Biyomarker Discovery için Mezogözenekli Silika İnce Filmler üzerine düşük molekül ağırlıklı Protein Zenginleştirme

Summary

Bu, insan serumu ile düşük molekül ağırlıklı proteinler ve peptitler selektif geri kazanımı için gözenekli silis ince film dayanan bir teknoloji geliştirilmiştir. Bizim gözenekli cips fiziko-kimyasal özellikleri ince peptid zenginleştirme önemli kontrolü sağlamak ve sonuçta tanısal amaçlı serum proteom profil ayarlı edildi.

Abstract

Dolaşımdaki biyobelirteçlerin belirlenmesi non invaziv erken tanısı ve prognozu yaklaşımlar, yanı sıra tedavi etkinliğinin izlenmesi için büyük bir potansiyele sahip. ^1-3 veya dokuların ve hücrelerin dökülen küçük proteinlerden oluşan dolaşımdaki düşük molekül ağırlıklı proteom (LMWP) Daha büyük proteinlerin proteolitik degradasyona türetilmiş peptit parçaları, hastaların in patolojik durum ile ilişkilidir ve muhtemelen hastalığın durumu göstermektedir. bu potansiyel klinik uygulamalarda rağmen ^4,5 edilmiş, kütle spektrometre (MS) kullanılması LMWP gelen profil biyolojik sıvılarda çok nedeniyle serum protein ve peptid konsantrasyonları geniş dinamik aralık için zor olduğu kanıtlanmıştır. ⁶ örnek ön arıtma olmadan, daha yüksek miktarda protein, bazı serum / plazma düşük bolluk türlerinin tespitini zorlaştırdığı. Böyle iki boyutlu poliakrilamid jel-el gibi Şu proteomik-temelli yaklaşımlar,ectrophoresis (2D-PAGE) ve av tüfeği proteomik yöntemleri klinik uygulamalar için emek-yoğun, düşük verimlilik ve teklif sınırlı uygunluk. Bu nedenle ^7-9 olup, daha etkili bir strateji kandan LMWP izole ve klinik örneklerin yüksek verimli görüntüleme sağlamak için gerekli .

Burada, özellikle hedef ve LMWP zenginleştirmek için gözenekli silis fiş dayalı, hızlı, verimli ve güvenilir bir çoklu-fraksiyon sistemi sunuyoruz. Nano ölçülerde ayarlanabilir özellikleri ile ^10,11 Mezogözenekli silika (MPS) ince filmler triblok kopolimer şablonu yolu kullanan uyduruldu . Çözeltilerden farklı şablonlar polimer ve polimer konsantrasyonu kullanarak, çeşitli gözenek boyut dağılımı, gözenek yapıları, bağlantı ve yüzey özellikleri belirlenir ve düşük kütleli proteinler seçici kurtarma için uygulanmıştır. Farklı alt sınıflarından içine zenginleştirilmiş peptidlerin seçici bir ayrıştırma bunların fizikokimyasal özelliklere uygun olacak trtoparlanma ve düşük bolluğu türlerinin algılama verim Hance. Kütle spektrometresi ve istatistik analizi ile birlikte, biz gözenekli silis ince filmlerin nanophase özellikleri ve düşük kütleli proteom hasat spesifite ve etkinliği arasındaki korelasyon gösterdi. Sonuçları burada kompleks biyolojik sıvılardan LMWP hasat için geleneksel yöntemlere güçlü bir alternatif sağlamak için nanoteknoloji tabanlı teknoloji potansiyelini açığa sundu. Malzeme özellikleri ayarlamak için yeteneği, düşük maliyetli üretim kapasitesi nedeniyle, numune toplama ve analiz için büyük ölçüde azaltılmış örnek gereksinimleri sadeliği ve hızı, bu romanı nanoteknoloji ölçüde proteomik biyomarker araştırma ve klinik proteomik alanında etkileyecektir değerlendirmesi.

