Summary
Uno strumento utile per analizzare gli effetti di farmaci, fattori di crescita, e / o cellule manipolate in un modello animale di riparazione della ferita viene descritta. Questa tecnica utilizza le proprietà di un alcool polivinilico (PVA) spugna per fornire e contenere il trattamento desiderato e forniscono anche una piattaforma da asportare e analizzati.
Abstract
La guarigione delle ferite è un complicato processo multistep che coinvolge molti tipi di cellule, fattori di crescita e composti 1-3. A causa di questa complessità, studi di guarigione delle ferite è più completa se effettuata nel vivo. Ci sono molti modelli in vivo disponibile a studiare la guarigione delle ferite acute, tra cui incisionale, escissionale, spazio morto e ustioni. Modelli di spazio morto sono artificiali, impianti porosi che vengono utilizzati per studiare la formazione del tessuto e gli effetti delle sostanze sulla ferita. Alcuni dei modelli comunemente usati spazio morto includono alcool polivinilico (PVA) spugne, cilindri di acciaio rete metallica, politetrafluoroetilene espanso (ePTFE) materiali, e il 1,2 Cellstick.
Ogni modello spazio morto ha i suoi limiti basate sulla composizione materiale e il suo impianto metodi. Il filo di acciaio modello maglia cilindro ha una fase di latenza di infiltrazione dopo l'impianto e richiede una quantità di tempo prima della formazione di tessuto di granulazione Begins 1. Le fasi successive di guarigione delle ferite è meglio analizzati utilizzando i 1,4 ePTFE modello. Il Cellstick è una spugna di cellulosa in un modello tubo in silicone che è tipicamente usata per studiare ferite chirurgia umana e avvolto fluido 2. La spugna PVA è limitata a studi acuti, perché inizia con il tempo per provocare una risposta da corpo estraneo che provoca una reazione a cellule giganti nell'animale 5. A differenza di altri materiali, spugne PVA sono facili da inserire e rimuovere, realizzate con materiali inerti e non biodegradabili, eppure sono morbidi abbastanza per essere sezionato per l'analisi istologica 2,5.
Nella guarigione della ferita la spugna PVA è molto utile per analizzare la formazione di tessuto di granulazione, deposizione di collagene, la composizione fluida della ferita, e gli effetti delle sostanze sul processo di guarigione 1,2,5. Oltre al suo impiego in studio di una vasta gamma di attributi di guarigione delle ferite, la spugna PVA è stato utilizzato anche in molti altri tipi di studi. Si hcome state utilizzate per indagare l'angiogenesi tumorale, la consegna della droga e la sopravvivenza delle cellule staminali e attecchimento 1,2,6,7. Con la sua alterabilità grande, una precedente utilizzazione estensiva, e risultati riproducibili, la spugna PVA è un modello ideale per molti studi 1,2.
Qui, verrà descritto l', impianto preparazione e il recupero di PVA dischi spugna (Figura 1) in un modello murino di guarigione delle ferite.
Protocol
1. Sponge Preparazione
- Spugne idrato di agitazione per una notte a 0,9% (w / v) soluzione acquosa di cloruro di sodio.
- Sterilizzare in autoclave spugne idratati loro. Per 75 mL, autoclave per 25 minuti a 121 ° C.
Nota: spugne caricamento con un trattamento come descritto di seguito è opzionale.
- In una cappa sterile con strumenti sterili, prendere una spugna dalla soluzione utilizzando una pinzetta. Comprimere la spugna con le pinzette e usare una punta vuoto per rimuovere la soluzione più possibile dalla spugna. Posizionare la spugna ben strizzato in un piatto di coltura tissutale, facendo attenzione a lasciare uno spazio tra le spugne. Più pozzetti può essere utilizzato per separare diversi trattamenti.
