Summary
צלבים מיניים ובידוד של הצאצאים רקומביננטי הם כלי מחקר חשובים פטריות פילמנטיות,
Abstract
Fusarium graminearum הפכה מערכת מודל ללימודי פיתוח של פטריות פתוגניות פילמנטיות. פ graminearum בקלות מייצר גופי פרי, המכונים גופי פרי מיניים, על אגר גזר. גופי פרי מיניים מכילים מספר רב של סוגי רקמות, המיוצר בשלבים מסוימים של פיתוח perithecium. אלה כוללים (לפי סדר הופעתם) היווצרות התיבות perithecium (המעוררים העובש ascogenous), הקיר החיצוני, paraphyses (mycelia סטרילית אשר תופסים את מרכז perithecium עד asci לפתח), asci, ואת ascospores בתוך asci 14. ההתפתחות של כל אחד רקמות אלו מופרדים על ידי כ 24 שעות, כבר בסיס של מחקרים transcriptomic במהלך התפתחות מינית 12,8. עיין Hallen et al. (2007) לתיאור מעמיק יותר של ההתפתחות, כולל תמונות של כל שלב. כאן, אנו מציגים את שיטות להפקת והקציר סינכרוניLY פיתוח מדשאות גופי פרי מיניים ללימודי הזמני של ויסות הגנים, פיתוח תהליכים פיזיולוגיים. למרות השיטות האלה נכתבים במיוחד לשימוש עם פ graminearum, טכניקות ניתן להשתמש במגוון רחב של מחלות נוספות, ובלבד הפרי יכול להיגרם בתרבות ויש כמה בתיאום לפיתוח. יש לנו להתאים לאחרונה בפרוטוקול זה כדי ללמוד את ההתפתחות המינית של פ verticillioides. אמנם גופי פרי מיניים אדם יש הרים יד על מין זה, כי הדשא של פיתוח גופי פרי מיניים לא יכול היה להיגרם, התהליך עובד היטב לחקר ופיתוח (Sikhakolli ואת שביל, לא פורסם).
התפקיד החשוב ביותר של גופי פרי פטרייתי הוא פיזור נבגים. ברבות מיני Ascomycota (נאד לייצר פטריות), נבגים נורים מתוך נאד, עקב הדור של לחץ turgor בתוך נאד, נהיגה פליטה של נבגים (נוזל epiplasmic) דרךנקבובית עצה נאד 2,7. המחקרים שלנו של הפרשות ascospore בכוח גרמו לפיתוח של "assay הפרשות נבג", שבו אנו משתמשים כדי לסנן על מוטציות בתהליך. כאן אנו מציגים את פרטי assay זה.
פ graminearum הוא homothallic, וכך יכול להיווצר גופי פרי בהיעדר בן זוג תואם. היתרון של homothallism היא כי מעבר אין צורך לייצר צאצאים הומוזיגוטים עבור תכונה מסוימת, פן כי יש להקל את לימוד התפתחות מינית מין זה 14,7. עם זאת, זנים heterothallic נוצרו, שניתן להשתמש בהם עבור המעבר 5,9. אפשר גם לחצות זנים homothallic לקבל מוטנטים של גנים מספר 1 זן 1. הדבר נעשה על ידי coinoculating 1 צלחת פטרי עם 2 זנים. יחד לנקודת המפגש, רוב גופי פרי מיניים יהיו רקומביננטי (בתנאי מוטציה באחד הזנים ההורים לא לעכבoutcrossing). הגיל גופי פרי מיניים, הם להפריש ascospores בהמוניהם במקום בכוח למלא אותם. Exudate נבג שנוצר (המכונה cirrhus) יושב בקצה perithecium והוא יכול בקלות להסיר להתאוששות של נבגים בודדים. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול כדי להקל על זיהוי רקומביננטי גופי פרי מיניים ואת ההתאוששות של הצאצאים רקומביננטי.
Protocol
1. ייצור גופי פרי מיניים
- גזר המרכז לחסן אגר 10 ב צלחת קוטר 6.0 ס"מ פטרי עם המתח הפורה של פ graminearum (המלץ PH-1).
- מקום מחוסן מנות תחת אורות הניאון הבהירים בטמפרטורת החדר (18-24 ° C) ולאפשר לגדול עד תפטיר הגיע לקצה החיצוני של צלחת פטרי (3-5 ימים). בית אורות ניאון מסחריים לעבוד בסדר עבור גירוי הגוף הפרי היווצרות השחרור.
- הוצא בעדינות עם קיסם mycelia אוויר סטרילי.
- הפץ 1.0 מ"ל 2.5% Tween 60 א.ק. אל פני השטח עם הוקי כוס סטרילית או בסופו מעוגל של מוט זכוכית סטרילית.