Protocol

1. Chip Fabrikasyon

1. Hidrolize silikat çözeltilerden ile başlayan çip kaplama çözümü oluşturun. 17 ml etanol ile tetraethylorthosilicate (TEOS) ve 14 mL karıştırıp, kuvvetli karıştırma altında deiyonize su ve 6M HCI ve 0.5 ml 6.5 mL (1.200 rpm) bir sıcak plaka karıştırılır kullanılarak. Karıştırarak sabit tutularak, 2 saat boyunca 80 ° C'de ısıtılır, bu çözüm.
2. Kuvvetli karıştırma ile oda sıcaklığında 10 ml etanol ile istenen tri-blok coploymer (Pluronic 127, L121 ve P123) ekleyerek polimer çözeltilerinin hazırlanması. Oda sıcaklığında, kuvvetli karıştırma 2 saat takiben tri-blok kopolimer çözeltisi içine silikat çözeltisi (1.1 adım gelen) ve 7.5 ml eklenerek karışım tamamlar. Bu, nihai kaplama solüsyonu temsil eder.
3. 20 saniye süreyle 1500 rpm hızında yan kaplama ile bir 4 inç silikon için kaplama çözeltisi ile 1 mL geçerlidir. 80 daha sonra sıcaklık 12 ° C saat boyunca.
4. Organik su çıkarmak için filmleri ısıtın425 ° C sıcaklıkta 1 dakika başına yükselterek rfactant ° C, ve daha sonra 5 saat süreyle fırında.
5. Oksijen plazma küllendirimi (- Mart Plazma Sistemi Plazma Asher) ile gözenekli silis (MPS) çip yüzey önceden işleme. (O ₂ Akış hızı: 80 sccm, gücü: 300 W, süresi: 10 dakika).
6. Isteğe bağlı yüzey kimyasal modifikasyon: metanol içinde% 3 organosilane in silanate yongaları: DI su (19:01) bir N ₂ torpido oda sıcaklığında 72 saat için çözelti. Metanol ve DI su ile sırayla durulayın. 110 ° C'de bir fan ile çalışan fırında 15 dakika yongaları Cure.

2. Örnek Tedavi öncesi

1. Nihai konsantrasyonu% 0.01 TFA,% 5 ACN olduğu gibi, her serum numunesi için TFA ve ACN ekleyin. Karıştırmak için Vortex.
2. 30 dakika için oda sıcaklığında bir tablo girdaplı karıştırma cihazı üzerinde, bu örneklerin çalkalanır.

3. Serum Fraksiyonasyon

1. 160 fırında gece boyunca Pre-fırında yongaları ° C Alternatif olarak, store bir kurutucuda yongaları havada ortam su yüzeyinin hidratasyon önlemek için kullanılana kadar.
2. Çip yüzeyinde olabilecek herhangi bir parçacıklar tozunu için basınçlı hava kullanın.
3. Prefabrik Kes, kuyu istenilen sayıda dahil etmek CultureWell odacıklı coverglass satın aldı. MPS çip yüzeyinde% 100 etanol ve sonra yer ile Temiz coverglass. Çip ile tam bir sızdırmazlık sağlamak için forseps ile coverglass bastırın.
4. Ayrıca her 3 mm içine serum örneğinin pipetle 10 uL. Oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odacık içinde 30 dakika süreyle inkübe edilir.
5. Kuyulardan serum kadar Pipeti atın. Her bir kuyuya deiyonize su pipetle 10 uL büyük proteinler yıkayacak kadar. 4 kez tekrarlayın.
6. Ayrıca her bir örnek için pipetle 5 uL elüsyon tamponu (% 0.1 TFA +% 50 ACN). Elüsyon tampon karıştırmak için de etrafında pipet hareket ederken 30 kez aşağı yukarı Pipeti ve. (Sadece elüsyon tampon önlemek için bir seferde 1-2 örnekleri elüsyon tampon uygulanırbu kadar çabuk buharlaşan itibaren).
7. MALDI-TOF analiz için hazır olana kadar karıştırma sonrasında, bir mikrosantrifüj tüp içinde tüm işlem tampon maddesi ile yer Pipeti.
8. Bir numunenin biyolojik karmaşıklığı taklit etmek ve yonga fraksiyonasyon sistemi ile düşük molekül ağırlıklı türler hasat zenginleştirme etkisini değerlendirmek için, bu seçilir ve geniş olan yirmi altı farklı türler sayma proteinler ve peptitler, standart bir karışımı monte molekül ağırlıkları (900-66 500 Da) ve PI (4,0-10,2) ve konsantrasyonu (0.5-8 pmol / ml) aralığı (Tablo 1 protein listesine bakınız).

