Summary
الصلبان الجنسي والعزلة من ذرية المؤتلف هي أدوات هامة لبحث الفطريات الخيطية،
Abstract
لقد أصبح الفيوزاريوم graminearum نظام نموذجي للدراسات في التنمية وتسببها الفطريات الخيطية. F. graminearum معظم بسهولة وتنتج الهيئات الاثمار، ودعا perithecia، على أجار الجزرة. Perithecia تحتوي على العديد من أنواع الأنسجة، أنتج في مراحل معينة من تطور مزقاق. وتشمل هذه (بالترتيب من مظهر) تشكيل بالاحرف الاولى مزقاق (والتي تؤدي إلى خيوط ascogenous)، الجدار الخارجي، paraphyses (فطر العقيمة التي تحتل المركز من مزقاق حتى زقاق تطوير)، زقاق، وascospores لل في زقاق 14. يتم فصل التنمية في كل من هذه الأنسجة من قبل ما يقرب من 24 ساعة، وكانت أساس الدراسات transcriptomic خلال التطور الجنسي 12،8. الرجوع إلى هولن وآخرون (2007) للحصول على وصف أكثر دقة للتنمية، بما في ذلك الصور الفوتوغرافية من كل مرحلة. هنا، نقدم وسائل لتوليد وحصاد متزامنلاي من المروج النامية perithecia للدراسات الزماني للتنظيم الجينات، والتنمية، والعمليات الفيزيولوجية. على الرغم من أن تتم كتابة هذه الأساليب على وجه التحديد لاستخدامها مع ف. graminearum، يمكن استخدام التقنيات لمجموعة متنوعة من الفطريات الأخرى، بشرط أن يكون ذلك حافزا الاثمار في الثقافة، وهناك بعض التزامن في التنمية. تكيفنا مؤخرا هذا البروتوكول لدراسة التطور الجنسي من ف. verticillioides. على الرغم من أن يجب أن تكون فردية perithecia منتقاة في هذا النوع، لأنه لم يكن في الحديقة تطوير perithecia أن يتسبب فيها، وعملت العملية بشكل جيد لدراسة التنمية (Sikhakolli وتريل، غير منشورة).
أهم وظيفة من الهيئات الاثمار الفطرية هو تشتت جراثيم. في كثير من الأنواع من Ascomycota (زق انتاج الفطريات)، وأطلقوا النار جراثيم من زق، ويرجع ذلك إلى توليد ضغط تورم في زق، والقيادة طرد من الجراثيم (وسائل epiplasmic) من خلالالمسام في الطرف زق 2،7. وقد أسفرت نتائج الدراسات لدينا التفريغ بوغ زقي القسري في وضع "فحص التفريغ بوغ"، والتي نستخدمها للكشف عن الطفرات في هذه العملية. هنا نقدم تفاصيل هذا الفحص.
واو graminearum هو homothallic، وبالتالي يمكن أن تشكل الهيئات الاثمار في ظل عدم وجود شريك ملائم. ميزة تماشر هو أن المعبر ليس من الضروري لتوليد ذرية متماثلة اللواقح عن سمة خاصة، وجها التي يسرت دراسة التطور الجنسي في هذه الأنواع 14،7. ومع ذلك، فقد تم توليد سلالات heterothallic التي يمكن استخدامها لعبور 5،9. ومن الممكن أيضا لعبور سلالات homothallic للحصول على المسوخ للجينات عدة في سلالة واحدة 1. يتم ذلك عن طريق coinoculating 1 طبق بيتري مع 2 السلالات. على طول نقطة لقاء، فإن الغالبية العظمى من perithecia يكون المؤتلف (شريطة طفرة في واحدة من سلالات الأم لا تمنعالتهجين). كما سن perithecia، فإنها تحلب ascospores بشكل جماعي بدلا من تفريغ قسرا. والافرازات الناتجة بوغ (تسمى cirrhus) يجلس على طرف مزقاق ويمكن بسهولة إزالة للتعافي من جراثيم الفردية. هنا نقدم بروتوكول لتسهيل التعرف على المؤتلف perithecia واسترداد ذرية المؤتلف.
Protocol
1. إنتاج Perithecia
- مركز أجار الجزرة تطعيم 10 في طبق بيتري بقطر 6.0 سم مع سلالة خصبة من F. graminearum (رشح PH-1).
- مكان تلقيح أطباق تحت الأضواء الفلورية مشرق في درجة حرارة الغرفة (18-24 درجة مئوية) والسماح لتنمو حتى المشيجة وصلت الى الحافة الخارجية للطبق بيتري (3-5 أيام). أضواء الفلورسنت المنزلية التجارية تعمل بشكل جيد لتحفيز الاثمار تشكيل هيئة والتفريغ.
- إزالة بلطف فطر جوي مع المسواك العقيمة.
- توزيع 1.0 مل 2.5٪ توين 60 AQ إلى السطح مع hockeystick زجاجية معقمة أو نهاية مقربة من قضيب زجاجية معقمة.