- חזור צלחות לאור. אל תוסיף Parafilm על צלחות.
- אחרי 24 שעות, את פני השטח של הצלחות צריך מראה מבריק. אם mycelia מופיע שוב, משטח גירוד מחדש להחיל Tween-60 הפתרון.
- שימו לב התפתחות גופי פרי מיניים במהלך השבוע הבא. שלבי הביניים שלפיתוח perithecium ניתן לקצור ידי בעדינות לגרד את פני השטח של אגר ופלאש להקפיא RNA החילוץ (איור 1).
- נבגים למבוגרים יצטברו על מכסה של צלחת ביום 7. בהתחלה אלו יהיו רק לעין תחת מיקרוסקופ לנתח, אבל מיום ליום 9, הם צברו לצפיפות מספיק כדי להיות גלוי לעין בלתי מזוינת.
2. Ascospore Assay פריקה
- ביום 6 אחרי יישום של פתרון Tween, חתכו 1 ס"מ קוטר המעגל מתוך אגר עם מקדח עץ. לחלופין, אזמל ניתן להשתמש כדי להסיר קטע בגודל דומה. המעגל יכול להיות פרוס לשניים, וכל חצי דגש על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית.
- אוריינט החלקים כך את פני השטח המכיל את גופי פרי ניצב לפני השטח של שקופית, וכן נבגים נורים לאורך בשקופית.
- מניחים את שקף בתא לחות במשך הלילה תחת אורות. נבגים יצטברו עלהשקופית ולהיות גלוי לעין בלתי מזוינת למחרת בבוקר (איור 2).
- נבגים שנצברו ניתן לשטוף שקופיות עם מים לכמת אם תרצה בכך.
- פוטנציאליים מעכבי שחרור ascospore ניתן ושם ישקלו לו ויעריכו על ידי הוספת אותם בצד האחורי של הבלוק אגר במהלך הרכבה של assay. מעכבי כמה ערוץ יון להפחית הפרשות כבר ושם ישקלו לו ויעריכו בעבר עם הטכניקה הזו 15.
3. דור של צאצאיהם רקומביננטי
- ליזום לחצות ידי יחסנו אגר גזר עם שני זנים של פ graminearum (1 + ניט ואחד ניט-), הצבת נקודות חיסון בצדדים מנוגדים של צלחת פטרי.
- לאחר העובש מילאו את פני השטח, לגרד את החלק האווירי וליישם Tween-60 הפתרון כפי שתואר לעיל. השתמש הסמן לציין בצד של צלחת פטרי שבה העובש להיפגש.
- חזור תרבויות לאור דגירה עד פיתחו גופי פרי מיניים, ו cirrhi לא להיותאקדח כדי ליצור מתוך גופי פרי מיניים יחד בצומת בין שתי התרבויות.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, להכניס להציג גופי פרי מיניים יחד בצומת של שתי התרבויות. באמצעות סיכה חרק, עיקור וטבל במים סטריליים, לגעת cirrhus לאורך הגבול הזה בקלילות עם קצה של סיכה. לחות על הפין צריך לאפשר cirrhus את להיצמד סיכה.
- יש לשטוף את קצה הפין עם cirrhus עליו מים סטריליים 200 μl בצינור Eppendorf לשטוף את הנבגים.
- סיכת להבה, ללחלח את זה שוב לקחת עוד cirrhus. פיק 10-15 cirrhi, ומקום אחד בצינור נפרד של מים.
- צינורות מערבולת בקצרה מכיל מושעה cirrhi.
- הסרה של 60 μl של השעיה נבג עם טפטפת ומניחים על המדיום MMTS 1 ב 9 ס"מ צלחת פטרי. מורחים בעזרת מקל הוקי סטרילית. ההשעיה נבג הנותרים ניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבוע replated במידת הצורך.
- Incubate בטמפרטורת החדר (אור לא הכרחי) למשך 3-5 ימים עד מושבות קטנות מאוד להופיע (איור 3). יהיו שני סוגים של פנוטיפים בין המושבות. את מתישה מושבות העובש תהיה דלילה יותר המושבות + מטומטם. Cirrhi מ רקומביננטי גופי פרי מיניים יראה את שני פנוטיפים המושבה ביחס שווה בקירוב. מחק את צלחות עם מושבות של הפנוטיפ רק אחת עליהם. שימו לב, לעיתים יותר משני פנוטיפים לגרום עקב הפרדה של גורמים אחרים.