4. Peptidlerin MALDI-TOF Analizi

1. Nokta 0.5 MALDI hedef plaka için numune uL ve kurumaya bırakın.
2. Nokta 0,5 uL matriks (α-siyano-4-hidroksisinnamik asit (CHCA), 5 g / L) ya da% 0.1 TFA ve içeren% 50 asetonitril içindeki trans-3 ,5-dimetoksi-4-hidroksisinnamik asit (SA) ve doymuş çözeltisi co-kristalleşmeye izin verir. </ Li>
3. Nokta 0.5 her kalibrasyon noktaya kalibrasyon çözüm uL ve kurumaya bırakın.
4. MALDI-TOF kütle spektrometresi içine hedef plakası yerleştirin. Makine numune başına 4200 ve 3000 çekim bir lazer yoğunluğu ile pozitif reflektör moduna ayarlanması gerekir. Seçilen kütle aralığı 2000 Da bir hedef kitle ile 800 ila 5000 Da olmalıdır.
5. Lineer modda aynı MALDI-TOF analiz ancak 900 ila 10.000 Da veya 3000 için 70.000 ve 5000 Da Da bir hedef kitle için kitle aralığını değiştirebilirsiniz.

5.. Veri Analizi

1. Ham spektrumları ConvertPeakList yazılımı ile işlendi ve veri ön işleme için yazılım SpecAlign ihraç edildi. Tüm spektrumları PAFFT korelasyon yöntemi ve şiddetleri her gelen spektrum içinde toplam iyon akımı (TIC) normalize edildi kullanarak hale getirilmiştir. Tüm spektrumları düzeltti ve sırasıyla 4 ve 0.5 faktörü ile kaldırdığımızda noised edildi. Peaks 0.5, kitle 21 pencere ve yüksekliği bir temel ile belirlendioranı 1.5, negatif değerler analizden önce çıkarıldı.
2. Hiyerarşik kümeleme Küme 3.0 kullanılarak yapılan ve MapleTree yazılımı ile görüntülendi. MALDI MS Data (m / z pik şiddetlerini) log-dönüştürülmüş, normalize, ve medyan merkezli oldu. Pearson korelasyon örnekleri arasındaki uzaklığı hesaplamak için kullanılan ve tam bağlantı kümeleme yapıldı.
3. Bağımsız Student t-testi öncesinde denetimsiz hiyerarşik kümeleme analizi için her bir tespit MS zirve için gruba (n = 2 grup) arasında karşılaştırma için kullanılmıştır. 0.02 veya daha düşük bir P-değeri farklı mezogözenekli proteomik yongaları (Geniş gözenekler vs Küçük gözenekler) arasında farklı şekilde hasat peptidler ve proteinler seçmek için anlamlı kabul edildi.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bu çalışmada, nanotextures çeşitli gözenekli silis ince film bir dizi üretilmiş ve kapsamlı bir şekilde araştırılmıştırseçici yakalama ve insan serum gelen LMW peptitler ve proteinler zenginleştirici. Şekil 2a ve b'de ir kullanımı 900 ila 10,000 Da aralığında peptidler için ve 3000 aralığında proteinler için işlenmemiş serum örneğinin MS spektrumları göstermektedir ~ 70,000 Da sırasıyla . Bu spektrası gibi Albumin. Şekil 2C, d gibi (HMW) proteinleri MAS L121 tarafından fraksiyonasyon sonrasında serum örneğinin MS spektrumları tasvir nedeniyle ayrıca iyonize, yüksek miktarda, yüksek moleküler ağırlıktaki varlığı LMW bölgede sinyal bastırılması göstermek (gözenek boyutu, 6 nm). Büyük moleküllerin çoğunda LMW bileşenleri önemli bir zenginleşmesi ile sonuçlanır, seyreltilmiş edilmiştir. Kontrol olarak, aynı serum örneği LMWP kurtarma için MPS ince filmlerin özgüllüğü değerlendirmek için bir gözeneksiz saf silika yüzey üzerine uygulanmıştır. Şekil 2E ve f de görülebileceği gibi, pep arasında anlamlı bir hasat yoktugözeneksiz silis gelgitler ya da proteinler. Böylece onu mezogözenekli mimarisi değil LMWP zenginleşmesine de baskın faktörü oluşturmaktadır silika yüzey yakınlığı olduğu söylenebilir.

