Summary
光谱核型分析（天空）是一种先进的细胞遗传学技术，以确定基因和染色体畸变。这种技术利用染色体涂染探针，这让所有染色体的分类。天空也可以识别复杂的染色体畸变，在小鼠和人类的各种疾病，包括多囊肾和种族隔离的缺陷。
Abstract
常规的方法来识别和分类 ，个别染色体取决于每个染色体的模式，在一个特定的物种正在分析1，2独特的带。然而，这种古典的带技术，是不可靠的识别复杂的，如那些与癌症相关的染色体畸变。为了克服带技术的局限性，光谱核型分析（SKY）介绍，提供许多染色体异常可靠的信息。
天空是多色荧光原位杂交（FISH）技术检测与中期染色体光谱显微镜3，4。天空已被证明是一个有价值的工具为一个范围广泛，大量的遗传性疾病和恶性肿瘤的5，6相关的染色体异常的细胞遗传学分析。天空涉及使用多色荧光标记的DNA探针准备从退化寡通过PCR otide引物。因此，每一个染色体有独特的光谱颜色后原位杂交探针，这些差异标记了荧光染料的混合物（罗丹明，得克萨斯红，Cy5标记，FITC标记和Cy5.5）。漫天的探头由55号染色体特异性探针7-10。
漫天的过程涉及几个步骤（ 图1）。天空要求高的有丝分裂指数从正常或病变的组织或血液细胞的可用性。从一个新鲜分离的原代细胞或细胞系单细胞的染色体玻片上传播。不同组合的每个染色体的特定荧光染料标记染色体蔓延。探头检测和图像采集，光谱成像系统由Sagnac干涉仪和CCD相机。这使得从样品发出的可见光光谱测量，获得光谱图像来回米个人染色体。 HiSKY，软件，用来拍摄的图像分析结果提供了一个易于识别的染色体异常。最终的结果是一个中期和核型分类的图像，每对染色体中有不同的颜色（ 图2）。这使得容易识别染色体的身份和易位。有关详细信息，请访问应用光谱成像网站（ http://www.spectral-imaging.com/ ）。
天空最近被用于鉴定染色体分离的缺陷和染色体异常在人类和小鼠的常染色体显性多囊肾病（多囊肾），一种遗传性疾病，特点是在初级纤毛功能障碍11-13。使用这种技术，我们证明了染色体分离异常和染色体缺陷的存在，在多囊肾患者和小鼠模型14。进一步分析使用的SKY不仅让我们能够找出染色体数目和身份，但也准确地检测出非常复杂的染色体畸变，如染色体缺失和易位（ 图2）。
Protocol
1。细胞预处理和中期准备
- 杜尔贝科的修改鹰的5％CO 2培养箱中10-15％的胎牛血清（FBS），1％青霉素/链霉素在37°C间（DMEM培养基）中的细胞生长，直到他们达到70-80％汇合。
- 治疗细胞秋水仙胺溶液与0.05微克/毫升30-60分钟。
- 任何浮动细胞中含有50毫升无菌猎鹰离心管收集介质。板sterile1X-PBS漂洗细胞。后用无菌胰蛋白酶孵育1-2分钟，收获和收集到同一管内的剩余细胞。
- 1000 5分钟的转速旋转管，吸上清液留下0.5毫升，松开球，只用手指轻弹。
- 根据颗粒大小，添加0.56％氯化钾DH 2低渗溶液5-10毫升，并在37°C孵育30-45分钟的暂停。
- 添加一滴甲醇/醋酸（3:1体积/体积）每毫升低渗细胞悬液，轻轻颠倒混合管。
- 在1200 rpm离心5分钟，收集沉淀步骤1.4，然后加入新鲜甲醇/醋酸（3:1体积/体积）固定液滴加5毫升，而轻弹颗粒continously。这个过程是关键，使中期利差不会被困在细胞的团块，这将危及实验。
- 再次离心5分钟1200转，加5-10毫升的冰冷的甲醇/沿管壁醋酸固定液。在这个阶段，如果需要的话，这些细胞可以被保存在固定液收紧和短期或-80密封管在-20℃°C下长期（年）以供将来使用。
- 无水乙醇清洁的幻灯片，然后浸在DH 2Ø为approximately10X的幻灯片，以形成滑动面水鞘。放置在玻璃板上和下降15-20μL细胞悬液的幻灯片（从1.8步放置在水浴在65-70°C间），10“以上的幻灯片。幻灯片为1-2分钟，晾干。
- 干目标确保有中期染色体和利差是均匀分布的10X和40X光显微镜下检查的幻灯片。检查细胞质染色体周围存在。如果细胞质目前进行幻灯片预处理（胃蛋白酶消化），如果没有细胞质和染色体有良好的形态，那么就没有幻灯片预处理的需要。
2。幻灯片预处理（胃蛋白酶处理）
- 适用于120μL1:200酶溶液溶解到24毫米×60毫米显微镜盖玻片2X-SSC（20毫克/毫升）和中期反转滑面的玻璃罩上，然后轻轻地翻转中期滑面和孵育37°C为45分钟。
- 小心地取出不刮伤幻灯片的玻璃罩和2X-SSC缓冲液洗在coplin壶每5分钟15分钟用颤抖的。
- 5-15μl蛋白酶库存解决方案的（DH 2 100毫克/毫升）加入到一个干净的烧杯中，然后加入100毫升预热（37℃）0.01M盐酸重要的是，胃被添加到一个干净的第一，不直接将盐酸溶液的烧杯中，否则它不会溶解在溶液中。孵育在coplin罐子含有盐酸/胃蛋白酶溶液，在37的幻灯片°C为3-5分钟。这一步是非常关键的太多消化会导致染色体overdigested太少消化细胞质将离开，未消化这可能会导致非特异性探针结合杂交信号的干扰。
- 在coplin含5分钟，在室温下两次一罐100毫升1X-PBS洗幻灯片。
- 洗的幻灯片，在coplin jar文件包含在室温下（1M MgCl 2的 50毫升，950毫升的1X-PBS）5分钟100毫升1X-PBS/MgCl 2。
- 将在coplin罐子containin的幻灯片G 100毫升1％甲醛在室温（1X-PBS/MgCl 2 100毫升1.7毫升37％的甲醛）为10分钟。
- 在coplin含5分钟一罐100毫升1X-PBS洗幻灯片。
- 使用干40X镜头，以确保正常消化和幻灯片没有细胞质和染色体形态保留的光显微镜下观察的幻灯片。选择一个面积为杂交用金刚石笔。
3。染色体和探针变性和杂交
- 准备新鲜变性溶液（70％formamide/2X SSC，pH值7.0）和prewarm至70-80°C间，在coplin的jar包含在70水浴中变性的解决方案的coplin罐子放在水浴中放置在幻灯片°小鼠染色体和80 C度为30年代的1.5分钟的人类染色体。
