Summary
Vi utvecklade en teknik som bygger på mesoporösa kiseldioxid tunn film för selektiv återställning av lågmolekylära proteiner och peptider från humant serum. De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos våra mesoporösa marker var fint avstämd ge betydande kontroll i peptid vinst och därmed profilera serum proteomet för diagnostiska ändamål.
Abstract
Identifieringen av cirkulerande biomarkörer har stor potential för icke-invasiva metoder i tidig diagnos och prognos, samt för övervakning av terapeutiska effektivitet. 1-3 Den cirkulerande lågmolekylära proteomet (LMWP) består av små proteiner kasta från vävnader och celler eller peptidfragment härstammande från den proteolytiska nedbrytningen av större proteiner, har associerats med det patologiska tillståndet hos patienter och sannolikt återspeglar resultatet av sjukdomen. 4,5 Trots dessa potentiella kliniska applikationer, till användningen av masspektrometri (MS) profilera LMWP från biologiska vätskor har visat sig vara mycket utmanande på grund av det stora dynamiska området för protein-och peptid halter i serum. 6 Utan prov förbehandling, några av de mer starkt abundanta proteiner fördunkla detektering av låg-abundans arter i serum / plasma. Aktuella proteomic-baserade metoder, såsom två-dimensionell polyakrylamidgel-electrophoresis (2D-PAGE) och proteomik shotgun metoder är arbetsintensiv, låg genomströmning och erbjuder begränsad lämplighet för kliniska tillämpningar. 7-9 Därför är en mer effektiv strategi för att isolera LMWP från blod och tillåta högkapacitetsscreening av kliniska prover .
Här presenterar vi en snabb, effektiv och tillförlitlig multi-fraktionering system baserat på mesoporösa kiseldioxid chips att särskilt rikta och berika LMWP. 10,11 mesoporösa kvarts (MPS) tunna filmer med avstämbara funktioner på nanonivå tillverkades med hjälp av trisegmentet vägen sampolymeren mall . Användning av olika polymer-mallar och koncentrationer polymer i prekursorlösningen, framställdes olika porstorleksfördelningar och porstrukturer, konnektivitet och ytegenskaper bestämmas och användas för selektiv utvinning av låg massa proteiner. Den selektiva tolkning av de anrikade peptiderna i olika underklasser beroende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper kommer enHance effektivitet för återvinning och detektion av låga förekomst arter. I kombination med masspektrometri, och statistisk analys visade vi att korrelationen mellan de nanofas egenskaperna hos de mesoporösa kiseldioxid tunna filmer och specificiteten och effektiviteten av låg massa proteomanalys skörd. De resultat som presenteras här visar potentialen av nanoteknik-baserad teknik för att ge ett kraftfullt alternativ till konventionella metoder för LMWP upptagning från komplexa biologiska vätskor. På grund av möjligheten att ställa de materiella egenskaper, kapacitet för lågkostnadsproduktion, enkelheten och snabbheten i provtagning och de kraftigt sänkta kraven prov för analys, kommer denna nya nanoteknik påverka avsevärt inom proteomik biomarkör forskning och klinisk proteomik bedömning.
Protocol
1. Chiptillverkningen
- Skapa beläggningslösningen för chipset genom att starta med den hydrolyserade silikat prekursorlösning. Blanda 14 ml tetraetylortosilikat (TEOS) med 17 ml etanol, 6,5 ml avjoniserat vatten och 0,5 ml 6 M HCl under kraftig omrörning (1200 rpm) med användning av en omröring värmeplatta. Värma denna lösning vid 80 ° C under 2 timmar, varvid omrörning konstant.
- Framställa polymerlösningar genom tillsats av den önskade tri-blocket coploymer (Pluronic F127, L121 och P123) till 10 ml etanol vid rumstemperatur med kraftig omrörning. Färdigställa blandningen genom tillsats av 7,5 ml av silikatlösning (från steg 1,1) i tri-segment-sampolymer-lösning följt av 2 timmars kraftig omrörning vid rumstemperatur. Detta representerar den slutliga beläggningslösningen.
- Tillämpas 1 ml av beläggningslösningen till en 4 tum kiselskiva genom rotationsbeläggning vid en hastighet av 1500 rpm under 20 sekunder. Därefter värm vid 80 ° C under 12 timmar.