- عودة لوحات للضوء. لا تضيف Parafilm إلى لوحات.
- بعد 24 ساعة، وينبغي على السطح من لوحات لها مظهر لامع. إذا فطر يظهر، سطح كشط وإعادة تطبيق توين-60 حل.
- مراقبة تطور perithecia خلال الاسبوع المقبل. في المراحل المتوسطة منيمكن حصاده مزقاق التنمية عن طريق كشط بلطف من سطح أجار وفلاش تجميد لاستخراج الحمض النووي الريبي (الشكل 1).
- وسوف تتراكم الجراثيم الناضجة على غطاء لوحة من قبل يوم واحد 7. في البداية سوف تكون هذه فقط مرئية تحت المجهر تشريح، ولكن بحلول يوم 9، أنها سوف تراكمت لكثافة كافية لكي تكون مرئية للعين المجردة.
2. بوغ زقي التفريغ الفحص
- في يوم 6 بعد تطبيق حل توين، وقطع بقطر 1 سم للخروج من دائرة أجار مع حفار الخشب. بدلا من ذلك، يمكن استخدام مشرط لإزالة قطعة مماثلة الحجم. يمكن شرائح الدائرة في كل شوط ونصف وضعها على شريحة ميكروسكوب زجاجية.
- وتطلق توجيه القطع بحيث السطح تحتوي على جثث الاثمار هو عمودي على سطح الشريحة، والجراثيم في أسفل طول الشريحة.
- ضع الشريحة في غرفة الرطوبة بين عشية وضحاها تحت الاضواء. وسوف تتراكم على جراثيمالشريحة وتكون مرئية للعين المجردة في صباح اليوم التالي (الشكل 2).
- ويمكن غسلها الجراثيم المتراكمة خارج الشريحة بالماء وكميا اذا شئت.
- يمكن أن يعاير المحتملة مثبطات التفريغ بوغ زقي عن طريق إضافتها إلى الجانب الخلفي من كتلة أجار خلال الجمعية العامة للفحص. وقد تم بعض مثبطات قناة أيون التي تقلل من إفرازات يعاير سابقا مع هذه التقنية 15.
3. جيل من نسل المؤتلف
- بدء عبور، فحقن أجار الجزرة مع اثنين من سلالات F. graminearum (واحد + الصأبة واحد أحمق)، ووضع نقاط تطعيم على طرفي نقيض من طبق بيتري.
- مرة واحدة خيوط ملأت السطح، وكشط جزء من الجو وتطبيق توين-60 حل على النحو المبين أعلاه. استخدام علامة ملاحظة على جانب طبق بيتري حيث خيوط الوفاء.
- عودة إلى ضوء الثقافات واحتضان حتى perithecia قد وضعت، ويكون قد cirrhiمسدس على شكل من perithecia على طول التقاطع بين الثقافتين.
- تحت المجهر تشريح، جلب إلى عرض perithecia على طول التقاطع من الثقافتين. باستخدام دبوس الحشرات، وتعقيمها، وانخفض إلى الماء المعقم، لمس cirrhus على طول هذه الحدود بخفة مع غيض من دبوس. ينبغي للرطوبة على دبوس السماح للcirrhus التمسك دبوس.
- شطف غيض من دبوس مع cirrhus عليها في المياه المعقمة 200 ميكروليتر في أنبوب إيبندورف لغسل قبالة جراثيم.
- الشعلة دبوس، بلل مرة أخرى واختيار آخر cirrhus. اختيار 10-15 cirrhi، ووضع كل منها في أنبوب منفصلة من الماء.
- التي تحتوي على أنابيب علقت لفترة وجيزة دوامة cirrhi.
- إزالة 60 ميكرولتر من تعليق بوغ مع ماصة والمكان في المتوسط MMTS 1 في طبق بيتري الطول 9. نشر بعصا الهوكي عقيمة. ويمكن تخزين تعليق بوغ المتبقية في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع وreplated إذا لزم الأمر.
- Incubaالشركة المصرية للاتصالات في درجة حرارة الغرفة (الضوء ليس ضروريا) لمدة 3-5 أيام حتى تظهر مستعمرات صغيرة جدا (الشكل 3). لن يكون هناك نوعين من الظواهر بين المستعمرات. وسوف المستعمرات أحمق يكون بين خيوط تناثرا من المستعمرات + الصأبة. وسوف Cirrhi من المؤتلف perithecia إظهار كل الظواهر مستعمرة في نسبة متساوية تقريبا. تجاهل لوحات مع مستعمراتها من النمط الظاهري واحد فقط عليها. لاحظ أنه في بعض الأحيان أكثر من عقدين من الظواهر ينتج بسبب الفصل بين عوامل أخرى.
- نقل المستعمرات إلى V8 أو أجار الجزرة للتخزين. المستعمرات اختبار على أجار تشابيك لدوكس (سلالات أحمق، لن تنمو في دوكس تشابيك) وعلى المساعد الشخصي الرقمي مع كلورات (0.5 M كلورات البوتاسيوم، وسلالات + الصأبة لن تنمو على المساعد الشخصي الرقمي مع كلورات) لتأكيد النمط الظاهري الصحيح. فحص هذه المستعمرات لالصفات المطلوبة.
