Summary
Een handig hulpmiddel om de effecten van drugs, groeifactoren, en / of gemanipuleerde cellen in een diermodel van wondheling te analyseren wordt beschreven. Deze techniek maakt gebruik van de eigenschappen van een polyvinyl alcohol (PVA) spons leveren en bevatten de gewenste behandeling en een platform worden uitgesneden en geanalyseerd voorzien.
Abstract
Wondgenezing is een ingewikkeld, complex proces waarbij veel soorten cellen, groeifactoren en verbindingen 1-3. Vanwege deze complexiteit, wondgenezing studies zijn meest uitgebreide wanneer die wordt uitgevoerd in vivo. Er zijn vele in vivo modellen beschikbaar voor acute wondheling, met inbegrip van incisie, excisional, dode ruimte te bestuderen, en brandwonden. Dode ruimte modellen kunstmatig poreuze implantaten die gebruikt worden om weefselvorming en de effecten van stoffen op de wond te bestuderen. Sommige van de gebruikte dode ruimte modellen zijn voorzien van polyvinyl alcohol (PVA) sponzen, staal gaas cilinders, uitgebreid polytetrafluorethyleen (ePTFE) materiaal, en de Cellstick 1,2.
Elke dode ruimte model heeft zijn eigen beperkingen op basis van samenstelling van het materiaal en de implantatie methoden. De stalen gaas cilinder model heeft een lag-fase van infiltratie na implantatie en vereist een lange tijd voordat de vorming van granulatieweefsel Begins 1. Latere stadia van de wondgenezing kunnen het best worden geanalyseerd met behulp van de ePTFE model 1,4. De Cellstick een spons in een siliconenslang model die gewoonlijk wordt gebruikt voor het bestuderen menselijke operatie wonden wondvocht 2. De PVA spons is beperkt tot acute onderzoeken, omdat na verloop van tijd begint het te leiden tot een vreemd lichaam reactie die een reus cel reactie in het dier 5 veroorzaakt. In tegenstelling tot andere materialen, PVA sponzen zijn gemakkelijk te plaatsen en verwijderen, gemaakt van inert en niet-biologisch afbreekbare materialen en toch zijn zacht genoeg om coupes voor histologische analyse 2,5.
In wond genezen van de PVA spons is zeer nuttig voor het analyseren van de vorming van granulatieweefsel, collageen, wondvocht samenstelling, en de effecten van stoffen op het genezingsproces 1,2,5. In aanvulling op het gebruik ervan in het bestuderen van een breed scala aan attributen van wondgenezing, heeft de PVA spons ook gebruikt in vele andere soorten studies. Het hzoals ook is gebruikt om tumor angiogenese, drug delivery en stamcellen te overleven en innesteling 1,2,6,7 te onderzoeken. Met zijn grote veranderlijkheid, voorafgaand intensief gebruik, en reproduceerbare resultaten, de PVA spons is een ideaal model voor vele studies 1,2.
Hier beschrijven we de voorbereiding, de implantatie en het ophalen van PVA spons schijven (figuur 1) in een muismodel van de wondheling.
Protocol
1. Sponge Voorbereiding
- Hydraat sponzen door overnacht roeren in 0,9% (w / v) waterige natriumchlorideoplossing.
- Steriliseer gehydrateerd sponzen in autoclaaf hen. Voor 75 ml autoclaaf gedurende 25 minuten bij 121 ° C.
Opmerking: laden sponzen een behandeling zoals hierna beschreven is optioneel.
- In een steriele kap met steriele instrumenten, pak een spons uit de oplossing met behulp van een pincet. Druk de spons de pincet met een stofzuiger tip zoveel oplossing te verwijderen mogelijk uit de spons. Plaats de uitgewrongen spons in een weefselkweek schotel, en voorzichtig om ruimte te laten tussen de sponzen. Meerdere putjes kan worden gebruikt om verschillende behandelingen scheiden.