Gözenek büyüklüğü hassas bir şekilde kontrol varyasyonlar hidrofobik blok uzunlukları farklı olan kopolimerleri kullanımı ile elde edilebilir. Tasarlanan proteinler ve peptitler karışımı kullanılarak, LMW peptid ve protein geri kazanım etkinliği üzerindeki gözenek boyutu etkisini MPS farklı hacim oranları ile dört Pluronic sürfaktanlar (127, P123, L121 ve L121 artı şişme ajanı) hazırlanmıştır ince filmler kullanılarak araştırıldı hidrofilik ve hidrofobik bileşenlerin sırasıyla gözenek 3,7 nm boyutları, 5,2 nm, 7,4 nm, ve 9,0 nm oluşturur. Gözenek boyutları bu aralığı boyutu ve şekli dışlama (Şekil 3) ile peptitler ve aynı serum örneğinden protein farklı bir repertuar düzelmeye neden oldu. Yüksek moleküler ağırlıktaki d az protein spektrumlarıçipin her tür kesme moleküler emonstrate. HMW proteinlerin boyutuna bağlı tükenmesi ek olarak, standart çözeltisinin çip fraksiyonasyon bir diferansiyel ve gözenek boyutları ile ilgili LMW türlerinin selektif zenginleştirme gösterir. Şekil 3b, sunulan iki yönlü bir hiyerarşik kümeleme farklı MSC ile elde LMW standartları zenginleştirme modelini gösterir. Tüm peptidler fiş kesme moleküler altında olsa bile, gözenek boyutları ve sıkışmış türlerin moleküler ağırlığı arasında pozitif bir korelasyon vardır. Küçük peptitler küçük gözeneklere sahip yongalar daha verimli kurtarıldı ederken geniş gözenekler, en fazla 9 nm ile MSC tercihen, büyük peptidler hasat. Gözenekli düzenlemenin yapısal dönüşüm şablon polimer konsantrasyonuna ayarlayarak gerçekleştirildi. Şablon polimer konsantrasyonu artan fazlar arasında azaltılmış bir ara yüzey eğrilik sonuçlanmıştırsu, kopolimeri, ve silikat, dolayısıyla bir silindirik yapı için bir dairesel gelen birbiriyle ilerlemesini başlatılması. of Pluronic 127, yüksek moleküler ağırlığa sahip, yapısal periyodu, bu yüksek derecesine sahiptir. Çözüm başlayarak F 127 konsantrasyonunu artırarak, farklı MPS ince film periyodik nanoyapıların 2D nanoyapı 3D nanoyapı elde edilebilir. 3D küp ve altıgen petek Nano, daha fazla arzu edilen nano-gözeneklere birleştiricisi ve daha erişilebilir nano-gözeneklere morfolojisi sahip, benzer gözenek boyutu dağılımları ve serum için kesme aynı moleküler paylaşmak rağmen, seçici 2D altıgen yapıdan daha LMW peptitler zenginleştirerek üstün bir performans sergileyen fraksiyonlama (Şekil 4). Çip yüzeyine önceden işleme küllemeye oksijen plazma tanıtarak MPS yongaları üzerinde organo-silan biz de aerodinamik konjugasyon. Niteliksel seçin üzerine elektrostatik etkilerini incelemek amacıylaive çip üzerinde zenginleştirme, biz protein ve peptidlerin karışımı kullanabilirsiniz. L121 ile hazırlanan MAS yongaları fraksiyonlara ve kimyasal fonksiyonel gruplar ile konjuge proteomik standartları çözeltisi MS analizi, Şekil 5'te gösterilmektedir. Pozitif yüklü ve negatif yüklü peptit ve LMW proteinler sırasıyla anyonik ve katyonik cips yakalanır. Net pozitif şarj ile peptitler kurtarma birden fazla MPS cips kantitatif karşılaştırılması Şekil 5a görüntülenir. Herhangi bir değişiklik (başlangıçta küçük bir negatif elektrik yüklü) olmadan negatif yükü ve cips ile cips APTES (-NH ₂₎ ile modifiye yongaları daha bu peptidler için daha yüksek zenginleştirme sergilerler. Şekil 5b gösterildiği gibi tersine, pozitif yüklü MPS cips, negatif net ücret olan peptidler kurtarmak için olağanüstü yeteneği sahip. Α-Endorfin önemli bir değişiklik d göstermez iken6 etrafında PI için ue.