- 立即放置在冰冷的70％乙醇，80％的3分和100％的乙醇和空气干燥3分钟的幻灯片。检查幻灯片染色体的形态。好记黑暗染色体，而不是“相轻”或晕染色体染色体的形态。
- 温暖的SkyPaint探头（天空油漆盒小瓶＃1）在37°C振荡20分钟，旋涡和离心机在1000 rpm短暂的几秒钟。
- 在两个步骤的周期为5分钟周期由37℃60分钟允许为preannealing的标记的DNA探针在85°C编程1热循环变性探针。
- 10μL的变性探针应用到杂交和覆盖面积为22毫米×40毫米的玻璃罩确保不捕获的气泡。在37°C密封玻璃罩边缘用橡皮泥，在湿盒孵育48-72小时。
4。荧光探针检测
- 卸下玻璃罩仔细放置在一个coplin包含JAR的幻灯片预热（45℃）洗涤液（新鲜配制的50％2X SSC的甲酰胺）。洗5分钟45三次°C的振动水浴在45转
- 洗洗涤解决方案II（1X SSC）在45°C 5分钟两次用颤抖的幻灯片。
- 解决方案三（4X SSC/0.1％吐温20）洗5分钟，45℃振荡Ç洗的幻灯片。
- 阻断剂适用于80μL（天空油漆盒＃2小瓶），放置在37°C盖玻片孵育30分钟。
- 删除幻灯片，让液体排出。适用于80μLCy5的染色试剂（浓缩抗体检测的CAD套件＃3小瓶）在37°C，适用于玻璃罩和孵育40分钟。
- 洗洗涤溶液在45℃5分钟，用颤抖的第三三次幻灯片。
- 适用于80μLCy5.5染色试剂（浓缩抗体检测的CAD套件＃4小瓶），放置在37°C玻璃罩和孵育40分钟。
- 洗洗涤溶液在45℃5分钟，用颤抖的第三三次幻灯片。
- 倾斜的幻灯片，并允许液体流失。适用于20μL的DAPI的抗褪色试剂（天空油漆盒小瓶＃5），并放置一个24毫米×60毫米显微镜盖玻片。小心地取下空气泡沫可能已经形成。幻灯片可以立即成像，或保存于4°C，在不超过1周的黑暗。
5。图像采集和分析
- 通过查看中期幻灯片使用奥林巴斯显微镜配备了60X油浸没透镜，光谱立方体（定制设计的三带通滤波器），的DAPI过滤器与CCD相机Sagnac干涉仪模块，图像采集完成。
- 光谱核型进行了使用后的天空视野软件（应用光谱成像版本1.62）的用户手册。
- 染色体图像分析后，可以被看作（与特定的荧光颜色）的彩色图像，伪彩色图像（颜色分类）和倒置的DAPI图像（具体带型）。
一个完整的SKY过程通常需要一周左右的时间（ 图1）。这包括图像采集和分析提供中期细胞有充足的货源。染色体核型分析显示正常小鼠的染色体核型（40，XY）的野生型小鼠的细胞（ 图2a）。相比之下，PKD1细胞- / -小鼠（PKD的小鼠模型）显示在染色体数目和结构异常，如染色体缺失（8号染色体），易位（染色体11和19）（ 图2b），显着增加。我们还分析了从ADPKD患者的血管组织。一个简单计数染色体数目的研究表明，非多囊肾多囊肾血管样品，有23对染色体正常的数字（ 图2c）。然而，在一般情况下，我们观察到染色体分离失败，造成了46对染色体DPKD样本，而不是23对（ 图2d）。
图1。天空协议流程图。天空协议的流程图说明步骤来完成的实验，从细胞预处理和中期准备开始图像采集和分析。每一天一步一步的程序左侧大约一个星期的时间表。
图2。永生的小鼠细胞系和新鲜分离的人原代细胞的光谱核型分析。颜色和个别染色体倒置的DAPI图像显示之前的染色体排序。排序后，染色体是在“分类”表。提出了从野生型小鼠的中期蔓延）的天空图像包含染色体核型正常（40，XY）。 二） / - -鼠标显示异常染色体数目（68 40）和染色体异常，如染色体缺失（8号染色体）和染色体易位（染色体11和19）ç）天荣>从PKD1中期蔓延的天空图像从非多囊肾病人的血管组织的中期蔓延的形象，具有正常的核型（46，XX）。D）从多囊肾病人的血管组织的中期蔓延的天空图像包含的异常核型（92，XXXX的）。部分数据此前已报告和重用的许可14。
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Discussion
光谱核型分析（天空）是一种细胞遗传学技术在研究基因和染色体组成。这种技术利用染色体涂染探针，这些探针的检测通过Sagnac干涉仪获得。完整的SKY过程通常需要大约一个星期，它涉及到几个关键步骤（ 图1）。天空采用了标准的协议，这是首次由帕迪拉纳什等 3。该协议已被适应各种细胞遗传学实验室，包括我们。
在协议中的关键步骤，质量好的中期的准备是非常重要的，有一个成功的SKY分析。例如，如果染色体有太多的细胞质或如果幻灯片是太旧，图像质量可能会受到影响。作为影片剪辑中我们看到，在细胞质中的内容可以很容易地确定使用的高清晰度差干涉对比显微镜技术。此外，积极分裂细胞的可用性是漫天分析的先决条件，这可以通过与秋水仙胺治疗更长的时间或其他生长因子的细胞除了克服。天空的整体成功率在很大程度上取决于用户的技能和经验。
天空提供了染色体分析的强大和可靠的工具，包括在一个单一的染色体结构的变化。在除了蜂窝多倍体，天空提供了可能性，以研究染色体插入，删除，复制和易位。例如，天空允许新颖和隐藏的染色体畸变的鉴定和识别复杂的重排在癌症的发生和发展15。此外，天空被应用于一个研究领域内的比较细胞遗传学研究4在进化过程中的染色体重排。使用的SKY技术我们的实验室成为第一个在小鼠和人类多囊肾病（ 图2），以确定染色体异常。毫无疑问，天空将有利于在许多其他染色体相关疾病。事实上，我们建议，天空也将是有益的许多纤毛相关的发病机制，其中纤毛已被证明是调节细胞分裂14。
由于小鼠和大鼠是重要的动物模型来研究疾病的机理，并在体内进行功能评估，小鼠和大鼠的SKY分析探头的发展，已允许例行的大鼠和小鼠染色体核型。目前，天空因此仅限于在人类，大鼠和小鼠的染色体研究。然而，随着越来越多的研究实验室使用其他物种的研究基因组的组成，它是可预见的更多不同的生物体染色体涂染探针将很快市售。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢他们的技术援助，希高桥布赖恩Muntean，邵螺，和布莱尔梅尔。支持这项工作是由美国国立卫生研究院（DK080640）和托莱多和ProMedica转化研究激励奖苏里亚Nauli博士大学的奖励。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Group | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256-01 | |
| SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
| SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
| Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30236.01 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNase A | Roche Group | 10 109 169 001 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker Inc. | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega Corp. | V4261 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR international | 16004-312 | |
| Rubber cement | Elmer’s | ||
| Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
| Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Glass | ||
| Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
| DAPI filter cube | Chroma Technology Corp. | ||
| SKY filter cube | Chroma Technology Corp. | ||
| SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
| Inverted cell culture microscope | Nikon Instruments | Nikon Eclipse TS100 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | IX70 | 60X oil |
References
- Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
- Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2, 971-972 (1971).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).
- Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research. Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).
- Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms. Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).
- Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping. Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).
- Karpf, A. R., Matsui, S. Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells. Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).
- Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids. Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).
- Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer. Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).
- Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).
- AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation Research. 104, 860-869 (2009).
- Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells. Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).
- Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1. Circulation. 117, 1161-1171 (2008).
- AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation. Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).
- Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping. Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).
