定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

Summary

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）は、腫瘍サンプル中の様々なマイクロRNA（miRNA）分子の発現レベルを調査するために迅速かつ高感度な方法です。異なるmiRNA分子の何百ものこのメソッド式を使用して、増幅定量化し、同じcDNAをテンプレートから分析することができます。

Abstract

マイクロRNA（miRNA）は、一本鎖、18から24ヌクレオチド長、非コーディングRNA分子である。彼らは、開発^1、アポトーシス^2、および細胞周期の調節^3を含むほぼすべての細胞プロセスに関与している。 miRNAはそのターゲットメッセンジャー^{RNA（mRNA）5}に結合することにより、ヒト遺伝子の^{30％〜90％4}の発現を調節すると推定されている。 miRNAの広範囲の調節不全は、様々な疾患や癌のサブタイプ⁶で報告されています。その有病率とユニークな構造により、これらの小分子は、バイオマーカー、治療薬および/またはターゲットの次の世代になる可能性があります。

miRNAの発現を調べるために使われるメソッドは、SYBR Green I色素をベースと同様のTaqManプローブベース定量PCRが含まれています。 miRNAが効率的に臨床の現場で使用する場合は、それが新鮮な、そして/または、アーカイブされた臨床検体での検出は、正確な再現性、およびspであることが不可欠であるecific。定量PCRは、広くこのようなマイクロアレイ研究⁷などの全ゲノム解析におけるmiRNAの発現を検証するために使用されています。このプロトコルで使用されているサンプルは、臨床的限局性前立腺癌に対する根治的前立腺摘除術を施行した患者からのものであった。しかし、他の組織や細胞株は、切除した後に液体窒素で瞬間凍結した前立腺標本インチ置換することができます。臨床的変数とそれぞれの患者のフォローアップ情報は、その後の分析⁸に収集した。

前立腺腫瘍サンプル中のmiRNAレベルの定量化 。腫瘍の定量PCR解析の主な手順は次のとおりです。トータルRNA抽出、cDNA合成、およびmiRNA特異的プライマーを用いた定量PCR産物の検出。 mRNAは、miRNAの、および他のsmall RNAを含むトータルRNAは、TRIzol試薬を用いて検体から抽出した。キアゲンのmiScriptシステムはcDNAを合成し、定量PCR（ 図1）を実行するために使用されていました。内因性miRNAはPOではありません逆転写の過程で、したがって、lyadenylated、ポリ（A）ポリメラーゼがmiRNAをpolyadenylates。 miRNAはオリゴdTと逆転写酵素を用いてcDNAを合成するためのテンプレートとして使用されています。 oligo-dTプライマーの5 '末端に普遍的なタグ配列は、PCRのステップでcDNAの増幅を容易にします。 PCR産物の増幅は、SYBRグリーン、二本鎖DNAにインターカレート色素が発する蛍光のレベルで検出されます。ユニバーサルタグ配列に結合するユニバーサルプライマーと一緒に特定のmiRNAのプライマーは、特定のmiRNAの配列を増幅します。

miScriptプライマーアッセイは、千以上の人間に固有のmiRNA、およびマウス固有のmiRNAの何百もご利用いただけます。相対定量法はmiRNAの発現を定量化するためにここで使用されていました。異なるサンプル間のばらつきを補正するために、ターゲットのmiRNAの発現レベルは、基準遺伝子の発現レベルに正規化されています。 GEの選択ターゲットの表現を正規化するのNEは、分析の相対定量法では非常に重要です。彼らは安定してほとんどのサンプルを越えて発現していることが考えられているとして、通常、この容量で使用されているリファレンス遺伝子の例としては、RNU6B、RNU44、とRNU48の小さなRNAである。このプロトコルでは、RNU6Bを参照遺伝子として使用されます。

Protocol

1。前立腺のサンプルコレクション

1. 前立腺全摘除術時の前立腺のサンプルを収集します。標本は解剖学的ランドマークを用いて配向されている。前立腺と精嚢は、次のように描かれています。右側の緑、左側の青。
2. 前立腺のランダムな横方向の中央部には、直腸表面に垂直に撮影し、液体窒素中で凍結し、-80°C ⁹で保存されています。
3. 検体のバンクスライスは、複写指向（、前方後方、右と左）、quadrisectedです。セクションは、クライオスタットを用いてカットされます。
4. セクションは、H＆Eで染色し、染色したスライドとそれに対応する画像上の腫瘍対正常な領域を決定し、記述するために病理学者によって検討されています。マークされた領域は、RNAは、以降の手順で抽出され、そこから腫瘍組織を抽出する領域を示すためのガイドとして使用されます。

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2。サンプルからmiRNAを含むトータルRNAを単離

1. ドライアイスと線引きコピーを参照の上に置いて凍結前立腺サンプルは、前立腺腫瘍のごく一部（50〜100mgの間）に切り取る。
2. TRIzol試薬1mLに前立腺腫瘍組織をホモジナイズする。次の手順で数量がTRIzol試薬を1mLの使用に基づいています。