- Värm filmerna för att ta bort organiskt surfactant genom att höja temperaturen 1 ° C per minut till 425 ° C och därefter bakar under 5 timmar.
- Förbehandla det mesoporösa kiseldioxid (MPS) chip ytan med syre plasma föraskningen (Plasma Asher - mars Plasma System). (O 2 Flöde: 80 sccm, effekt: 300 W, tid: 10 minuter).
- Valfritt yta kemisk modifiering: silanate chips i 3% organosilan i en metanol: DI vatten (19:1)-lösning under 72 timmar vid rumstemperatur i en N2-handskbox. Skölj sekventiellt med metanol och avjoniserat vatten. Bota chips vid 110 ° C i 15 minuter i en fan-driven ugn.
2. Provet Förbehandling
- Tillsätt TFA och ACN att varje serumprov på så sätt att de slutliga koncentrationerna är 0,01% TFA och 5% ACN. Virvel för att blanda.
- Skaka dessa prov på ett bord virvelskakanordning vid rumstemperatur under 30 minuter.
3. Serum Fraktionering
- Förgrädda chips över natten i en ugn vid 160 ° C. Alternativt, Store marker i en exsickator tills den ska användas för att förhindra hydrering av ytan av omgivande vatten i luften.
- Använda tryckluft för att damma bort eventuella partiklar som kan finnas på ytan av chipet.
- Klipp prefabricerade köpte CultureWell kamrar täckglas att inkludera önskat antal brunnar. Rengör täckglas med 100% etanol och sedan plats på MPS chip yta. Tryck ned täckglas med pincetter för att säkerställa en fullständig tätning med chipet.
- Pipettera 10 | il serumprov till varje 3 mm brunn. Inkubera under 30 minuter i en fuktad kammare vid rumstemperatur.
- Pipettera upp serum från brunnar och kasta. Pipettera 10 | il avjoniserat vatten till varje brunn för att tvätta bort större proteiner. Upprepa 4 gånger.
- Pipett 5 pl elueringsbuffert (0,1% TFA + 50% ACN) till varje provbrunn. Pipettera upp och ner 30 gånger under förflyttning pipettspetsen runt i brunnen för att blanda elueringsbuffert. (Endast tillämpas elueringsbuffert till 1-2 prover vid en tid för att förhindra elueringsbuffertatt avdunsta så snabbt).
- Efter blandning pipettera alla elueringsbufferten och placera det i ett mikrocentrifugrör tills den ska utföra MALDI-TOF-analys.
- För att efterlikna komplexiteten i ett biologiskt prov och att utvärdera anrikning effekten i skörd lågmolekylära arter med vår on-chip fraktionering system valde vi och monterade en vanlig blandning av proteiner och peptider räkna tjugosex olika arter med ett brett intervall av molekylvikter (900-66 500 Da) och PI (4,0-10,2) och koncentrationer (0,5-8 pmol / pl) (se proteinet listan i tabell 1).
4. MALDI-TOF-analys av peptider
- Spot 0,5 pl prov till MALDI måltavla och låt torka.
- Fläck 0,5 pl matris (α-cyano-4-hydroxikanelsyra (CHCA), 5 g / I) eller mättad lösning av trans-3 ,5-dimetoxi-4-hydroxikanelsyra (SA) i 50% acetonitril innehållande 0,1% TFA och gör det möjligt att sam-kristallisering. </ Li>
- Spot 0,5 pl kalibreringslösning varje kalibrering plats och låt torka.
- Sätt måltavlan i MALDI-TOF-masspektrometer. Maskinen ska vara inställd på en positiv reflektor läge med en laser intensitet 4200 och 3000 bilder per prov. Den valda massområdet bör vara 800 till 5000 Da med ett mål massa av 2000 Da.
- Utför samma MALDI-TOF analys i linjärt läge men ändra viktområdet till 900 till 10.000 Da eller 3000 till 70.000 Da och ett mål massa av 5000 Da.
5. Dataanalys
- Den råa spektra bearbetades med ConvertPeakList mjukvara och data exporterades till SpecAlign mjukvara för förbehandling. Alla spektra alignerades med användning av PAFFT korrelationsmetod och intensiteter normaliserades till totala jonströmmen (TIC) vid varje motsvarande spektrumet. Alla spektra glättas och de-noised med faktor av 4 respektive 0,5. Toppar detekterades med en baslinje på 0,5, massa fönster 21 och höjdförhållandet 1,5 var negativa värden bort före analys.