- העבר מושבות V8 או אגר גזר לאחסון. הבדיקה מושבות על אגר DOX של Czapek (את מתישה זנים לא יגדל על DOX Czapek של) ועל מחשב כף יד עם כלורי (0.5 מ 'אשלגן כלורי, לצלילי + מטומטם לא יגדל על מחשב כף יד עם כלורי) כדי לאשר את הפנוטיפ הנכון. לבחון את המושבות עבור התכונות הרצויות.
4. נציג תוצאות
ייצור גופי פרי מיניים
המטרה היא להיות הדשא של גופי פרי מיניים ללא mycelia או נבגים לכאורה. פני השטח של התרבות יופיע דומה קטיפה שחורה (איור 1). ב 24 שעות לאחר היישום של Tween את פני השטח של אגר צריך ברק קל. אם mycelia להופיע שוב, ואז הצלחת לא יכול היה לגרד מספיק כדי לגרום להתפתחות perithecium.
Ascospore פריקה
תמיד מספקים assay שלך כמה בלוקים של אגר מהלחץ wild-type. אם אלה לא אש, אז גם גופי פרי מיניים שלך צעיר מדי, מבוגר מדי. אם הם מבוגרים מדי, אז העובש רבים יופיעו על פני השטח של תרבות ונותן לו גוון לבנבן. אם זה לא המקרה, הם עשויים להיות צעיר מדי, assay יש לנסות שוב בעוד 24 שעות. מדי פעם, תרבויות לא למלא היטב, הניסוי יהיה צורך לחזור. הקפד לבצע את assay בתנאי תאורה נאותים.
רקומביננטי הצאצאים
> גופי פרי מיניים רקומביננטי צריך לעשות את רוב גופי פרי מיניים יחד בצומת בין שני זנים. אנחנו בדרך כלל לעבד 10 cirrhi מהצלב ולפחות 4-6 של אלה צריכים להיות רקומביננטי. לעתים רחוקות, המוטציה מונעת זן מן ההזדווגות. אם אחד ההורים יש פנוטיפ צמיחה חריגה, אז יותר מ 2 פנוטיפים יכולים להיות נוכחים בין מושבות על MMTS.
באיור 1. שלבי ההתפתחות perithecium על אגר גזר. H שמאל, 72 לאחר יישום Tween. הערה פיגמנט אדום גופי פרי מיניים צעיר מאוד גלוי בתור גרעינים שחורים על פני השטח. נכון, ב 144 שעות, גופי פרי מיניים בוגרים יצרו. שים לב כמעט מלאה העדר mycelia שטחית בתרבויות הצדדים.
2. איור פריקה assay. התוספת כתום אגר גזר מכוונת כך thaנבגים טי משוחררים בכוח גופי פרי מיניים בוגרת על פני השטח שלו יכול להצטבר על פני השטח של שקופיות זכוכית. 15 שעות זמן הצטברות.
איור 3. הבדלים בין צמיחה ניט + ו מתישה מושבות על מצע MMTS סלקטיבית. את מתישה המושבות (ראשי חץ) קטנים יותר. את + מושבות מטומטם (חיצים) להראות צמיחה איתנה. התמונה צולמה לאחר 7 ימים.
Discussion
פ graminearum מותאם במיוחד ללימוד פיתוח גוף הפרי בשל הזמינות של הגנום היטב המבואר ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / : 4), ואת הזמינות של Affymetrix- מבוסס microarray 6. זו יש להקל את היכולת לזהות גנים חשובים להזרמת ascospore 7,11,3. השיטות שהוצגו כאן יאפשר החוקר להתמקד קבוצה בדידה של שלבים התפתחותיים ופונקציות לניתוח גנטי של גופי פרי של פ graminearum. השיטות גם להתאמה בקלות פטריות קשורות יכול להיגרם פירות בתרבות, והוא יכול לשמש כאמת מידה להתפתחות במגוון רחב של סוגים אחרים בגוף פטרייתיים הפרי.
היכולת להעריך את הפנוטיפ ירי נבג יכול להיות עדין מינים שבהם נבגים קטנים וקשה לראות, כגון
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם הקרן הלאומית למדע (MCB-0923794 אל רגל).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Czapek’s Dox Agar | Difco Laboratories | 233810 | |
| Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |
References
- Bowden, R. L., Leslie, J. F.
- Buller, A. H. R. Researches on Fungi. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).
- Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).
- Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization. Science. 317, 1400-1402 (2007).
- Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).
- Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta. Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).
- Hallen, H., Trail, F. The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).
- Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins. Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).
- Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae. Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi. Genetics. 118, 417-423 (1988).
- Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).
- Qi, W., Kwon, C., Trail, F. Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).
- Trail, F. Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota. FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).
- Trail, F., Common, R. Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study. Mycologia. 92, 130-138 (2000).
- Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum. Mycologica. 94, 181-189 (2002).