- Pipettare la soluzione di trattamento direttamente sul centro di una spugna. Premere delicatamente la spugna con la punta della pipetta dopo la soluzione è stata posta sulla spugna, questo aiuta la spugna assorbire la soluzione. Nota: Il 6 millimetridiametro da 2,75 mm di spessore spugne che impieghiamo in grado di contenere un massimo di 25 pl.
- Una volta che tutte le spugne sono stati caricati, la piastra sono in possono essere conservati in ghiaccio fino a che vengono impiantati nel topo.
2. Procedura chirurgica
- Opportunamente anestetizzare animali e amministrare pre-emptive analgesico. L'intera procedura durerà circa 20 minuti per ogni animale. Per un mouse 30 g di 1,5 litri al minuto di ossigeno con il 1,5% isoflurano viene usato per indurre e mantenere l'anestesia. Quando animale non è più sensibile alla prova reflex pinch, posto in cono in posizione supina. Utilizzare un rasoio elettrico per radere uno da 1 pollice da 1 pollice area sul lato inferiore ventrale sotto la gabbia toracica. Pulire taglio di capelli.
- Sterilizzare l'area rasata pulendo con Betadine seguita dal 70% di alcol. Ripetere questa betadine-alcol pulizia tre volte.
- Tenendo la pelle ha insegnato, usare il bisturi per fare una incisione verticale 1,5-2 volte il diametrometro delle spugne da inserire, essendo attenzione a non tagliare attraverso la cavità del corpo.
- Utilizzare una pinzetta per tenere il bordo della pelle e lentamente cominciato a separare la pelle dal muscolo su entrambi i lati dell'incisione usando forbici Metzembaum. La tasca dovrebbe attraversare la larghezza del mouse e la gabbia toracica alle gambe posteriori.
- Utilizzare una pinzetta per raccogliere la spugna primo essere messi in animali da pizzicandola dai lati. Trasferire la spugna ad una pinzetta rettilinei in modo che si svolge dalla parte superiore e inferiore.
- Utilizzare pinzette per tenere il bordo della pelle e sollevare in modo che la spugna può essere inserito. Inserire lentamente la spugna cercando di evitare di toccare la pelle o sotto il muscolo, come la spugna sarà difficile muoversi una volta che ha toccato i tessuti. Ripetere l'operazione per tutte le spugne.
- Una volta che tutte le spugne sono state inserite, posto due o tre suture per chiudere l'incisione. Utilizzare un paio di pinzette per tenere entrambi i lati della incisione insieme e infilare il Suturi attraverso entrambi gli strati di pelle. Stringere il primo tiro quel tanto che basta per chiudere i bordi cutanei. Termina il nodo quadrato con un altro tiro dalla direzione opposta, questa volta tirando il nodo stretto. Poi legare due nodi più quadrati per terminare la sutura (figura 2). Porre suture supplementari per chiudere l'incisione intero. Altri metodi di incollaggio della ferita può essere utilizzato come dermabond, clip ferita, o graffette.
- Rimuovere animale dal sistema per anestesia e controllare, mentre la coscienza è ripreso. Animal dovrebbe iniziare rapidamente deambulazione e tornare al pre-op mobilità. Assicurarsi che siano in grado di raggiungere sufficiente cibo e acqua. Alcuni alimenti inumidito può essere collocato sul fondo della gabbia contribuire al recupero. Continuare a monitorare giorno per animale segni di sofferenza o disagio, e controllare il sito di incisione per l'infezione, infiammazione e deiscenza. Prendere misure adeguate se eventuali complicazioni al recupero si trovano.
3. Iniezione opzionale
- Per iniettare la spugna con una soluzione desiderata, prima di determinare la quantità di sostanza da somministrare il mouse. La sostanza deve essere concentrata in modo che il volume di iniezione è inferiore alla metà del volume totale della spugna può contenere.
- Preparare una siringa per l'iniezione (per i topi che usiamo un 28 ago G).
- Posizionare l'animale a ricevere le iniezioni in anestesia.