注：ここでは、RNAを抽出するためのTRIzol試薬を使用している、小さなRNAを含むトータルRNAを分離するが、他のキットを使用することもできます。

3. 室温で5分間均質化し、サンプルをインキュベートします。
4. サンプルにクロロホルム0.2 mLを加え、15秒間激しく振る。室温で3分間サンプルをインキュベートし、4℃で15分間12,000 xgで遠心分離℃、
5. 新鮮なチューブに無色の上部の水相を転送し、イソプロピルアルコール0.5mLを追加します。室温で10分間サンプルをインキュベートし、4℃で10分間12,000 xgで遠心分離℃、
6. RNAを含有するペレットを乱すことなく、上清を注意深く吸引除去する。 75％エタノール1mLをRNAペレットを洗浄します。渦4で7500 xgで5分間遠心分離による試料と再堆積℃に
7. 慎重に上清を吸引し、RNAペレットが完全に乾いていないことを確認し、5〜10分間RNAペレットを乾燥させます。ペレットのサイズに適切なヌクレアーゼフリー水に再溶解する。光度計1000分光光度計（260 nmと280 nmにおける吸光度を測定して）を使用してRNAの濃度を測定します。
8. アジレントバイオアナライザを用いたRNAサンプルの品質と整合性を確認します。

3。 RNAの逆転写

1. RNAの逆転写は、メーカーの指示（キアゲン社）によるとmiScript逆転写キットを用いて行った。このキットには含まれています転写酵素およびポリ（A）ポリメラーゼを逆にしてください。 miScript RTバッファーは、Mg ^{2 +、dNTP}を、oligo-dTプライマー、ランダムプライマーが含まれています。
2. cDNAを合成するために10 pgのRNAの1μgの間に使用します。 RNAの1以上のμgを使用している場合は、適切なボリュームに直線的に反応をスケールアップ。
3. 20μlの最終容量に反応をもたらすために5X miScript RTバッファー（4μl）を、miScript逆転写ミックス（1μL）、およびRNaseフリー水を含むマスターミックスを調製する。また、マスターミックスのテンプレートRNA（最大1μg）を含む。
4. 37℃で60分間サンプルをインキュベート°C、95℃で5分間インキュベートした直後にこのステップは、ブロックまたは水浴を加熱し、PCRマシンで実行することができます。サーモは、最も適切かつ正確な方法があります。短期的に氷の上にcDNAを保存し、-20℃、長期保存用。

4。検量線を作成する

1. exper前にターゲットのmiRNAとiment、標準曲線は、そのクロッシングポイント（CP）（ 図2）に対して、既知濃度のcDNAを使用して生成されます。
2. 2倍、10倍、50倍、250倍、1250倍の希釈液、目的の遺伝子の実質的な発現を有することが知られているサンプルの元のcDNAのシリーズを準備します。
3. 第5章 "miRNAを検出するためのリアルタイムPCR"で指定されたcDNAは、段階希釈しない静的な40倍希釈であることを修正して、PCRを実行します。
4. あなたの標準曲線を生成するためにRelQuantソフトウェア（Roche）を用いて分析を実行します。

注：新しい標準曲線は、目的の各遺伝子を生成する必要があります。

5。 miRNAの検出のためのリアルタイムPCR

1. miRNAのリアルタイムPCRは、メーカーの指示（キアゲン社）によるとmiScript SYBRグリーンPCR KitおよびmiScriptのPrimer Assayを用いて行った。を含むマスターミックスを調製2倍のQuantiTect SYBRグリーンPCRマスターミックス、10倍miScriptユニバーサルプライマー、10倍miScriptプライマーアッセイ、およびRNaseフリー水。 20μlの体積反応用のマスターミックスを調製する。
2. プライマーアッセイは、興味のmiRNAに特異的である。再構成する10倍miScriptプライマーアッセイに、簡単にバイアルを遠心し、550μlのTEバッファー（pH 8.0）を追加します。 -20℃でボルテックス混合するために一時的にバイアル、小さいボリュームにアリコートプライマー、およびストア2つのプライマーを必要とされています。標的遺伝子とリファレンス遺伝子用のプライマーRNU6Bは、リファレンス遺伝子usedasです。
3. -20℃でのcDNA 40倍と店舗余分なアリコートを希釈する
4. cDNAは、PCRのテンプレートとして機能します。 40倍希釈したcDNA2μlのを使用し、20μlのライトサイクラーキャピラリー（ロシュ）に分配する。
5. 各キャピラリーにマスターミックス18μlを追加し、キャピラリアダプタを使用して遠心します。
6. そのようなサイクラー3のようなキャピラリーベースのリアルタイム·サイクラーに毛細血管を配置します。32キャピラリーカルーセル形式で5リアルタイムPCRシステム。
7. 次のようにPCRサイクリング·プログラムを実行します。
   2倍のQuantiTect SYBRグリーンPCRマスターミックスでHotStarTaq Polymeraseを有効にするには、95℃でプレインキュベート15分間°C。
   の50サイクルが続いています。
   変性、15秒、94°C;
   アニーリング、30秒、55°C;
   拡張子、30秒、70℃
8. キャリブレーターになるサンプルを選択し、1に正規化され、その目標額を設定します。キャリブレータを他のすべてのサンプル中のmiRNAの相対的発現を比較します。