- Pipetteer de behandelingsoplossing direct op het midden van een spons. Druk zachtjes op de spons met de pipetpunt nadat de oplossing is op de spons, dit helpt de spons absorberen de oplossing. Opmerking: De 6mmdiameter van 2,75 mm dik sponzen we gebruiken kunnen maximaal 25 pi te houden.
- Zodra alle sponzen geladen, kan de plaat zijn in opgeslagen op ijs tot zij geïmplanteerd in de muis.
2. Chirurgische procedure
- Adequaat verdoven van dieren en het beheer van pre-emptive analgeticum. De gehele procedure duurt ongeveer 20 minuten per dier. Voor een 30 g muis 1,5 liter per minuut zuurstof met 1,5% isofluraan wordt gebruikt voor het opwekken en onderhouden van anesthesie. Bij het dier is niet meer reageren op de pinch reflex test, plaats in de neus in rugligging. Gebruik een elektrisch scheerapparaat in een 1 inch scheren met 1 inch gebied op de onderste ventrale zijde onder de ribbenkast. Schoonmaken van de snede haar.
- Steriliseer het geschoren gebied door het schoonmaken met betadine, gevolgd door 70% alcohol. Herhaal deze betadine-alcohol reiniging drie keer.
- Houd de huid geleerd, gebruik dan de scalpel om een verticale insnijding te maken 1,5-2 maal de diameter van de sponzen in te voegen, die voorzichtig niet om dwars door de lichaamsholte.
- Gebruik pincet de rand van de huid bezit en langzaam te beginnen scheiden de huid van de spier aan weerszijden van de insnijding met Metzembaum schaar. De zak moet gaan over de breedte van de muis en van de ribbenkast aan de achterpoten.
- Gebruik een pincet op te halen de eerste spons te worden geplaatst in het dier door te knijpen, vanaf de zijkanten. Breng de spons een rechte pincet zodat deze plaats van de boven-en onderkant.
- Pincet de rand van de huid bezit en zodanig optillen de spons kan worden. Langzaam steek de spons uit te kijken voor het aanraken van de huid of de spier onder de spons zal moeilijk zijn om te bewegen als het eenmaal heeft geraakt weefsel. Herhaal dit voor alle sponzen.
- Nadat alle sponsen zijn geplaatst, twee of drie hechtingen plaats van de snede te sluiten. Gebruik van een pincet bij elkaar te houden aan weerszijden van de insnijding en Sutu rijgenopnieuw door beide lagen van de huid. Draai de eerste worp net genoeg om de huid randen te sluiten. Maak de platte knoop met een meer afstand van de andere kant, deze keer trekken de knoop strak. Dan bind twee vierkante knopen van de hechting (figuur 2) af te maken. Plaats extra hechtingen om de hele incisie te sluiten. Andere wond hechten methoden worden gebruikt, zoals dermabond, wond clips, of nietjes.
- Verwijder dier uit de anesthesie-systeem en controleren terwijl het bewustzijn wordt hervat. Animal moet snel beginnen ambulating en terug te keren naar pre-op mobiliteit. Zorg ervoor dat zij in staat zijn voldoende voedsel en water te bereiken. Sommige bevochtigd voedsel kunnen worden geplaatst in de bodem van de kooi te helpen bij herstel. Blijf dagelijks te controleren dier voor tekenen van angst of ongemak, en controleer de incisie site voor infectie, ontsteking en openspringen. Neemt passende maatregelen als eventuele complicaties naar herstel gevonden.
3. Optioneel Injectie
- Om de spons injecteren met een gewenste oplossing, eerst de hoeveelheid stof te dienen de muis. De stof moet worden geconcentreerd, zodat de injectie is lager dan de helft van het totale volume van de spons kan bevatten.
- Maak een spuit voor de injectie (voor muizen gebruiken we een 28 G naald).
- Plaats het dier aan de injecties ontvangen onder narcose.
- Wanneer de dieren niet meer reageert op de knijptest de injectie worden gegeven.
- Om de injectie duw de naald in een hoek van 45 ° grondig de huid in het midden van de spons. Duw de naald in de spons alleen maar halverwegedoor de dikte. Het doel is om te injecteren in het exacte midden van de spons.
