 30, 70 ° C. - בחר מדגם להיות כיל, וקבע סכום היעד שלה מנורמל ל -1. השווה את הביטוי היחסי של מירנה בכל דגימות אחרות כיל.
הערה: במסגרת המחקר, המדגם כיול אותו יש להשתמש כדי לשמור על עקביות התוצאות.
6. ניתוח נתונים
- עקומות הגברה עבור PCR תגובות מתוארים בצורה גרפית ומספרית של הגרסה ביוכימיקלים מולקולרית LightCycler Software 3.5 (Roche). לכמת תגובות בכרטיסייה "כימות",ND לייצא את הנתונים לקובץ טקסט.
- לייבא את הנתונים לתוכנה ניתוח RelQuant (Roche) כדי לייצר תוצאות כימות. ייבוא קבצים נפרדים עבור גן המטרה, גן התייחסות, ונתונים עקומת סטנדרטיים.
- ציין את מיקום היעד של כיל והן הגן התייחסות. גם לציין עמדות הדגימות. נתונים מבוטא היעד להפנות היחס בין מדגמים שונים חלקי יעד יחס התייחסות של כיל. עקומת תקן שנוצר בעבר עבור מירנה בפרט גן משק משמש כסטנדרט התייחסות חיוץ נתונים כמותיים עבור מטרות מירנה של ריכוזים לא ידועים.
- שלושה משכפל של דגימות מנותחים כקבוצה כלומר ריכוזים וסטיות תקן של בשלושה עותקים מחושב. אם אחד triplicates את עולה בקנה אחד עם שאר הקבוצה, זה לא ייכללו בתוכנית.
7. נציג תוצאות
<בכיתה P = "jove_content"> דוגמה של ניתוח QPCR על דגימות הערמונית מוצגת באיור 3. תוצאות מתוארים מבחינה מספרית, כמו גם באופן גרפי. הגרפים מראים את רמות הביטוי של הגן התייחסות, U6, להתחיל הגברה מעריכי על המחזור על 20, בעוד הביטוי של גן המטרה, miR-98, הראה עיכוב הגברה כ ב מחזור 25. הנתונים מניסוי זה היה מיוצא כקובץ טקסט ונותחו על ידי תוכנת ניתוח RelQuant. עמדותיהם של נימי דם המכילים כיל ודוגמאות מפורטים. איור 4 מדגים כיצד כיל מוגדר להיות 1, ואת הביטוי של דוגמאות אחרות ביחס כיל.
באיור 1. בפעולות שונות על miScript הפוכה שעתוק בזמן אמת PCR.
איור 2. עקומת סטנדרט נוצרת באמצעות סדרה של דילולים של פי 2, פי 10, פי 50, פי 250, ו 1250 פי מדגם cDNA המקורי.
איור 3. רוש תוכנה ביוכימיקלים מולקולרית LightCycler מציגה את המידע המלא של הניסוי בצורה גרפית ועל ידי טקסט. כמותי בזמן אמת עלילות ה-PCR הגברה להראות גדל הקרינה מ מדגמים שונים.
נתונים בתרשים 4. היו לכמת באמצעות תוכנת RelQuant ניתוח LightCycler. בדרך כלל, 3 שכפול של דגימות מנותחים כקבוצה דגימות היוצרות תוצאות לא עקביות ברורה מודרים ולהתכוון ריכוזים וסטיות תקן של בשלושה עותקים מחושב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביטויים חריגים של miRNAs כמה נמצאו באופן עקבי גידולי הערמונית בהשוואה הרקמות 10, וכמה miRNAs אלה כבר בשם פוטנציאליים סוכני טיפולית חדשנית נגד סרטן הערמונית 11. לפיכך את רמות הביטוי החריג של miRNAs יכול להיות סמנים ביולוגיים אבחון ו / או פרוגנוסטית שימושיים. המתודולוגיה בזמן אמת QPCR המובא כאן מספק assay על כימות מדויק של רמות מירנה ברקמות סרטניים בערמונית. מערכת ה-PCR miScript בשימוש ניתן לזהות הבדלים בין נוקלאוטיד בודד miRNAs בוגרים. QPCR את מירנה מבחני miScript, לעומת זאת, לא נועדו לצורך זיהוי של לולאה גזע miRNAs מבשר, אשר שונים מבחני מבשר miScript הזמינים.
המהימנות של טכניקה זו תלויה באיכות של קלט RNA, אם כן, ריכוז יושר, טוהר RNA יש לבדוק לפני Real-Time PCR. יתר על כן, הם ribonucleases stabl מאודE ו בקלות לבזות RNA, ובכך משנה זהירות יש לנקוט בטיפול של RNA. כל התגובות יש להגדיר על קרח כדי למזער השפלה RNA. מעכבי RNase יכול גם להוסיף תגובה לפני להפוך שעתוק. כפפות יש לשנות לעתים קרובות, תוך plasticware סטרילית חד פעמיות יש להשתמש לאורך כל ההליך.
אם אין מוצר ה-PCR או עקומת הגברה מתגלה מאוחר Real-Time PCR, נסה להגדיל את מספר מחזורי ה-PCR, ולוודא כי תוכנית רכיבה על אופניים כולל הפעלת ה-DNA פולימראז HotStarTaq במשך 15 דקות על 95 ° C. הגברה נמוכה עלולה להיות גם עקב תבנית בלתי מספקת cDNA ההתחלה, ולכן מנסה להגדיל את כמות cDNA. הגברה מאוחר יכול גם לייצג חיובי כוזב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי האגודה למלחמה בסרטן הקנדית מכון המחקר, לא להעניק. 019038.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 | |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 | |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 | |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche Group | ||
| Light Cycler Capillaries | Roche Group | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2538 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