Şekil 1. MPS cips fraksiyon ve LMW zenginleşme ilkesi. Daha geniş gözeneklere türler dışında kalırken Örnek yüzey üzerinde tespit sonra, LMW proteinler ve peptitler gözenekler içine tutsak ve yıkama aşamasında çıkarılır. Zenginleştirilmiş fraksiyonlar elüt ve MALDI ile analiz edilir.

Şekil 2. Gözenekli silis ince film çip kullanan Peptit zenginleştirme. Düşük kütle aralığı (900 10 000 Da) ve daha önce yüksek kütle aralığı (3000 için 70 000 Da) (a, b) Her iki ve gözenekli silis ince filmler (c, d) serum işleme (sonra MALDI MS profilleri L121, 6 nm). Boş gözeneksiz silis yüzeyleri (e, f) kullanıldığında moleküler geri kazanım önemli ölçüde azalır.

Şekil 3. MPS fiş Moleküler kesme ve boyutunu bağımlı zenginleştirme. Gözenek büyüklüğüne ilişkilendirerek her MPS fiş kesme özelliği moleküler gösteren MALDI spektrumları (a) Büyütülmüş görünüm. Farklı çip arasında peptid mix özellikleri (b) İki yönlü hiyerarşik kümeleme. Kırmızı, sarı renkli bir yoğunlukta nispi peptid konsantrasyonunu göstermektedir. Küçük peptitler (900-3500 Da itibaren) tercihen küçük gözeneklere sahip yongalar çıkartılmıştır ise daha büyük gözenekler, büyük peptidler (3600 den 8500 Da için) hasat geliştirilmiştir.

Şekil 4. MPS ince film ve farklı nanoyapıların seçici kurtarma Fiziksel karakterizasyonları. XRD (a, b, c), TEM (ilave a, b, c), prekürsör çözelti içinde farklı konsantrasyonda Pluronic F 127: 4,0 ×10 ^-3 M (a), 6.0 x 10 ^-3 M (b), ve 8,0 x 10 ^-2 M (c). 3D küp ve 3D altıgen F 127 proteomik yongaları (sırasıyla Cub ve Hex) üzerinde seçici peptidler kurtarma gösteren algılama yoğunluğu (d) Çubuk grafik. Farklı yapısal modifikasyonlar seçici zenginleştirme sunuyoruz.

Şekil 5. Farklı yüzey fonksiyonları ile yongaları için Charge-özel kurtarma. Fonksiyonlandırılmış yongaları üzerinde seçici yakalanan peptidlerin algılama MS yoğunluğu çubuk grafik. Bunların izoelektrik noktaya göre, peptidler pozitif veya negatif pH 7.0 'tahsil. (A) Pozitif peptidleri ((1) des-Arg1-Bradikinin, (2) Bradikinin, (3) bir madde P-amid, (4) nörotrofin, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)), özellikle negatif yüklü sur üzerinde zenginleştirilmişyüzler. (B) Negatif peptidleri ((7) Glu1-fibrinopeptide B, (8) α-endorfin, (9) ACTH (18-39), (10) insülin, (11) EGF, (12), insülin benzeri GFII) olan özellikle pozitif yüklü yüzeylere zenginleştirilmiştir.