- Quando l'animale non risponde più alla prova pinch l'iniezione può essere dato.
- Per dare l'iniezione spingere l'ago con un angolo di 45 ° completa la cute al centro della spugna. Poi spingere l'ago nella spugna solo andando a metà stradaattraverso il suo spessore. L'obiettivo è quello di iniettare nel centro esatto della spugna.
- Per verificare che l'ago è in spugna, sollevare lentamente l'ago verticalmente. Se l'ago è in spugna, la spugna deve spostarsi con l'ago.
- Iniettare lentamente nella spugna e rimuovere l'ago. Se ci sono spugne multiple che richiedono iniezioni è possibile che parte del fluido iniettato fuoriuscirà dei precedenti siti di iniezione.
4. Sponge rimozione
Nota: Durante la rimozione spugna, gestire la spugna con estrema cautela. Evitare di penetrare la spugna con gli strumenti chirurgici e prevenire il sanguinamento eccessivo nella spugna evitando le arterie più importanti di tutto il tessuto circostante.
- Dopo che l'animale è eutanasia, rimuovere la spugna tenendo la pelle con una pinzetta e fare un'incisione chiudere la spugna.
- Separare con attenzione le spugne dalla capsula che circonda un nd evitare la raccolta tessuto aggiuntivo che circonda la spugna. Per i saggi, quali la somministrazione di farmaci o di morfometria, meno precisione è necessaria per escissione.
5. Risultati rappresentativi
Spugne rimossi possono essere immagazzinati in condizioni diverse a seconda del tipo di analisi che verrà effettuata. Per sezionamento, le spugne recuperati possono essere incorporati in un mezzo per congelamento come temperatura di taglio ottimale (OCT) composto o collocato in formalina al 10% per l'incorporamento e sezionamento in blocchi di paraffina (Figura 3A e B). I migliori risultati si ottengono quando il sezionamento la spugna viene tagliato a metà lungo il diametro e incorporato tagliare superficie basso (Figura 4A e B). Sezioni della spugna deve essere presa in modo che intera larghezza della spugna è presente. Figura 3A mostra due spugne, la spugna sinistra è stato incorporato / sezionato in modo errato e la spugna destra è stato elaborato correttamente.
ent "> Per l'analisi, spugne può essere collocato in un tubo Eppendorf e conservati a -20 ° C fino al momento per l'elaborazione Per RNA e quantitativa in tempo reale spugne analisi PCR deve essere collocato in un tubo Eppendorf, istantaneamente congelati e conservati a. - 80 ° C. Inoltre, un conservante RNA, come RNAlater da QIAGEN, può essere usato per stabilizzare l'RNA per uno stoccaggio sicuro alle alte temperature. fluido della ferita può essere raccolti premendo le spugne su un tubo, e mettendo in comune il fluido dal spugne multiplo per ottenere un campione rappresentativo. cellule vive, quali fibroblasti, macrofagi e linfociti, possono anche essere estratto dalle spugne. Dopo la rimozione dall'animale, spugne può essere posto in un mezzo appropriate per il tipo desiderato di cellule. spugne possono essere trattati per liberare le cellule fisiche (cioè camminando) o enzimatica (ad esempio collagenasi) metodi.
Figura 1. DisidratazioneTed PVA dischi di pan di Spagna in tre diverse dimensioni.
Figura 2. Immagine del mouse guarigione delle ferite modello che mostra la posizione della ferita laterale e quattro spugne PVA.
Figura 3. (A) H & E colorazione a 4x e (B) colorazione tricromica a 10x di spugne paraffina sezionati embedded.
Figura 4. (A) Immagine di taglio spugna a metà lungo il diametro. (B) PVA mezzo spugna, incorporato la parte tagliata verso il basso in ottobre
Discussion
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il finanziamento fornito dal National Institutes of Health (NIH) per R01-HL088424; Veterans merito affari premio a PPY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
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