注：研究の中では、同じキャリブレーションサンプルは、結果の一貫性を維持するために使用されるべきである。

6。データの分析

1. PCR反応の増幅曲線は、分子生化学のライトサイクラーソフトウェアバージョン3.5（ロシュ社）はグラフと数値で示されている。 、 "定量化"タブで反応を定量化するndはテキストフ​​ァイルにデータをエクスポートします。
2. 定量結果を生成するためにRelQuant解析ソフトウェア（ロシュ）にデータをインポートします。標的遺伝子、リファレンス遺伝子、および検量線のデータに別々のファイルをインポートします。
3. ターゲットとリファレンス遺伝子の両方のキャリブレータの位置を指定します。また、サンプルの位置を指定します。データは、キャリブレータの比率を参照するには、ターゲットで割った値の異なるサンプルの比率を参照するターゲットとして表されます。以前に特定のmiRNAとハウスキーピング遺伝子用に生成された標準曲線は、未知の濃度のmiRNAのターゲットの定量的なデータを外挿するための参照標準として使用されます。
4. 三は、サンプルの複製され、グループとして分析し、濃度と三重の標準偏差が計算されることを意味しています。三連の1セットの残りの部分と矛盾している場合は、プログラムによって除外されます。

7。代表的な結果

<pのクラス= "jove_content">前立腺サンプルのqPCR解析の例を図3に示されています。結果はグラフィカルにだけでなく、数値的に描かれています。標的遺伝子は、miR-98の発現は約25℃のサイクル遅延増幅を示したリファレンス遺伝子の発現レベルを示すグラフ、U6は、周期約20℃で指数関数的増幅を開始します。この実験から得られたデータはテキストフ​​ァイルとしてエクスポートし、RelQuant解析ソフトウェアで解析した。キャリブレータとサンプルを含む毛細血管の位置が指定されています。 図4は、キャリブレータを1に設定し、校正器に対する相対他のサンプルの発現方法を示します。

図1。miScript逆転写反応とリアルタイムPCRの様々な手順を実行します。

図2標準曲線は、2倍、10倍、50倍、250倍、1250倍オリジナルのcDNAサンプルの希釈系列を使用して生成されます。

図3。ロシュ·ダイアグノスティックスのライトサイクラーソフトウェアは、グラフィカルとテキストによる実験の全体の情報が表示されます。定量的リアルタイムPCR増幅プロットは、異なるサンプルからの蛍光の増加を示しています。

図4のデータは、RelQuantライトサイクラー解析ソフトウェアを用いて定量した。通常は、3つのグループとして分析され、明確に矛盾した結果を生成するサンプルを除外し、三重の濃度と標準偏差が計算されることを意味されるサンプルのレプリケートされます。

Discussion

正常組織¹⁰に比較した場合、いくつかのmiRNAの異常な表現が一貫して前立腺腫瘍で発見されており、これらのmiRNAのいくつかは、前立腺癌¹¹に対する潜在的な新規治療薬として名指しされている。したがって、miRNAの異常な発現レベルは、有用な診断および/または予後バイオマーカーにすることができます。ここで紹介するリアルタイム定量PCR手法は、前立腺腫瘍組織におけるmiRNAレベルの正確な定量化のためのアッセイを提供する。使用miScript PCRシステムは、成熟miRNAの間に一塩基の違いを検出することができます。 miScriptのmiRNA qPCRアッセイは、しかし、異なるmiScript前駆体アッセイが利用可能なステムループ前駆体のmiRNAの検出を目的としていません。

この手法の信頼性は、濃度、整合性のため、入力RNAの品質に依存し、RNAの純度は、Real-Time PCRの前にテストする必要があります。また、リボヌクレアーゼは非常にstablです。eと容易にRNAを分解するには、このように特別な注意は、RNAの取り扱いに注意する必要があります。全ての反応はRNAの分解を最小限に抑えるために氷の上で設定する必要があります。のRNase阻害剤はまた、転写を逆にする前に、反応物に添加することができます。滅菌、使い捨てプラスチック製品は、プロシージャ全体で使用されている必要がありながら、手袋を頻繁に変更する必要があります。

後半リアルタイムPCRで検出されないPCR産物または増幅曲線が存在しない場合は、PCRサイクル数を増やしてみて、サイクリングプログラムは95℃で15分間HotStarTaq DNAポリメラーゼの活性化が含まれていることを確認℃、低い増幅も不十分で始まるcDNAテンプレートが原因である可能性があり、したがって、cDNAの量を増やしてみてください。後半増幅も偽陽性を表すことができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596
miScript Reverse Transcription Kit	Qiagen	218061
miScript Primer Assays	Qiagen	Experiment specific
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	218073
LightCycler 3.5 Real-Time PCR System	Roche Group
Light Cycler Capillaries	Roche Group	04929292001
NanoDrop 1000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2538
Agilent 2100 Bioanalyzer	G2943CA