- Hierarkisk klustring utfördes med användning av kluster 3,0 och visualiserades med MapleTree mjukvara. MALDI MS Data (m / z toppintensiteter) var log-transformerade, normaliserade, och median centrerad. Pearson korrelation användes för att beräkna avståndet mellan proverna, och fullständig koppling klustring utfördes.
- En oberoende Student t-test användes för jämförelse mellan grupper (n = 2 grupper) för varje detekterad MS-topp före oövervakat hierarkisk klusteranalys. Ett P-värde av 0,02 eller lägre ansågs vara signifikant för att välja differentiellt skördade peptider och proteiner bland de olika mesoporösa proteomic flis (stora porer vs små porer).
6. Representativa resultat
Såsom visas i figur 1, i denna studie har vi tillverkat en serie av mesoporösa kiseldioxid tunna filmer med olika nanotextures och omfattande utforskadeir användning i selektiv infångning och anrika LMW peptider och proteiner från humant serum. Figur 2a och b visar MS-spektra av de obearbetade serumprov för peptider i intervallet av 900 till 10.000 Da och för proteiner i området av 3000 ~ 70 tusen Da respektive . Dessa spektra visar signalen undertryckande i LMW-regionen på grund av närvaron av väl joniserad, rikligt med hög molekylvikt (HMW) proteiner, såsom albumin. Figur 2c och d visar det MS-spektra av serumprovet efter fraktionering av MPS L121 (porstorlek, 6 nm). Majoriteten av de stora molekylerna har tömts, vilket resulterar i en signifikant anrikning av LMW-komponenter. Som en kontroll utfördes samma serumprov appliceras på en ickeporös rent kiseldioxidyta att utvärdera specificiteten av MPS tunna filmer för LMWP återhämtning. Såsom kan ses i figur 2e och f, förekom ingen signifikant upptagning av peptidvatten eller proteiner från icke-porös kiseldioxid. Således kan man dra slutsatsen att det var mesoporösa arkitektur och inte kiseldioxidytan affinitet som utgör den dominerande faktorn i att berika LMWP.
Exakt kontrollerade variationer i porstorlek kan uppnås genom användning av sampolymerer med olika hydrofoba blocklängder. Genom att använda de avsedda proteiner och peptider blandning har effekten av porstorleken på den LMW-peptid och protein återhämtning effekt undersöktes med användning av MPS tunna filmer framställda från fyra Pluronic ytaktiva medel (F127, P123, L121, L121 och plus svällmedel) med olika volymförhållanden av de hydrofila och hydrofoba komponenter för att bilda porstorlekar av 3,7 nm, 5,2 nm och 7,4 nm och 9,0 nm respektive. Denna serie av porstorlekar ledde till återvinning av en annan repertoar av peptider och proteiner från samma serumprovet via storlek och form utslagning (Figur 3). Proteinet spektra med hög molekylvikt demonstrate den molekylär avskiljningsgräns vid varje typ av krets. Förutom den storleksberoende utarmning av HMW proteiner, visar on-chip fraktionering av standarder lösningen en differential och selektiv anrikning av LMV arter associerade med porstorlekar. Den tvåvägs hierarkisk klustring presenteras i figur 3b visar den LMW-standarder anrikning mönster som erhållits med olika MSC. Även om alla de peptider är lägre än molekylär avskiljningsgräns vid flisen, finns det en positiv korrelation mellan porstorlekar och molekylvikten av de infångade arten. MSC med stora porer, upp till 9 nm, skörda företrädesvis större peptider, medan mindre peptider återvinns mer effektivt genom marker med mindre porer. Den strukturella omvandlingen av mesoporös arrangemanget utfördes genom att avstämma den koncentration av mallen polymeren. Ökning av koncentrationen av mallen polymeren resulterade i en reducerad gränsytan krökning mellan fasernaav vatten, varvid sampolymeren, och silikatet följaktligen initiera inbördes progression från en sfärisk till en cylindrisk struktur. Pluronic F127, med dess höga molekylvikt, uppvisar denna höga grad av strukturell periodicitet. Genom att öka koncentrationen av F127 i utgångslösningen, kan olika MPS tunnfilms periodiska nanostrukturer erhållas från 3D nanostruktur till 2D nanostruktur. 