- Om te controleren om er zeker van de naald in de spons, langzaam verticaal omhoog de naald. Als de naald in de spons, moet de spons omhoog te gaan met de naald.
- Langzaam injecteren in de spons en verwijder de naald. Als er meerdere sponzen die injecties is het mogelijk dat sommige geïnjecteerde vloeistof worden geduwd van de voorgaande injectieplaatsen.
4. Spons verwijderen
Let op: Tijdens de spons verwijderen, de spons te behandelen met extra voorzichtigheid. Vermijd het penetreren van de spons met de chirurgische instrumenten en het voorkomen van overmatig bloeden in de spons door het vermijden van de grote slagaders rond het omliggende weefsel.
- Nadat het dier is ingeslapen, verwijder dan de spons door die de huid met een pincet en het maken van een incisie te sluiten van de spons.
- Haal voorzichtig de sponzen uit de omliggende capsule per nd te voorkomen oogsten extra weefsel rond de spons. Voor assays zoals drug delivery of morfometrie, is minder nauwkeurigheid vereist voor excisie.
5. Representatieve resultaten
Verwijderd sponzen kan worden opgeslagen onder verschillende voorwaarden afhankelijk van het type van analyse wordt uitgevoerd. Voor het snijden, kan de opgehaalde sponzen worden ingebed in een medium voor het invriezen, zoals Optimale Cutting Temperatuur (LGO) verbinding of geplaatst in 10% formaline voor het inbedden en snijden in paraffine blokken (figuur 3A en B). De beste resultaten voor het snijden worden verkregen wanneer de spons wordt gehalveerd over de diameter en ingebedde snijvlak omlaag (Figuur 4A en B). Delen van de spons worden genomen die gehele breedte van de spons aanwezig is. Figuur 3A toont twee sponzen werd de linker spons ingesloten / doorgesneden onjuist en rechts spons correct verwerkt.
ent "> Voor analyse sponzen worden geplaatst in een Eppendorf buis en opgeslagen bij -20 ° C tot gereed voor verwerking RNA en kwantitatieve real time PCR analyse sponzen worden geplaatst in een Eppendorf buis flash ingevroren en bij. - 80 ° C. Daarnaast kan een RNA conserveermiddel, zoals RNAlater van QIAGEN worden gebruikt om de RNA veilige opslag stabiel bij hogere temperaturen. wondvocht worden opgehaald door knijpen sponzen via een buis, en bundelen van de vloeistof uit meerdere sponzen een representatief monster. Levende cellen zoals fibroblasten, macrofagen en lymfocyten, ook worden uit de spons. Na verwijdering van het dier, sponzen plaats in een geschikt medium voor het gewenste type van de cellen. sponzen worden verwerkt om de cellen vrij te maken door fysieke (dat wil zeggen hakken) of enzymatische (dat wil zeggen collagenase) methoden.
Figuur 1. UitdrogingTed PVA spons schijven in drie verschillende maten.
Figuur 2. Afbeelding van de muis wondgenezing model dat positie van de laterale wond en vier PVA sponzen.
Figuur 3. (A) H & E kleuring op 4x en (B) trichroom vlekken op 10x de doorsnede in paraffine ingebedde sponzen.
Figuur 4. (A) Afbeelding van spons gesneden in de helft langs de diameter. (B) PVA spons half, ingebed gesneden kant naar beneden in oktober
Discussion
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering verstrekt door National Institutes of Health (NIH) subsidie R01-HL088424; Veterans Affairs Merit Award voor PPY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
- Efron, D. T., Barbul, A. Subcutaneous sponge models. Methods Mol. Med. 78, 83-93 (2003).
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair. 8, 83-96 (2000).
- Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).
- Alaish, S. M. Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings. Wound Repair. 3, 292-298 (1995).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).
- Alfaro, M. P. sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair. J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).
- Andrade, S. P., Ferreira, M. A. The sponge implant model of angiogenesis. Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).
- Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. A subcutaneous implant for wound healing studies in humans. J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).
- Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. A novel method of studying wound healing. J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