Şekil 6. Fraksiyonlara serum On-chip istikrar. (A) LMW peptit ve proteinlerin Temsilcisi MALDI profilleri hemen serum fraksiyon (üst) sonra ya da oda sıcaklığında (altta) ve on-chip depolama 3 hafta sonra yıkandı. (B) yukarıdan aşağıya doğru: her tekrarında tespit MS zirveleri ortalama yoğunlukları lineer regresyon analizi oda sıcaklığında taze fraksiyone serum serum ve fraksiyonlara sonra 3wk MPS cips depolama için 1 çoğaltmak için karşılaştırıldı. Denklem, CV ve belirtme katsayısı (R ²⁾ gösterilir.

Discussion

Kanıt dolaşım proteom düşük molekül ağırlıklı bölge hastalığın erken tespiti için tanı biyobelirteçlerin zengin bir kaynak olduğunu monte edilir. Bu teknolojide, farklı gözenek boyutları, gözenek yapıları ve seçici peptitler ve düşük molekül ağırlıklı proteinlerin zenginleştirmek için değişiklik ile gözenekli silis cips bir dizi sundu. Protein stabilite değerlendirmek için, MAS yongaları yıkandıktan sonra kurutulur insan serumu, ile birlikte inkübe edildi ve oda sıcaklığında 3wk için muhafaza edilmiştir. Elde edilen protein / peptid desenler gibi Şekil 6b gösterdi istatistiksel analiz sonuçları ile teyit taze fraksiyone serum olanlar (Şekil 6a) ile karşılaştırılabilir. Ortalama CV ile ölçülen pik sinyallerinin değişkenliği ham serum için% 12.7 olarak ve fraksiyonlara numuneler için% 14.2 olarak tahmin edilmiştir. Marjinal bir varyasyon MALDI enstrümanın dahili değişkenliği nedeniyle olabilir ve önerilen olabileceğini on-çip ön arıtma ve depolama MS protein profilleri herhangi bir önemli değişikliğe neden olmadı. Aynı deney geçirgen olmayan silikon üzerinde gerçekleştirilen edilmiştir. Silikon yüzey üzerinde depolama sonra iyileşti kuru serum MALDI analizden önce MPS fiş fraksiyonlara oldu. Yoksul MS profili mezogözenekli yüzeyinin istikrar avantajı sağladığını göstermiştir elde edilen. Daha önce öne mekanizmaları ile benzerliği, biz nanopores içinde sıkışıp LMW türlerin proteazların boyutunu dışlaması yoluyla bozulmadan korunduğu varsayımında veya nanopores ve kapalı alanlarda kendi proteolitik aktivite sterik inhibisyonu. MPS çip tabanlı yöntem kompleks biyolojik sıvılar çalışmanın peptid ve LMW protein profili güçlü bir araç olabilir. MAS yongaları keşif tarama ve biyo için avantajlı özellikleri sağlayan, örneklerin çok sayıda eş zamanlı olarak işleme elde kadar ölçekli üretime üretimi ve izin vermek daha ucuzdurişaretleyici keşif.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetraethoxysilane	Sigma-Aldrich	131903	98%
Spin coater	Brewer Science, Inc.	Cee 200X
Plasma Asher	Nordson March	AP-600
Spectroscopic Ellipsometer	J. A. Woollam Co.	M-2000DI
MALDI-TOF	Applied Biosystems	Voyager-DE-STR
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	C8982	Matrix for MALDI-TOF
trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich	85429	Matrix for MALDI-TOF
Stir hot plate	Thermo Fisher Scientific, Inc.	11-475-30Q
CultureWell chambered coverglass	Sigma-Aldrich	GBL103350	3 mm diam. ×1 mm depth, 3-10 μL, sterile
Pluronic F 127	BASF		PEO106-PPO70-PEO106
Pluronic L121	BASF		PEO5-PPO70-PEO5
Pluronic P123	BASF		PEO20-PPO70-PEO20
Table 1. Physico-chemical properties and designed concentrations (Molecular weight and Iso-electric point) of the selected peptide and protein standards.