3D kubiska och honungskaka sexkantiga nanostrukturer, som har mer önskvärt nanopore samtrafikförmåga och mer lättillgänglig nanopore morfologi, uppvisar överlägsen prestanda i selektivt berika LMW peptider än 2D hexagonal struktur, även om de har liknande porstorleksfördelningar och samma molekylära cut-off för serum fraktionering (Figur 4). Vi strömlinjeformade konjugering av organo-silan på MPS chips genom att införa syreplasma glödgningen för att förbehandla chipet ytan. För att kvalitativt studera den elektrostatiska effekten på selective på-chip anrikning använder vi de proteiner och peptider blandning. MS-analys av proteomik standarder lösningen fraktionerades på MPS chips som framställts med L121 och konjugerades med de kemiska funktionella grupperna presenteras i figur 5. Den positivt laddade och negativt laddade de peptider och proteiner LMW fångas på den anjoniska och den katjoniska chipsen respektive. Den kvantitativa jämförelsen av flera MPS marker i återhämta peptiderna med positiva nettoladdningen visas i figur 5a. Flisen med negativ laddning och flisen utan ändring (med en mindre negativ laddning ursprungligen) uppvisar signifikant högre anrikning för sådana peptider än flisen modifierade med APTES (-NH2). Omvänt, de positivt laddade MPS chips har exceptionell förmåga att återhämta sig de peptider med negativ nettoladdning, som visas i figur 5b. Även α-endorfin inte visar en signifikant förändring dUE: n till dess PI runt 6.
Figur 1. Princip för MPS chips fraktionering och LMW anrikning. Efter provet fläckar på ytan, är LMW proteiner och peptider fastnar i porerna medan de större arterna kvar utanför porerna och tas bort under tvättningsstegen. De anrikade fraktionerna elueras sedan och analyserades genom MALDI.
Figur 2. Peptid berikning med de mesoporösa kiseldioxid tunn film chips. MALDI MS profiler i både det låga massområde (900 till 10 000 Da) och den höga massområde (3000 till 70 000 Da) före (a, b) och efter (c, d) serum behandling på mesoporösa kiseldioxid tunna filmer ( L121, 6 nm). Den molekylära återhämtningen är signifikant minskad vid användning av tomma icke-porös kiseldioxid ytor (e, f).
Figur 3. Molekylär avskiljningsgräns och storlek-beroende berikning av MPS chips. (A) Förstorad bild av MALDI-spektra visar den karaktäristiska molekylär avskiljningsgräns vid vardera MPS flis korrelerande till porens storlek. (B) Två-vägs hierarkisk gruppering av peptid blandning funktionerna mellan de olika chips. Intensiteten hos den röda eller gula färgen indikerar den relativa peptidkoncentration. Större porer förbättras skörd av större peptider (3600 till 8500 Da), medan de små peptider (900 till 3500 Da) har företrädesvis återhämtat sig från chips med mindre porer.
Figur 4. Fysikaliska karakteriseringar av MPS tunna filmer och selektiv återvinning med olika nanostrukturer. XRD-mönstren (a, b, c), TEM (infälld a, b, c), Pluronic F127 vid olika koncentrationer i prekursorlösningen: 4,0 x10 -3 M (en), 6,0 x 10 -3 M (b), och 8,0 x 10 ~ 2 m (c). (D) Stapeldiagram av intensiteten av detekteringen illustrerar den selektiva peptider återhämtning på 3D kubiska och hexagonala 3D F127 proteomic chips (Cub och Hex, respektive). De olika strukturella förändringar utgör en selektiv anrikning.
Figur 5. Charge-specifik återhämtning för de marker med olika yta funktioner. Stapeldiagram för MS intensitet detektering av selektivt infångade peptiderna på de funktionaliserade flisen. Beroende på deras isoelektriska punkt, peptiderna är positivt eller negativt laddade vid pH 7,0. (A) Positiva peptider ((1) des-arg1-Bradykinin, (2) Bradykinin, (3) substans P-amid, (4) neurotensin, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) är specifikt berikad på den negativt laddade suransikten. (B) Negativa peptider ((7) Glu1-fibrinopeptid B, (8) α-endorfin, (9) ACTH (18-39), (10) insulin, 11) EGF (12) insulin-liknande GF II) är specifikt berikad på de positivt laddade ytor.