4. ممثل النتائج
إنتاج perithecia
الهدف هو الحصول على حشيش perithecia دون أي فطر أو جراثيم واضح. وعلى سطح الثقافة تظهر مشابهة المخمل الأسود (الشكل 1). في 24 ساعة بعد تطبيق توين ينبغي على سطح أجار لها معان طفيف. إذا فطر ظهور مرة أخرى، ثم قد لا لوحة تم كشط ما يكفي للحث على تطوير مزقاق.
بوغ زقي التفريغ
تقدم دائما في فحص الخاص بك كتل من أجار من سلالة من النوع البري. إذا كان هؤلاء لا النار، ثم إما perithecia الخاص صغار جدا أو قديمة جدا. إذا كانت قديمة جدا، وبعد ذلك سوف تظهر خيوط عديدة على سطح الثقافة ويعطيها صبغة بيضاء. إذا لم تكن هذه هي الحالة، قد تكون صغيرة جدا، ويجب ان يحاكم الفحص مرة أخرى بعد 24 ساعة. في بعض الأحيان، والثقافات لا أداء جيدا، وهذه التجربة لا بد من تكرارها. تأكد من إجراء فحص تحت ظروف الإضاءة المناسبة.
المؤتلف ذرية
وينبغي> perithecia المؤتلف يشكلون الغالبية من perithecia على طول التقاطع بين سلالتين. نقوم بمعالجة عادة 10 cirrhi من كرة عرضية، وعلى الأقل 4-6 من هؤلاء ينبغي أن يكون المؤتلف. أحيانا جدا، طفرة يمنع سلالة من التزاوج. إذا كان أحد الوالدين لديه النمط الظاهري نمو شاذ، ثم قد يكون أكثر من 2 الظواهر تكون موجودة بين المستعمرات في MMTS.
الشكل 1. مراحل تطور مزقاق على أجار الجزرة. اليسار، بعد 72 ساعة من تطبيق توين. لاحظ الصباغ الأحمر وperithecia الصغار جدا مرئيا كمحرك الحبوب السوداء على السطح. الحق، في ح 144، وقد شكلت perithecia ناضجة. لاحظ غياب شبه الكامل للفطر سطحي في كل الثقافات.
مقايسة شخصية إبراء الذمة 2. وأجار الجزر البرتقالي المكونات هو المنحى حتى ثايمكن للجراثيم تي خرجوا قسرا من perithecia ناضجة على سطحه تتراكم على سطح شريحة زجاجية. 15 دوام تراكم الموارد البشرية.
الشكل 3. الاختلافات في النمو بين + الصأبة وأحمق، المستعمرات في المتوسط MMTS انتقائي. المستعمرات أحمق-(السهام) هي أصغر. و+ المستعمرات الصأبة (الأسهم) تظهر نموا قويا. صورة التقطت بعد 7 أيام.
Discussion
وبشكل خاص تكييف F. graminearum لدراسة تطوير هيئة الاثمار نظرا لتوافر من الجينوم جيدا المشروح ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / ، 4)، وتوافر وجود Affymetrix- استنادا ميكروأري 6. وقد سهلت هذه القدرة على التعرف على الجينات مهمة لتصريف بوغ زقي 7،11،3. والأساليب المقدمة هنا تسمح للباحث أن تركز على مجموعة منفصلة من مراحل النمو والوظائف من أجل التحليل الجيني الهيئات الاثمار من ف. graminearum. الطرق هي أيضا قابلة للتكيف بسهولة على الفطريات ذات الصلة التي يمكن أن يتسبب في الفاكهة في الثقافة، ويمكن استخدامها كمعيار للتنمية في مجموعة متنوعة من غيرها من أنواع الفطريات الجسم الاثمار.
يمكن أن القدرة على تقييم النمط الظاهري اطلاق بوغ يكون دقيقا في الأنواع حيث جراثيم صغيرة والصعب أن نرى، مثل
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (MCB-0923794 لFT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusarium graminearum strain PH-1 | Fungal Genetics Stock Center | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Czapek’s Dox Agar | Difco Laboratories | 233810 | |
| Potassium Chlorate | Sigma-Aldrich | 255572 |
References
- Bowden, R. L., Leslie, J. F. Sexual recombination in Gibberella zeae. Phytopathology. 89, 182-188 (1999).
- Buller, A. H. R. Researches on Fungi. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).
- Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).
- Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization. Science. 317, 1400-1402 (2007).
- Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).
- Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta. Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).
- Hallen, H., Trail, F. The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).
- Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins. Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).
- Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae. Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).
- Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi. Genetics. 118, 417-423 (1988).
- Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).
- Qi, W., Kwon, C., Trail, F. Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).
- Trail, F. Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota. FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).
- Trail, F., Common, R. Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study. Mycologia. 92, 130-138 (2000).
- Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum. Mycologica. 94, 181-189 (2002).