Figur 6. On-chip stabilisering av fraktionerad serum. (A) Representativa MALDI profilerna för LMW peptider och proteiner som eluerats omedelbart efter serum fraktionering (överst) och efter 3 veckors på-chip lagring vid rumstemperatur (botten). (B) Från toppen till botten: Linjär regressionsanalys av genomsnittliga intensiteten hos detekterade MS toppar i varje replikat jämfört med replikera 1 för färsk fraktionerade serum och fraktionerad serum efter 3wk MPS chips förvaring i rumstemperatur. Ekvation, CV och determinationskoefficienten (R 2) anges.
Discussion
Bevis montering att det låga molekylvikt regionen i cirkulationssystemet proteomet är en rik källa av diagnostiska biomarkörer för tidig upptäckt av sjukdomen. I denna teknik presenterade vi en rad mesoporösa kvarts marker med olika porstorlekar, porstrukturer och modifieringar för att selektivt berika peptider och lågmolekylära proteiner vikt. För att utvärdera proteinstabilitet, de MPS chipsen inkuberades med humant serum, torkades efter tvättning, och lagras för 3wk vid rumstemperatur. De protein / peptid mönster var jämförbara med dem i färskt fraktionerad serum (figur 6a), vilket bekräftas av resultaten från den statistiska analysen visade i figur 6b. Variationen av topp signalerna mäts av den genomsnittliga CV uppskattades till 12,7% för råolja serum och till 14,2% för de fraktionerade proven. Marginella variationer skulle kunna bero på den inre variationen av MALDI instrumentet och föreslog att den on-chip förbehandling och lagring inducerade inte någon signifikant förändring av MS proteinprofiler. Samma experiment har utförts på icke poröst kisel. Den torkade serum återhämtade efter lagring på kisel ytan fraktionerades på MPS chips innan MALDI analys. Den dåliga MS profilen som erhölls visade att stabilisera fördel av det mesoporösa yta. I analogi med tidigare postulerade mekanismer hypotes vi att LMW arten fångade inne i nanopores bevarades från nedbrytning genom storleksuteslutnings av proteaser, eller genom sterisk hämning av proteolytiska aktivitet i det slutna rummet av nanoporer. MPS chip metod kan vara ett kraftfullt verktyg i peptid-och LMW protein profilering av komplexa biologiska vätskor studie. De MPS chips är billiga att tillverka och möjliggöra skalas upp produktionen för att uppnå samtidig bearbetning av ett stort antal prover, ger fördelaktiga funktioner för undersökande screening och biomarkör upptäckt.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Alliansen nanohälsa Pre-center Award (W81XWH-11-2-0168) och Texas Centrum för cancer nanomedicin (1U54CA151668-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetraethoxysilane | Sigma-Aldrich | 131903 | 98% |
| Spin coater | Brewer Science, Inc. | Cee 200X | |
| Plasma Asher | Nordson March | AP-600 | |
| Spectroscopic Ellipsometer | J. A. Woollam Co. | M-2000DI | |
| MALDI-TOF | Applied Biosystems | Voyager-DE-STR | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | Matrix for MALDI-TOF |
| trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 85429 | Matrix for MALDI-TOF |
| Stir hot plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 11-475-30Q | |
| CultureWell chambered coverglass | Sigma-Aldrich | GBL103350 | 3 mm diam. ×1 mm depth, 3-10 μL, sterile |
| Pluronic F 127 | BASF | PEO106-PPO70-PEO106 | |
| Pluronic L121 | BASF | PEO5-PPO70-PEO5 | |
| Pluronic P123 | BASF | PEO20-PPO70-PEO20 | |
| Table 1. Physico-chemical properties and designed concentrations (Molecular weight and Iso-electric point) of the selected peptide and protein standards. | |||
References
- Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. Proteomic applications for the early detection of cancer. Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).
- Etzioni, R. The case for early detection. Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).
- Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. Mining the plasma proteome for cancer biomarkers. Nature. 452, 571-579 (2008).
- Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E.
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics. Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).
- Rabilloud, T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics. 2, 3-10 (2002).
- Hu, Y. Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein. ACS Nano. 4, 439-451 (2010).
- Bouamrani, A. Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome. Proteomics. 10, 496-505 (2010).
